紫外線對人皮膚成纖維細胞老化損傷的影響

劉金娟 楊宏發 李勇堅 陳艷明

(南華大學附屬第二醫院皮膚性病科,衡陽421001)

自然老化和光老化是皮膚發生老化的原因，當人的皮膚長期暴露在陽光下就會造成皮膚損傷導致光照老化。光照老化是一個損傷積累的過程，更容易導致癌前病變，而來自日光的紫外線照射是引起皮膚老化的主要自然因素，因此光老化是日光損傷造成的皮膚老化[1-3]。

紫外線波長一般為200～400 nm，根據波長的不同，可分為：長波紫外線(UVA)，中波紫外線(UVB)和短波紫外線(UVC)，波長范圍分別為315～400 nm、280～315 nm、280～200 nm[4]。不同的紫外線對人體皮膚的滲透程度不同，UVC對生物危害最大，不過它能被臭氧層全部吸收，不對人體產生損害；UVB能被皮膚表皮吸收極大部分，對人體皮膚有一定的生理作用，但這種生理作用不能滲入皮膚內部；而UVA可達到真皮深處并可長期積累，對人體皮膚和衣物產生穿透作用，且比中波紫外線強，能夠導致皮膚損害和嚴重老化[5-7]。因此，經紫外線照射后，人皮膚成纖維細胞(Human skin fibroblasts,HSF)的生長、分化和功能等方面會發生明顯的改變,實驗以HSF為研究對象，采用UVA誘導HSF光老化，不同強度紫外線干預后檢測細胞c-fos、c-Jun、Sirt1基因表達，觀察紫外線對HSF光老化的影響，探討其作用機制，本研究有利于光損傷類疾病的臨床防治。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑與儀器 DMEM培養基、細胞培養用青霉素、細胞培養用鏈霉素、胰酶(Gibco BRL公司)； 胎牛血清(杭州四季青公司)；二甲基亞砜DMSO(上海浩洋生物科技有限公司)；四甲基偶氮哇鹽MTT(美國Sigma公司)；超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase activity,GSH-Px)ELISA檢測試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所；金屬基質蛋白酶-1(Matrix metalloproteinase,MMP-1)ELISA試劑盒購自北京博奧森科技有限公司;兔抗人c-fos蛋白、兔抗人c-jun蛋白多克隆抗體(Santa公司)；DNA ladder Marker、DAB顯色試劑盒(武漢博士德)；細胞衰老β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色試劑盒(碧云天生物技術研究所)；TRIzol(Invitrogen公司)；逆轉錄試劑盒(Fermentas公司)；DEPC(北京國科昌盛生物工程公司)；引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成；酶標儀(美國BioTek ELX800)；UVA型紫外輻照計(北京師范大學光電儀器)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)

1.1.2皮膚取材 選用的皮膚為兒童包皮環切術后的包皮皮膚組織，經麻醉后，所切除的用于研究的包皮組織部分不能再注入任何其他藥物，包皮組織從切除至轉移到實驗室進行細胞組織塊培養的整個離體時間不超過1 h，此用于研究的標本共2塊，由本醫院泌尿外科提供。用于本研究的標本已按程序申報并通過本院倫理委員會批準，在收集標本時已告知患者及家屬此皮膚標本的研究用途,獲得患者及家屬同意并已簽知情同意書。

1.2方法

1.2.1培養原代細胞HSF 將標本修剪為1 mm3大小的組織塊，然后將組織塊均勻平鋪于25 cm2細胞瓶內，倒置培養3 h后翻瓶，加入少量DMEM培養液(含10%FBS、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素)，放入37℃、5%CO2培養箱，每3 d換一次液，每天置倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，用第5代HSF做實驗對象。

1.2.2原代細胞生長曲線 第5代HSF消化后，將細胞接種于24孔細胞培養板內，細胞密度為1×104ml-1，每孔加入1 ml細胞懸液，每隔24 h，消化3孔細胞并進行計數，取3孔平均值，記錄，連續計數7 d后繪制生長曲線。

1.2.3不同UVA強度作用相同時間、中等UVA強度作用不同時間對HSF的影響 取第5代HSF，將細胞密度調整為1×104ml-1，接種于4塊96孔板，每孔加入1 ml細胞懸液，在5%CO2培養箱內培養4 h后每孔加0.5 ml培養液繼續培養，采用不同劑量的UVA(5 J/cm2、10 J/cm2、20 J/cm2)實驗組均照射48 h HSF，不照射的96孔板作為對照組，用MTT法檢測各孔490 nm吸光值，檢測不同劑量的UVA干擾后細胞的增殖情況，同法用10 J/cm2UVA照射HSF 0、24、48、72、96 h后，用MTT法檢測各孔490 nm 吸光值，與對照組比較，測定細胞的增殖情況。

1.2.4細胞衰老SA-β-Gal染色 第5代HSF經10 J/cm2UVA照射72 h后，吸除6孔板中細胞培養液，用PBS洗滌，加入1 ml SA-β-Gal染色固定液，室溫固定15 min；吸除細胞固定液，用PBS洗滌，吸除PBS，每孔加1 ml染色工作液，用保鮮膜封住防蒸發，37℃孵育過夜，倒置顯微鏡下觀察染色結果，衰老細胞顯示深藍著染。

1.2.5c-fos、c-jun免疫組化法檢測結果 將第五代不同強度UVA照射后的HSF成1×104ml-1密度接種于96孔培養板中,每孔200 μl，置37℃培養箱培養過夜，用 PBS沖洗，4%多聚甲醛液固定，漂洗，然后3%H2O2避光室溫孵育，漂洗，加入5%羊血清37℃封閉，漂洗后加入2%羊血清稀釋的抗體，4℃反應過夜。第二天取出，漂洗，滴加一抗,覆蓋所有細胞，37℃孵育30 min，漂洗，滴加二抗，用 DAB顯色，鏡下觀察，并拍攝照片。

1.2.6RT-PCR法測定不同強度UVA照射72 h的c-fos、c-jun、Sirt1的 mRNA表達水平 取第5代HSF傳入24孔板中，按細胞生長曲線，細胞正常培養3 d后，用不同強度UVA照射72 h后，應用Trizol提取照射第3天后各組細胞總RNA，RT-PCR檢測c-fos、c-jun、Sirt1的表達變化。引物按下列序列設計：c-fos引物：上游5′-CTTCAGGTCCGACTTCC-3′，下游：5′-CCAGCGCTCATC-CTGATC-3′，長度132 bp；c-jun引物：上游5′-CCAAGAACTCGGACCTCC-3′，下游5′-GAAGCCCTCCT-GCTCATC-3′，長度167 bp；Sirt1引物：上游5′-TCCATACCTGGAATCACT-3′，下游5′-CAGGCCATCTTGATCACC-3′，長度365 bp；GAPDH引物：上游5′-GTTACCGATCTTCGAACTGC-3′，下游：5′-ACGGTCGATCTTGACCGTAT-3′，長度為420 bp。實驗操作按產品說明書進行。

1.2.7Western blot 檢測c-fos、c-jun、Sirt1蛋白表達 取不同強度UVA干預3 d后的各組細胞，倒掉培養液，加PBS洗滌細胞3次，把培養板置于冰上，每孔細胞加含PMSF的裂解液。裂解完全后，離心，提取總蛋白，檢測蛋白濃度，根據所測蛋白分子量，配12%分離膠和5%濃縮膠，按30 μg/孔蛋白量上樣，進行電泳，濃縮膠電壓60 V，至分離膠電壓調至100 V,至溴酚藍剛跑出終止電泳，然后進行轉膜，將膜從封閉液中分別轉入一抗中，4℃孵育過夜，洗膜，加入二抗，室溫孵育1 h，再次用TBS漂洗，1 h后顯影，晾干，觀察結果。

2 結果

2.1原代HSF培養 組織塊培養3 d換一次液，待培養第6天，發現在瓶底有細胞游離出來，并在組織塊周圍形成放射狀遷出，換液，繼續培養7 d后，顯微鏡下發現細胞達融合狀態,細胞為長梭形，單層，此時可以進行消化傳代，結果見圖1。

2.2HSF生長曲線繪制 在一段時間內，HSF細胞數量隨著培養時間而增加，與時間成正相關。通過繪制生長曲線發現細胞生長有三個時期，其中0～3 d 為潛伏期，3～6 d為對數生長期，6～7 d為平臺期，結果見圖2。

2.3不同強度UVA照射HSF后的細胞增殖情況 從MTT檢測結果可見，實驗組不同強度的UVA照射HSF后，細胞的增殖均受抑制，且隨著UVA強度的增加，增殖能力減弱得更明顯，中、高強度的UVA實驗組與對照組比較細胞的增殖差異均具有顯著的統計學意義(P<0.05)，結果見表1及圖3。而用中等強度10 J/cm2的UVA對HSF照射不同時間，可以看到隨著照射時間的延長，細胞增殖能力越來越弱，當照射時間長于48 h后，細胞增殖減弱明顯，特別是照射72 h后對細胞增殖的影響更為明顯，這些改變與對照組比較差異具有顯著統計學意義(P<0.05)，結果詳見表2和圖4。研究表明HSF細胞增殖能力與UVA強度和照射時間密切相關。

圖1 原代HSF(×100)Fig.1 Primary HSF(×100)

2.4SA-β-Gal染色鑒定細胞衰老 10 J/cm2UVA照射HSF 72 h后，經SA-β-Gal染色，置倒置顯微鏡下觀察，大部分細胞質被染成藍色，而對照組SA-β-Gal染色為陰性。說明經UVA照射后，HSF普遍被誘導成衰老狀態。結果見圖5和圖6。

圖2 第5代HSF的生長曲線 Fig.2 Growth curve of 5th generation HSF

表1 不同強度UVA照射后HSF的OD值

Tab.1 OD value of HSF after UVA irradiation of different intensities

GroupsnOD valueControl320.599±0.025UVA 5 J/cm2320.531±0.025UVA 10 J/cm2320.496±0.0281)UVA 20 J/cm2320.240±0.0191)

Note：Compared with the control group,1)P<0.05.

圖3 不同強度UVA照射對HSF增殖的影響Fig.3 Effect of HSF proliferation after UVA exposure with different intensities

2.5ELISA檢測不同強度UVA照射72 h后HSF中SOD、GSH-Px活性及MMP-1含量 實驗證明，不同強度UVA照射能明顯降低細胞內SOD、GSH-Px活性，顯著提高MMP-1的含量，差異均具有統計學意義(P<0.05)，結果見表3。

2.6免疫組化法鑒定不同強度UVA照射72 h后HSF中c-fos、c-jun的表達 隨著UVA照射強度的增加，細胞經免疫組化染色c-fos、c-jun蛋白表達均呈陽性，結果見圖7和圖8。

2.7HSF經不同強度UVA照射72 h后c-fos、c-jun、Sirt1的mRNA表達水平 HSF經不同強度UVA照射后，細胞呈衰老狀態，對照組c-fos和c-jun提取的mRNA水平均較低且兩者的mRNA水平值接近，經不同UVA照射后，c-fos mRNA表達增加速度高于c-jun mRNA表達增加速度，在光老化中c-fos的敏感度高于c-jun，結果表明，隨著UVA照射劑量的增加，成纖維細胞損傷加劇，c-fos蛋白被激活。在紫外線的刺激下，抗衰老因子Sirt1的表達也明顯增加，與對照組比較差異具有統計學意義(P<0.05)，結果見表4。

表2 10 J/cm2UVA照射HSF不同時間的OD值

Tab.2 OD values of HSF exposure to 10 J/cm2UVA at different times

TimenOD value0 h320.599±0.02524 h320.520±0.02448 h320.497±0.0241)72 h320.245±0.0201)96 h320.178±0.0121)

Note：Compared with the control group,1)P<0.05.

圖4 10 J/cm2 UVA照射不同時間后對HSF增殖的影響Fig.4 Effect of 10 J/cm2 UVA irradiation on HSF proliferation at different times

圖5 正常HSF 陰性染色結果(×100)Fig.5 Negative staining of normal HSF(×100)

圖6 UVA照射HSF 72 h后陽性染色結果(×100)Fig.6 Positive staining after HSF exposure to 72 by UVA(×100)

表3 不同強度UVA照射后對HSF中SOD、GSH-Px活性及MMP-1含量的影響

Tab.3 Effects of UVA irradiation on activity of SOD,GSH-Px and expression of MMP-1 in HSF

GroupsSOD(U/ml)GSH-Px (μmol/g)MMP-1(ng/ml)Control18.431±0.49125.438±2.7294.592±3.891UVA 5 J/cm212.963±0.8731)11.921±0.4121)7.533±6.0351)UVA 10 J/cm29.885±0.8471)8.010±0.1411)10.299±5.5161)UVA 20 J/cm24.361±0.2441)4.121±0.3321)15.062±2.2881)

Note：Compared with the control group,1)P<0.05.

圖7 HSF中c-fos表達Fig.7 c-fos expression in HSFNote: A.Control group;B.5 J/cm2 UVA group;C.10 J/cm2 UVA group;D.20 J/cm2 UVA group.

圖8 HSF中c-jun表達Fig.8 c-jun expression in HSFNote: A.Control group;B.5 J/cm2 UVA group;C.10 J/cm2 UVA group;D.20 J/cm2 UVA group.

表4 HSF經不同強度UVA照射72 h后c-fos、c-jun、Sirt1的 mRNA 水平相對定量表達

Tab.4 Relative expression of mRNA levels of c-fos,c-jun and Sirt1 in HSF after exposure to 72 h by UVA at different intensities

Groupsc-fosc-junSirt1Control0.433±0.0460.432±0.0470.519±0.054UVA 5 J/cm20.679±0.0391)0.523±0.0311)0.712±0.0191)UVA 10 J/cm20.791±0.0511)0.579±0.0491)0.879±0.0451)UVA 20 J/cm20.899±0.0441)0.624±0.0501)0.932±0.0321)

Note：Compared with the control group,1)P<0.05.

圖9 HSF經不同強度UVA照射72 h后c-fos、c-jun、Sirt1的蛋白表達Fig.9 Protein expression of c-fos,c-jun and Sirt1 after exposure to 72 h by UVA at different intensitiesNote: 1,2,3,4 represent control,UVA 5 J/cm2,UVA 10 J/cm2,UVA 20 J/cm2 respectively.

2.8Western blot檢測結果 HSF經不同強度UVA照射HSF 72 h后，c-fos、c-jun、Sirt1的蛋白表達與紫外線強度呈正相關，隨著強度增大，表達增強，結果見圖9。

3 討論

皮膚是人體最大的器官，由表皮和真皮組成，在皮膚真皮層中HSF是主要細胞，因此HSF在人體最容易獲得。HSF也是主要修復細胞，對皮膚衰老和細胞受損具有修復作用，是紫外線輻射的重要靶位，在抗皮膚衰老和損傷中起著重要的作用。它具有重要的結構功能，能釋放一些前炎癥介質，從而激發急、慢性炎癥反應并使之延續。細胞隨著年齡的增長，其生理功能和結構發生退行性變化，這種變化就是細胞衰老又稱細胞老化。皮膚衰老和受損后的修復是一個復雜的生物學過程，而HSF是重要的修復細胞之一，小面積皮膚就可獲得較多的原代HSF，通過傳代能得到純度高的HSF，HSF對皮膚衰老及創傷的修復起著決定的作用，在一定時間內，HSF的增殖能力與細胞的增殖能力呈正相關，這樣的增殖能力及HSF的再增殖能力恢復是體細胞基因治療的研究方向。本研究中通過對人包皮組織進行組織貼塊法培養原代HSF，對HSF進行傳代，從細胞生長曲線可以看到，在一定時間內細胞數量隨時間增長而增加，到第7天后，細胞達融合狀態，形狀為長梭形，呈單層，此時可進行傳代，通過對生長曲線的繪制可以發現HSF有潛伏期、對數生長期、平臺期三個時期。

我們已知Fos蛋白有四種形式(c-fos、Fos B、Fra-1及 Fra-2)，它與c-jun參與構成轉錄激活因子(Activator protein 1，Ap-1)，AP-1蛋白表達在光老化的研究中具有重要作用，其表達產物也位于細胞核內，另外c-fos 二聚體形式的Ap-1生物學活性最強[8,9]。耿春杰等[10]發表癌基因c-fos、c-myc在皮膚鱗狀細胞癌皮損中的表達及意義，認為c-fos僅在細胞周期早期發揮作用，腫瘤細胞形成后，癌組織內c-fos表達下降。因此與研究中皮膚光老化c-fos表達增加相一致。隨著UVA的照射增強，c-Jun蛋白和mRNA表達均有升高，并隨著照射強度增加而升高越明顯。不同強度UVA照射能明顯降低細胞內SOD及GSH-Px活性，抗損傷能力明顯減弱，而MMP-1的含量顯著提高，說明UVA對細胞產生光損傷作用。通過免疫組化研究，發現隨著UVA照射強度的增加，c-fos、c-jun蛋白均呈陽性表達，細胞漿和細胞核內染色均為棕黃色。在UVA照射下，HSF細胞中的c-Fos和c-Jun 形成異二聚體的量增加[11-13]，使細胞產生過度增殖，從而使皮膚的外觀和組織均發生改變。在RT-PCR結果中，c-fos mRNA表達增加速度高于c-jun mRNA表達增加速度，說明c-fos的敏感度在光老化中高于c-jun，在Western blot結果中也可以看到細胞內c-fos蛋白被激活，且c-fos、c-jun蛋白表達與紫外線強度呈正相關，這一結果與RT-PCR結果相一致。

Sirt1(Sirtuin type 1)也被稱為NAD-依賴性組蛋白去乙酰化酶，為Sirtuins家族成員之一，與細胞增殖、分化、衰老、凋亡和代謝密切相關[14-16]。楊婕等[17]證實Sirt1在細胞衰老過程中發揮著重要的作用，而且許多miRNAs對衰老相關分子Sirt1都具有調控作用。任朋亮等[18]也進一步證實Sirt1能維持細胞基因組的穩定性，進而減緩細胞的衰老。本研究發現在紫外線的刺激下，抗衰老因子Sirt1 mRNA的表達也明顯增加，Sirt1的蛋白表達與紫外線強度亦呈正相關，這些結果均與上述研究者的實驗結果相一致。

上述結果表明，HSF細胞可被UVA誘導進入一種應激老化狀態，其衰老與機體內髙水平的抗氧化能力密切相關，這種由UVA照射引起的光老化，會使HSF增殖活性下降，細胞形狀發生改變，同時使細胞內AP-1蛋白 (c-fos,c-jun)被激活、抗衰老因子Sirt1高表達，而在光老化關鍵信號路徑中AP-1蛋白的高表達，是否是直接引起抗衰老因子Sirt1表達增高的原因，有待進一步研究論證，是后續實驗的研究方向。