TFPI-2對缺氧大鼠星形膠質(zhì)細胞生物學(xué)特性及機制的研究

程春郁 任占軍 黃丹華 劉 瑩 陳 舒 蔣麗艷

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)六科，齊齊哈爾161000)

星形膠質(zhì)細胞是哺乳動物腦組織中分布最廣的一類細胞，也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要神經(jīng)膠質(zhì)細胞之一[1]。星形膠質(zhì)細胞是整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，在發(fā)生腦缺血、血腦屏障破壞、炎癥反應(yīng)、細胞興奮毒性以及代謝失衡等過程中都有星形膠質(zhì)細胞的參與。星形膠質(zhì)細胞參與多種缺血性、缺氧性腦損傷的病理過程[2-4]。組織因子途徑抑制物-2(Tissue factor pathway inhibitor-2，TFPI-2)是一種具有K1結(jié)構(gòu)域Kunitz的絲氨酸蛋白酶抑制劑，具有抑制腫瘤細胞生長、抑制血管生成、誘導(dǎo)細胞凋亡等生物學(xué)功能，被稱為潛在的抑癌基因[5]。同時，TFPI-2還可抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP)參與腫瘤侵襲、遷移的過程[6]。TFPI-2含有CpG島，G+C含量高達77%，TFPI-2基因中CpG島甲基化可使TFPI-2發(fā)生沉默，TFPI-2基因異常表達與肝癌、結(jié)直腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[7-10]。最近研究顯示，人神經(jīng)母細胞瘤細胞經(jīng)缺氧處理后，TFPI-2的表達量顯著上調(diào)[11]。但是TFPI-2在缺氧下影響細胞的調(diào)控機制還未得到充分研究。本研究通過分離培養(yǎng)大鼠腦組織中星形膠質(zhì)細胞，在缺氧條件下刺激星形膠質(zhì)細胞，研究TFPI-2對缺氧大鼠星形膠質(zhì)細胞增殖、凋亡的影響，并對其機制進行初步的探討。

1 材料與方法

1.1材料 動物：新生2 d的SD大鼠由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院提供。試劑：DMEM培養(yǎng)基、膠原蛋白酶、胰蛋白酶為美國Sigma公司產(chǎn)品；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑為美國Invitrogen公司產(chǎn)品；L-多聚賴氨酸、MTT為美國PeproTech公司產(chǎn)品；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為北京康為公司產(chǎn)品；SYBR Green Gene Expression Assay為大連寶生物公司產(chǎn)品；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒為江蘇凱基生物公司產(chǎn)品；實驗所用引物均由上海生工合成；TFPI-2 siRNA、siRNA control為美國CST-SignalSilence公司產(chǎn)品；BCA蛋白定量試劑盒、ECL顯色液為天津博美科生物公司產(chǎn)品；TFPI-2抗體、β-catenin抗體、c-myc抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein,Bax)抗體、剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Cleaved Caspase-3)抗體、辣根過氧化物標記的二抗均為美國Abcam公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng) 分離培養(yǎng)大鼠星形膠質(zhì)細胞，在無菌條件下分離新生3 d內(nèi)的大鼠腦組織，把腦膜及血管去除以后，剪碎成約1 mm3的組織小塊，用D-Hank′s液將組織小塊清洗后，加0.25%胰蛋白酶消化后用濾網(wǎng)過濾(200目)，用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞制備成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度后種植到含多聚賴氨酸涂層的培養(yǎng)瓶中，種植密度為5×105個/ml。置于飽和濕度37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[11]。當(dāng)細胞匯合度達到90%后傳代培養(yǎng)，取第三代大鼠星形膠質(zhì)細胞用于實驗。

1.2.2細胞轉(zhuǎn)染和分組 取處于對數(shù)期生長的星形膠質(zhì)細胞接種于96孔板中，用Lipofectamine 2000將TFPI-2 siRNA轉(zhuǎn)染至星形膠質(zhì)細胞中，設(shè)為si-TFPI-2組，以轉(zhuǎn)染siRNA control的星形膠質(zhì)細胞為si-control組，星形膠質(zhì)細胞換液后置于O2濃度為1%的低氧培養(yǎng)箱(5%CO2、94%N2)中作為缺氧組(Hypoxia)，星形膠質(zhì)細胞換液后置于正常含氧量的環(huán)境中作為對照組(Control)，轉(zhuǎn)染TFPI-2 siRNA至缺氧星形膠質(zhì)細胞，設(shè)為si-TFPI-2+Hypoxia組，轉(zhuǎn)染siRNA control至缺氧星形膠質(zhì)細胞為si-control+Hypoxia組。細胞在轉(zhuǎn)染后24 h，用qRT-PCR和Western blot法檢測細胞中TFPI-2表達水平，同時檢測星形膠質(zhì)細胞缺氧處理24 h后的細胞中TFPI-2表達水平。

1.2.3qRT-PCR檢測星形膠質(zhì)細胞中TFPI-2 mRNA表達水平 分別收集Control 組、Hypoxia組、si-TFPI-2組、si-control組大鼠星形膠質(zhì)細胞，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌后加入1 ml的TRIZOl，顛倒混勻使各組星形膠質(zhì)細胞充分裂解后，加200 μl氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫放置5 min，4℃下12 000 r/min離心10 min。取水相至另一新的EP管中，用預(yù)冷的異丙醇沉淀RNA后，用75%的乙醇洗滌RNA，加入RNase-free ddH2O重懸RNA，置60℃的水浴中使其充分溶解，經(jīng)紫外分光光度計檢測RNA的純度及濃度后，調(diào)整RNA的濃度，以RNA為模板用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，用SYBR Green Gene Expression Assay進行熒光定量PCR檢測TFPI-2表達量，采用20 μl反應(yīng)體系。以GAPDH為內(nèi)參，用相對定量2-ΔΔCT分析TFPI-2 mRNA表達水平，每組實驗重復(fù)3次。所用引物：GAPDH-F 5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′，GAPDH-R 5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′；TFPI-2-F 5′-GGGC-AACGCCAACAATTTCT-3′，TFPI-2-R 5′-TTTCTTTGGTGCGCAGAAGC-3′。

1.2.4Western blot檢測星形膠質(zhì)細胞中TFPI-2蛋白表達水平 用預(yù)冷的PBS沖洗收集Control 組、Hypoxia組、si-TFPI-2組、si-control組星形膠質(zhì)細胞，加入適量的PMSF裂解液，置冰上孵育15 min。用細胞刮將細胞刮落后，收集到離心管內(nèi)，4℃條件下12 000 r/min 離心10 min。用BCA蛋白定量試劑盒對蛋白進行定量檢測。按照樣品和SDS-PAGE加樣緩沖液4∶1 的比例混合后，在沸水中煮沸至蛋白完全變性。每個泳道孔加入40 μg變性的蛋白樣品，以SDS-PAGE凝膠(5%濃縮膠，10%分離膠)進行電泳，用80 V電壓跑濃縮膠，用110 V電壓跑分離膠，直至電泳結(jié)束。采用半干法進行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件為：電壓80 V，轉(zhuǎn)膜時間90 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束經(jīng)TBST洗滌后將膜置于5%牛血清白蛋白中，室溫下在搖床上封閉60 min。取出膜后分別與1∶800倍稀釋GAPDH、1∶1 000 倍稀釋TFPI-2一抗在4℃中過夜反應(yīng)，再與1∶2 000倍稀釋的二抗在室溫中反應(yīng)2 h。用TBST洗滌轉(zhuǎn)印膜后以辣根過氧化物酶化學(xué)發(fā)光法進行顯色反應(yīng)，以每組星形膠質(zhì)細胞中GAPDH灰度值為參照，分析各組細胞中TFPI-2蛋白水平。

1.2.5MTT測定星形膠質(zhì)細胞增殖 Control 組、Hypoxia組、si-control+Hypoxia組、si-TFPI-2+Hypoxia組星形膠質(zhì)細胞處理24 h后，將20 μl濃度為0.5 mg/ml 的MTT加入到每孔細胞中，放在37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h。取出細胞培養(yǎng)板，把上清去掉，每孔細胞中加入100 μl二甲基亞砜，置振蕩儀上緩慢搖動反應(yīng)10 min。以酶標儀測定490 nm波長處的吸光度A值。以Control組存活率為100%，分析統(tǒng)計各組星形膠質(zhì)細胞存活率。

1.2.6流式細胞術(shù)測定星形膠質(zhì)細胞凋亡率 用胰蛋白酶消化收集培養(yǎng)24 h后的各組星形膠質(zhì)細胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細胞2次，添加400 μl結(jié)合緩沖液到細胞中混合，制成單細胞懸液。根據(jù)細胞凋亡試劑盒說明書進行操作，加入5 μl Annexin V-FITC混合后再加入5 μl PI。于室溫中避光孵育15 min 后，用流式細胞儀檢測星形膠質(zhì)細胞凋亡情況。

1.2.7qRT-PCR檢測細胞中β-catenin、c-myc、Bax、Cleaved Caspase-3 mRNA表達水平 將Control 組、Hypoxia組、si-control+Hypoxia組、si-TFPI-2+Hypoxia組細胞以上述方法處理后培養(yǎng)24 h收集細胞，用qRT-PCR法檢測細胞中β-catenin、c-myc、Bax、Cleaved Caspase-3 mRNA表達水平，方法同1.2.3。

2 結(jié)果

2.1缺氧星形膠質(zhì)細胞中TFPI-2的表達 Hypoxia組星形膠質(zhì)細胞中TFPI-2 mRNA和蛋白水平明顯高于Control 組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。缺氧處理后星形膠質(zhì)細胞中TFPI-2轉(zhuǎn)錄和表達水平升高。見圖1和表1。

2.2轉(zhuǎn)染后星形膠質(zhì)細胞中TFPI-2表達水平 si-TFPI-2組細胞中TFPI-2 mRNA和蛋白水平與Control組和si-control組相比明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，Control組細胞中TFPI-2 mRNA和蛋白水平與si-control組相比無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。TFPI-2 siRNA可以降低星形膠質(zhì)細胞中TFPI-2的轉(zhuǎn)錄和表達。見圖2和表2。

圖1 Western blot測定缺氧后的星形膠質(zhì)細胞中TFPI-2蛋白表達水平Fig.1 Western blot analysis of TFPI-2 protein expression in astrocytes after hypoxia

GroupsTFPI-2 mRNATFPI-2 proteinControl1.00±0.000.33±0.02Hypoxia2.47±0.411)0.64±0.041)

Note：Compared with control,1)P<0.05.

圖2 Western blot檢測轉(zhuǎn)染后的星形膠質(zhì)細胞中TFPI-2蛋白表達Fig.2 Western blot analysis of TFPI-2 protein expression in transfected astrocytes

GroupsTFPI-2 mRNATFPI-2 proteinControl1.00±0.000.35±0.04si-control1.02±0.131)0.32±0.031)si-TFPI-20.29±0.031)2)0.10±0.011)2)

Note：Compared with control,1)P<0.05;compared with si-control,2)P<0.05.

2.3沉默TFPI-2增加缺氧星形膠質(zhì)細胞增殖作用 Hypoxia組、si-control+Hypoxia組、si-TFPI-2+Hypoxia組星形膠質(zhì)細胞存活率明顯低于Control 組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。si-TFPI-2+Hypoxia組星形膠質(zhì)細胞存活率明顯高于Hypoxia組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，Hypoxia組和si-control+Hypoxia組相比，星形膠質(zhì)細胞存活率無明顯差別，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。提示缺氧條件抑制星形膠質(zhì)細胞增殖活性，而沉默TFPI-2可以提高缺氧星形膠質(zhì)細胞的增殖活性。見表3。

2.4沉默TFPI-2降低缺氧誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細胞凋亡 Hypoxia組、si-control+Hypoxia組、si-TFPI-2+Hypoxia組細胞凋亡率明顯高于Control組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。si-TFPI-2+Hypoxia組細胞凋亡率明顯低于Hypoxia組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，Hypoxia組和si-control+Hypoxia組相比，星形膠質(zhì)細胞凋亡率無明顯差別，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。缺氧誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞凋亡，而沉默TFPI-2可以降低缺氧星形膠質(zhì)細胞凋亡。見圖3和表4。

2.5沉默TFPI-2對缺氧星形膠質(zhì)細胞中β-catenin、c-myc、Bax、Cleaved Caspase-3表達的影響Hypoxia組、si-control+Hypoxia組、si-TFPI-2+Hypoxia組細胞中ROS和MDA的含量明顯高于Control組，β-catenin、c-myc、Bax、Cleaved Caspase-3 mRNA的表達水平明顯高于Control組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。si-TFPI-2+Hypoxia組細胞中β-catenin、c-myc、Bax、Cleaved Caspase-3 mRNA的表達水平明顯低于Hypoxia組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與Hypoxia組相比si-control+Hypoxia組細胞中β-catenin、c-myc、Bax、Cleaved Caspase-3 mRNA的表達水平無明顯差別，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。缺氧促進星形膠質(zhì)細胞中β-catenin、c-myc、Bax、Cleaved Caspase-3的表達，而沉默TFPI-2可以降低缺氧星形膠質(zhì)細胞中β-catenin、c-myc、Bax、Cleaved Caspase-3的表達，見表5。

GroupsSurvival rate(%)Control100.00±0.00Hypoxia39.47±4.121)si-control+Hypoxia42.01±3.941)2)si-TFPI-2+Hypoxia81.45±7.891)2)

Note：Compared with control,1)P<0.05;compared with Hypoxia，2)P<0.05.

圖3 流式細胞術(shù)測定各組星形膠質(zhì)細胞凋亡水平Fig.3 Flow cytometry to determine apoptotic levels of astrocytes in each group

GroupsApoptotic rate(%)Control2.17±0.24Hypoxia40.06±3.791)si-control+Hypoxia43.38±4.111)2)si-TFPI-2+Hypoxia21.70±2.051)2)

Note：Compared with control,1)P<0.05;compared with Hypoxia，2)P<0.05.

Groupsβ-cateninc-mycCleaved Caspase-3BaxControl1.00±0.001.00±0.001.00±0.001.00±0.00Hypoxia3.14±0.321)2.89±0.311)0.65±0.081)0.78±0.081)si-control+Hypoxia3.33±0.291)2)3.01±0.251)2)0.69±0.111)2)0.80±0.111)2)si-TFPI-2+Hypoxia1.41±0.191)2)1.27±0.141)2)0.34±0.031)2)0.42±0.041)2)

Note：Compared with control,1)P<0.05;compared with Hypoxia，2)P<0.05.

3 討論

星形膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一種數(shù)量較多的、體積最大的細胞。當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到缺血缺氧損傷時，星形膠質(zhì)細胞最早發(fā)生改變，且變化最顯著，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)和維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[12]。星形膠質(zhì)細胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中具有重要的調(diào)節(jié)作用，星形膠質(zhì)細胞的增殖和活化與多種缺氧性腦損傷疾病密切相關(guān)[13]。腦缺氧損傷涉及多種生理病理的過程，如細胞凋亡、能量代謝紊亂、氧化應(yīng)激等[14]。相關(guān)研究顯示，缺氧可引起一系列功能基因的表達和沉默，導(dǎo)致糖酵解、紅細胞、血管新生等變化發(fā)生[15]。本研究的結(jié)果顯示，缺氧處理后的星形膠質(zhì)細胞凋亡率上升，細胞增殖活性下降，說明缺氧可以誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞凋亡。

TFPI-2基因位于人7號染色體上，是一種絲氨酸蛋白酶抑制物，還可抑制胰蛋白酶、纖溶酶、MMP等多種酶，具有抑制腫瘤細胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移性，促進腫瘤細胞凋亡等作用[16]。TFPI-2參與腦缺氧后細胞凋亡、血管滲出、血管生成等適應(yīng)性改變環(huán)節(jié)，在SH-SY5Y細胞缺氧后，TFPI-2 mRNA和蛋白的表達水平顯著上升，可能與HIF-VEGF通路有關(guān)。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，TFPI-2可誘導(dǎo)釋放TNF-α，激活FasL/Caspase信號通路促進細胞凋亡[17,18]。在肝癌細胞中過表達TFPI-2后，由CCK-8法檢測肝癌細胞生長曲線結(jié)果可知細胞生長明顯受到抑制，增殖活性降低，這反映了肝癌細胞群體的增殖能力下降；平板克隆實驗結(jié)果顯示，過表達TFPI-2后細胞克隆率明顯低于對照組，反映了單個肝癌細胞增殖能力的下降，證實了過表達TFPI-2可抑制肝癌細胞的生長[19]。本實驗的結(jié)果顯示，缺氧星形膠質(zhì)細胞中TFPI-2 mRNA和蛋白表達水平均升高，且下調(diào)TFPI-2表達后星形膠質(zhì)細胞的凋亡率降低，細胞增殖活性升高，說明TFPI-2參與星形膠質(zhì)細胞增殖和凋亡的過程。

Bax是一種促凋亡蛋白，可與Bcl-2 形成異二聚體，對Bcl-2 產(chǎn)生阻抑作用，Bax/Bcl-2 兩蛋白比例升高時，導(dǎo)致細胞發(fā)生凋亡[20]。目前已經(jīng)鑒定出Caspase具有多種功能，包括參與白介素前體的活化、凋亡的起始、凋亡執(zhí)行、炎癥反應(yīng)等過程，其中Caspase-3是參與細胞凋亡執(zhí)行的Caspase家族成員之一，可抑制DNA修復(fù)，啟動DNA的降解[21,22]。TFPI-2可通過上調(diào)Caspase-3、Fas-R的表達，誘導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白的表達，促進促凋亡蛋白Bax表達上調(diào)，降低Bcl-2的表達，使宮頸癌細胞發(fā)生凋亡[23]。本實驗中，沉默TFPI-2可以降低缺氧星形膠質(zhì)細胞中Caspase-3活化水平，降低細胞中Bax的表達，說明TFPI-2可以通過調(diào)控Caspase和Bax的表達誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞凋亡。在多種腫瘤疾病中發(fā)現(xiàn)β-catenin的表達異常上調(diào)，大量聚集的β-catenin轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)，激活Wnt/β-catenin信號通路，調(diào)控下游靶基因c-myc、cyclin D1等轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)細胞的增殖、凋亡等過程[24,25]。在肝癌細胞中過表達TFPI-2，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)肝癌細胞侵襲能力顯著被抑制，其機制是通過抑制MMP等多種蛋白酶活性，阻斷細胞外基質(zhì)的重塑，維持細胞外基質(zhì)的完整性，達到抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和浸潤的作用[26]。相關(guān)研究表明，TFPI-2對穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊具有重要作用，其機制可能與下調(diào)c-myc和MMP-9的表達水平、抑制PI3Kγ/PKB通路的激活、促進巨噬細胞凋亡等有關(guān)，TFPI-2通過Caspase介導(dǎo)促凋亡信號通路的激活誘導(dǎo)U-251細胞凋亡[27]。本研究表明，沉默TFPI-2可以抑制缺氧星形膠質(zhì)細胞中β-catenin、c-myc的表達，提示下調(diào)TFPI-2可以降低Wnt/β-catenin信號通路的激活水平，降低下游靶基因c-myc表達，說明TFPI-2可以通過抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活調(diào)控星形膠質(zhì)細胞的凋亡。

TFPI-2下調(diào)后可以促進星形膠質(zhì)細胞的生長，抑制星形膠質(zhì)細胞凋亡，其作用機制與抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活有關(guān)，在腦缺氧損傷的發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用，提示TFPI-2是潛在的治療腦缺氧損傷的基因靶點，這為靶向TFPI-2治療腦缺氧損傷提供了理論依據(jù)。