人參皂甙RB2抑制NF-κB的激活對LPS誘導的新生小鼠急性肺損傷的免疫調節作用①

楊 釩 鄭毅文 周有祥 楊玉林

(興義市人民醫院兒科,興義562400)

急性肺損傷是由感染、創傷、休克、有害氣體吸入和中毒等引起的機體過度炎癥反應急性綜合征[1]。主要病理特征為肺毛細血管的通透性增加、肺泡滲出液中富含蛋白質、肺水腫伴隨肺間質纖維化。急性肺損傷的嚴重階段稱為急性呼吸窘迫綜合征，炎癥反應失控持續放大后，會引發全身性的炎癥反應綜合征[2]。急性肺炎發病急，死亡率高，常需要進重癥監護室觀察，同時伴隨機械通氣。據統計，每年10萬人中約有12～23個人會患急性肺損傷，死亡率高達25%～40%，且發病機制不十分清楚[3]。目前急性肺損傷的治療難點在于準確辨別急性肺損傷和心源性肺水腫，治療的方案從終止肺損傷、減輕肺水腫、保證供氧和減少并發癥等方面入手，其中減少肺部炎癥反應是治療的根本[4]。為此，研究急性肺損傷的發病機制，尋找特定藥物靶點，開發有效的治療方法是主要方向。人參皂苷是固醇類化合物為人參的主要活性成分。從人參中提取出的皂苷單體有40多種，其中Rb、Rc、Rd、Re和Rg占90%以上。研究顯示，人參皂苷Rb2具有促進脂代謝、增強肝臟糖代謝、抑制視網膜色素上皮細胞增生、抗腫瘤等作用[5-7]。目前人參皂苷Rb2的研究較少，對急性肺損傷小鼠免疫功能影響的相關研究還未見報道。本文用LPS腹腔注射建立新生小鼠急性肺損傷模型，研究人參皂苷Rb2對急性肺損傷新生小鼠免疫功能的影響及其分子機制。

1 材料與方法

1.1材料 人參皂苷RB2標準品購自北京索萊寶科技有限公司；LPS粉末購自Sigma；HE染色試劑盒、TUNEL染色試劑盒均購自碧云天生物公司；Caspase-3、Caspase-9、HMGB1、MIF、NF-κB p-p65單克隆抗體，二抗及顯影液均購自Abcam；小鼠IL-6、IL-1β、TNF-α和IL-10的ELISA檢測試劑盒購自ABclonal。

1.2方法

1.2.1小鼠分組及加藥 將20只新生2 d的小鼠分為四組：對照組、GR2組、LPS組和LPS+GR2組，每組5只。GR2組為健康新生小鼠，腹腔注射GR2 50 mg/kg BW；LPS組：健康小鼠腹腔注射0.6 mg/kg BW的LPS，連續5 d；LPS+GR2組：模型小鼠腹腔注射人參皂苷 50 mg/kg BW。

1.2.2HE染色 取組織塊，用10%的甲醇固定后，常規石蠟包埋，5 μm切片。二甲苯脫蠟，乙醇梯度至水。蘇木精染色5 min，自來水沖洗；鹽酸乙醇分化30 s，自來水浸洗15 min，將切片置于伊紅染色液中2 min，85%乙醇、95%乙醇、無水乙醇各脫水1 min，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3TUNEL染色 二甲苯脫蠟5 min后，換新鮮二甲苯繼續脫蠟5 min。無水乙醇5 min，90%乙醇2 min，70%乙醇2 min，蒸餾水洗2次，每次1 min。滴加20 μg/ml不含DNA酶的蛋白酶K，室溫下作用15 min。PBS清洗3次，清除蛋白酶K。PBS配制的3%過氧化氫室溫孵育20 min，滅活內源過氧化氫酶。滴加檢測液，PBS清洗后加反應終止液，室溫孵育10 min。PBS清洗3次，加HRP工作液，室溫孵育30 min。PBS清洗3次，加DAB顯色液，室溫孵育10 min，PBS洗滌3次。乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片觀察。

1.2.4Western blot 取組織塊，用剪刀盡量剪碎后，加含蛋白酶抑制劑的裂解液，冰上裂解30 min。低溫離心機中離心，轉移上清。BSA法測總蛋白濃度，加蛋白上樣緩沖液制作蛋白樣品，沸水浴10 min，15 000 r/min離心10 min。12%的變性蛋白凝膠分離，蛋白樣品濕轉至PVDF膜。5%脫脂牛奶室溫下孵育1 h；轉移至一抗中室溫下孵育2 h，TBST洗3次，每次10 min；再將膜轉移至二抗中，室溫下孵育1 h，TBST洗3次，每次5 min；加顯色液，凝膠成像系統中顯影并拍照。

1.2.5ELISA 向酶標孔中加300 μl的洗滌液，靜置30 s，洗5次。設置空白對照，加100 μl樣品液，室溫下震蕩孵育2 h。洗滌液清洗5次，加稀釋好的生物素抗體，每孔100 μl，室溫下震蕩孵育1 h。洗滌液清洗5次，加稀釋好的親和素標記的辣根過氧化物酶，室溫下震蕩孵育30 min。洗滌液洗5次，加顯色液，室溫避光孵育10 min。加終止液，輕輕混勻，酶標儀下檢測450 nm處波長。

1.3統計學分析 采用SPSS18.0軟件分析實驗結果，兩組間比較使用t檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1人參皂苷RB2緩解LPS誘導的新生小鼠急性肺損傷 對照組和GR2組肺泡結構清晰完整，肺泡壁光滑均勻，周圍組織無水腫，炎性細胞少。LPS 組肺泡壁增厚，部分肺泡腔出現萎縮，出現大量炎性細胞浸潤。LPS+GR2組有少量炎性細胞浸潤，部分肺泡結構不清晰。實驗結果表明，人參皂苷RB2能緩解LPS誘導的新生小鼠急性肺損傷。

2.2人參皂苷RB2抑制LPS誘導的新生小鼠肺組織細胞凋亡 GR2與對照組相比較，呈凋亡陽性的細胞數目沒有明顯的差異(圖2A)；LPS組與對照組相比，凋亡細胞的比率顯著升高(圖2A，P<0.01)；LPS+GR2組與LPS組相比較，凋亡細胞的比率顯著降低(圖2A，P<0.01)。為進一步研究人參皂苷RB2對自噬相關蛋白的影響，我們用Western blot檢測Caspase-3和Caspase-9的表達。實驗結果顯示，GR2組與對照組相比，Caspase-3和Caspase-9的表達沒有明顯的變化(圖2B)；LPS組與對照組相比，Caspase-3和Caspase-9 的表達水平顯著上調(圖2B，P<0.01)；LPS+GR2組與LPS組相比較，Caspase-3和Caspase-9 的表達水平顯著下調(圖2B，P<0.01)。實驗結果表明，人參皂苷RB2抑制LPS誘導的新生小鼠肺組織細胞凋亡。

圖1 HE染色觀察肺組織病理變化Fig.1 Pathological changes of lung tissue was observed by HE staining

圖2 人參皂苷RB2對LPS誘導的新生小鼠肺組織細胞自噬的影響Fig.2 Effect of GR2 on apoptosis of LPS induced acute lung injury in neonatal miceNote: *.P<0.01 compared with the Control group；#.P<0.01 compared with the LPS group.

2.3人參皂苷RB2抑制LPS誘導的新生小鼠肺組織炎癥反應 GR2組與對照組相比IL-6、IL-1β、TNF-α和IL-10的濃度均沒有顯著的變化(圖3)；LPS組與對照組相比IL-6、IL-1β和TNF-α的濃度顯著上升，IL-10的濃度沒有明顯變化(圖3，P<0.01)。LPS+GR2組與LPS組相比較IL-6、IL-1β和TNF-α的濃度顯著下降，IL-10的濃度沒有明顯變化(圖3，P<0.01)。實驗結果表明，人參皂苷RB2抑制LPS誘導的新生小鼠肺組織炎癥反應。

2.4人參皂苷RB2對炎癥相關蛋白表達的影響 為進一步研究人參皂苷RB2影響炎癥反應的分子機制，我們用Western blot檢測小鼠肺組織中HMGB1和MIF的表達。實驗結果顯示，GR2組與對照組相比，HMGB1和MIF的表達水平沒有明顯的差異(圖4)；LPS組與對照組相比，HMGB1和MIF的表達水平顯著上調(圖4，P<0.01)；LPS+GR2組與LPS組相比較， HMGB1和MIF的表達水平顯著下調(圖4，P<0.01)。實驗結果表明，人參皂苷下調LPS誘導急性肺損傷小鼠肺組織HMGB1和MIF的表達。

圖3 ELISA檢測炎癥因子的水平Fig.3 Concentration of inflammatory factor were detec-ted by ELISANote: *.P<0.01 compared with the Control group；#.P<0.01 compared with the LPS group.

圖4 人參皂苷RB2對炎癥相關蛋白表達的影響Fig.4 Effect of GR2 on expression of inflammation related proteinsNote: *.P<0.01 compared with the Control group；#.P<0.01 compared with the LPS group.

圖5 人參皂苷RB2對NF-κB p65磷酸化的影響Fig.5 Effect of GR2 on phosphorylation of NF-κB p65Note: *.P<0.01 compared with the Control group；#.P<0.01 compared with the LPS group.

2.5人參皂苷抑制NF-κB p65的活化 實驗結果顯示，各組p65總的表達量沒有明顯的變化(圖5)。GR2組與對照組相比，p-p65的表達水平沒有明顯的變化(圖5)；LPS組與對照組相比，p-p65的表達顯著上調(圖5，P<0.01)；LPS+GR2組與LPS組相比較，p-p65的表達顯著下調(圖5，P<0.01)。實驗結果表明，人參皂苷RB2抑制LPS誘導急性肺損傷小鼠肺組織NF-κB p65的活化。

3 討論

急性肺損傷是指由多種病因損傷肺臟的上皮細胞和內皮細胞后，使組織功能、形態異常，通過炎癥介質導致肺表面活性物質降低、水腫、肺膨脹不全[8]。目前肺損傷缺少準確的診斷標準和有效的治療措施[9]。尾靜脈注射、腹腔注射和吸入LPS是建立急性肺損傷動物模型的常用方法[10,11]，本文采用來源于大腸埃希菌的LPS腹腔注射建立急性肺損傷新生小鼠模型。HE染色結果顯示，模型小鼠肺組織出現明顯的炎性細胞浸潤，肺泡壁增厚等特點，表明模型建立成功。大量研究顯示，人參皂苷能緩解各種病因誘導的肺損傷。如Wang等[12]研究發現，人參皂苷Rb1對缺血再灌注誘導的大鼠肺損傷具有保護作用。Yuan等[13]研究顯示，人參皂苷Rb1能緩解LPS誘導的大鼠急性肺損傷。本文研究結果與前人研究一致，實驗結果表明，人參皂苷Rb2能緩解LPS誘導的新生小鼠急性肺損傷。

細胞凋亡在機體生長、發育和衰老過程中發揮著重要的作用。大量研究顯示，人參皂苷Rb2具有抑制細胞凋亡的作用。如Park等[14]研究發現，人參皂苷Rb2通過下調脂類過氧化物和環氧合酶的表達，抑制高糖誘導的ARPE細胞凋亡。Gao等[15]研究發現，人參皂苷Rb2調控Ras-ERK1/2信號通路，抑制地塞米松誘導的骨髓間質干細胞凋亡。本文研究結果顯示，人參皂苷Rb2加藥處理后的模型小鼠肺組織細胞凋亡比率明顯降低。Caspase家族是細胞凋亡過程中發揮重要作用的一組半胱氨酸蛋白酶[16]。Caspase-9參與細胞凋亡的起始，能激活下游Caspase蛋白。Caspase-3被認為是執行細胞凋亡的關鍵蛋白，被激活后通過酶解凋亡抑制蛋白、酶解細胞外基質和骨架蛋白、酶解DNA轉錄復制及修復相關蛋白，使細胞固縮、與周圍細胞分離、染色質聚集等，導致細胞不可逆轉的發生凋亡[17]。本文研究結果顯示，模型小鼠經人參皂苷Rb2處理后，Caspase-9和Caspase-3的表達顯著下調，表明人參皂苷Rb2可抑制LPS誘導的新生小鼠急性肺損傷細胞凋亡。

急性肺損傷的重要特點是促炎因子的過度表達和抗炎因子相對不足。急性肺損傷治療的根本是炎癥介質與抗炎介質的平衡[9]。LPS進入機體后，促進巨噬細胞分泌促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α等，促炎因子有放大炎癥反應的作用，常引起全身性的炎癥反應，嚴重損害器官和機體內穩態[18]。IL-10是重要的炎癥抑制因子，廣泛抑制IL-6、IL-1β、TNF-α和IL-8等促炎因子。本文研究發現, LPS誘導的急性肺損傷大鼠肺組織中 IL-6、IL-1β和TNF-α的含量顯著上調,而IL-10的含量沒有明顯的變化。此外，Wu等[19]研究發現，人參皂苷可通過抑制NF-κB下調TNF-α和一氧化氮的表達，進而緩解LPS誘導的N9小膠質細胞炎癥反應。Kim等[20]研究發現,人參皂苷Rb2、Rg1能抑制外界刺激下小鼠IL-6 的表達。實驗結果表明,人參皂苷Rb2能下調LPS誘導的急性肺損傷新生小鼠肺組織中促炎因子的高表達。

HMGB1是一種高度保守的核蛋白，是LPS致死效應的晚期炎癥介質[21]。細胞受損后，HMGB1釋放到細胞外，促進IL-6、IL-1β、TNF-α和IL-8等促炎因子的表達，其中并不包括IL-10[22]。同時HMGB1具有激活NF-κB的作用，促進炎癥發生[23]。MIF是多功能效應蛋白分子，參與多種炎癥疾病的免疫調節，在炎癥反應中高表達[24]。本文研究結果顯示，人參皂苷Rb2處理模型小鼠后，HMGB1和MIF的表達顯著下調。實驗結果表明，人參皂苷Rb2能抑制LPS誘導急性肺損傷新生小鼠炎癥反應。

脂多糖是位于革蘭氏陰性菌細胞壁最外層的較厚的脂質多糖復合物，由類脂A、核心多糖和O-抗原組成，其中脂質A是內毒素活性中心[25]。當 LPS進入機體后,首先與LPS結合蛋白結合,并被運送到免疫細胞膜表面,促進LPS與膜表面蛋白CD14相結合[26]。隨后CD14將LPS轉運到Toll樣受體4上面，促發一連串生物反應，最終活化轉錄因子NF-κB[27,28]。NF-κB入核，促進一系列的炎癥因子的表達，如IL-6、IL-1β、TNF-α等，另外NF-κB的激活能促進細胞凋亡[29]。本研究結果顯示人參皂苷Rb2能顯著抑制LPS誘導的NF-κB p65磷酸化水平升高。

綜上所述，人參皂苷Rb2通過抑制NF-κB的激活，抑制LPS誘導的急性肺損傷新生小鼠肺組織細胞凋亡和炎癥反應，調節模型小鼠的免疫功能。本研究下一步將探究人參皂苷對LPS作用下體外培養細胞的凋亡和氧化應激反應的影響。