HOXB5基因調控STAT3信號對膀胱癌細胞凋亡及免疫抑制因子的影響研究

劉邦儉 王 琦 郜 磊 于德新

(安徽省太和縣第二人民醫院泌尿外科，太和236600)

膀胱癌是我國常見的泌尿系統腫瘤之一，具有高發病率和高復發率的特點，其發生發展是一個多階段多基因的復雜過程，涉及到癌基因活化、抑癌基因失活、細胞周期調控失常等諸多方面[1]，因此研究膀胱癌發生發展的分子機制具有重要意義。同源盒(HOX)基因家族是同源框基因中的一大類，分為A、B、C和D四個族，既往研究表明，HOX異常表達與多種腫瘤的發生發展密切相關[2,3]。HOXB5為HOX家族成員之一，有研究顯示，HOXB5可通過上調β-catenin誘導胃癌細胞侵襲及遷移[4]。HOXB5可促進乳腺癌細胞的增殖及侵襲[5]。膀胱癌中HOXB5呈現高表達，抑制其表達可降低癌細胞致癌性[6]。HOXB5基因對膀胱癌細胞凋亡、免疫抑制因子表達的影響研究尚未明確。血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)和轉化生長因子-β1(Transforming growth factor-β1，TGF-β1)是腫瘤免疫抑制中最重要的因子[7]。異常活化的STAT3信號與細胞的增殖異常和惡性轉化密切相關，抑制STAT3信號可降低腫瘤細胞生長[8]。因此，本研究旨在探討HOXB5基因對膀胱癌細胞凋亡、免疫抑制因子VEGF和TGF-β1表達及STAT3信號的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞 正常膀胱上皮細胞SV-HUC-1及T24、5637、BIU-87三組膀胱癌細胞系均購自中國科學院上海細胞庫。

1.1.2主要試劑和儀器 DMEM培養基、FBS均購自美國Gibco；蛋白裂解液購自日本TaKaRa；BCA蛋白定量試劑盒購自上海索寶生物；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒購自南京凱基；兔抗人HOXB5抗體購自美國GeneCopoeia(貨號：F0041)；兔抗人p-JAK2抗體(貨號：4406)、兔抗人p-STAT3抗體(貨號：9145)、兔抗人Bax抗體(貨號：2772)、兔抗人VEGF抗體(貨號：2479)和兔抗人TGF-β1抗體(貨號：5154)及HRP標記兔抗鼠二抗均購自美國CST；流式細胞儀購自美國BD；凝膠成像系統購自北京六一儀器廠。

1.2方法

1.2.1細胞培養 細胞常規復蘇后，接種于培養瓶中，在5%CO2、37℃條件下用含10%FBS的DMEM培養基培養。隔天換液，細胞在瓶壁鋪滿75%時進行傳代。選擇生長至對數期的細胞用于實驗研究。1.2.2轉染 siRNA序列設計及合成均由上海吉瑪公司完成。T24細胞分為3組處理，si-HOXB5組(轉染HOXB5的特異性siRNA)、NC組(轉染無干擾的siRNA)和空白組(細胞未經特殊處理)。參照LipofectamineTM2000(美國，Invitrogen)說明，以2×105個/孔細胞濃度接種生長至對數期的T24細胞于6孔板，恒溫孵箱中孵育24 h，細胞貼壁且生長密度達到70%后將制備的lip2000-siRNA復合物加入至6孔板，孵育6 h后換為含血清的培養基繼續培養，收集轉染48 h細胞用于實驗研究。

1.2.3Western blot RIPA蛋白裂解液適量提取細胞總蛋白，BCA法定量蛋白，參照碧云天試劑盒說明配制10%濃度的膠，每孔道加總蛋白40 μg，100 V 恒壓電泳2 h，蛋白分離后在100 V恒壓下轉膜1.5 h，轉好的膜用5%脫脂奶粉室溫條件封閉1 h，將膜與一抗(均按照1∶1 000稀釋的HOXB5、p-JAK2、p-STAT3、Bax、VEGF和TGF-β1抗體)，4℃孵育過夜，洗膜，室溫孵育HRP標記的二抗1 h，洗膜，ECL顯色，GAPDH蛋白為內參，Gel Pro 4.0軟件分析各蛋白與內參的灰度值比值，以其比值為各目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

1.2.4細胞凋亡檢測 胰酶消化生長至對數期的T24細胞(細胞長滿75%)，制備成細胞懸液，細胞濃度調整為5×105個/ml，取混懸液1 ml，離心，棄掉上清，PBS洗滌后用1×binding buffer 400 μl重懸細胞，分別在每處理組細胞中加入5 μl的Annexin V-FITC和10 μl的PI，4℃避光染色15～20 min，上機前再加入300 μl的1×binding buffer，1 h內通過流式細胞儀檢測。

1.2.5抑制STAT3信號對膀胱癌細胞凋亡的影響 si-HOXB5或STAT3信號通路抑制劑AG490(50 μmol/L)單獨或聯合處理T24細胞48 h，細胞分為 si-HOXB5組、AG490組和si-HOXB5+AG490組，流式細胞術檢測細胞凋亡率，Western blot檢測p-JAK2、p-STAT3、Bax、p53和VEGF的蛋白表達。方法同1.2.3。

2 結果

2.1HOXB5在膀胱癌細胞的表達 以正常膀胱上皮細胞SV-HUC-1為對照，Western blot檢測膀胱癌T24、5637和BIU-87細胞HOXB5的蛋白表達，結果顯示，HOXB5在T24、5637和BIU-87細胞的蛋白表達均顯著高于在SV-HUC-1細胞表達(P<0.05)。T24細胞中HOXB5的表達最高，選擇作為研究對象。見圖1、表1。

圖1 HOXB5在膀胱癌細胞的表達Fig.1 Expression of HOXB5 in bladder cancer cells

2.2HOXB5 siRNA轉染T24細胞效果 HOXB5 siRNA轉染T24細胞后HOXB5蛋白表達檢測結果如圖2和表2所示，si-HOXB5組HOXB5表達顯著低于空白組(P<0.05)，NC組HOXB5的表達與空白組差異不顯著(P>0.05)。

2.3HOXB5 siRNA對T24細胞凋亡的影響 各組細胞凋亡率檢測結果如圖3和表3所示，si-HOXB5組細胞凋亡率高于NC組，差異具有統計學意義(P<0.05)。

2.4HOXB5 siRNA對T24細胞STAT3信號通路的影響 Western blot檢測各組細胞p-JAK2、p-STAT3及STAT3信號通路下游凋亡相關的Bax和免疫抑制因子VEGF、TGF-β1的蛋白表達，結果如圖4和表4所示，與NC組比較，si-HOXB5組p-JAK2、p-STAT3、VEGF和TGF-β1的蛋白表達均明顯降低，Bax的蛋白表達明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。

表1 HOXB5在膀胱癌細胞的表達

Tab.1 Expression of HOXB5 in bladder cancer cells

CellsRelative expression of HOXB5 proteinSV-HUC-10.048±0.007T240.656±0.0571)56370.479±0.0481)BIU-870.511±0.0511)F100.350P0.000

Note：1)P<0.05 vs SV-HUC-1.

圖2 HOXB5 siRNA轉染T24細胞后HOXB5蛋白表達電泳圖Fig.2 Electrophoresis of HOXB5 protein after HOXB5 siRNA was transfected into T24 cells

表2 HOXB5 siRNA轉染T24細胞后HOXB5蛋白相對表達量

Tab.2 Relative expression of HOXB5 protein after HOXB5 siRNA was transfected into T24 cells

GroupsRelative expression of HOXB5 proteinBlank group0.508±0.047NC group0.487±0.045si-HOXB5 group0.088±0.0101)F116.304P0.000

Note：1)P<0.05 vs Blank group.

2.5抑制STAT3信號通路對T24細胞凋亡的影響 si-HOXB5或STAT3信號通路抑制劑AG490處理T24細胞后，流式細胞術檢測各組細胞凋亡率，如圖5和表5所示，si-HOXB5+AG490組細胞凋亡率均顯著高于si-HOXB5組(P<0.05)和AG490組(P<0.05)。

圖3 HOXB5 siRNA對T24細胞凋亡的影響Fig.3 Effect of HOXB5 siRNA on apoptosis of T24 cells

表3 HOXB5 siRNA對T24細胞凋亡的影響

Tab.3 Effect of HOXB5 siRNA on apoptosis of T24 cells

GroupsApoptosis rate(%)Blank group3.24±0.21NC group3.08±0.19si-HOXB5 group24.76±1.681)F482.236P0.000

Note：1)P<0.05 vs NC group.

圖4 HOXB5 siRNA對T24細胞STAT3信號通路的影響Fig.4 Effect of HOXB5 siRNA on JAK2/STAT3 signaling pathway in T24 cells

表4 HOXB5 siRNA對T24細胞STAT3信號通路的影響

Tab.4 Effect of HOXB5 siRNA on JAK2/STAT3 signaling pathway in T24 cells

Groupsp-JAK2p-STAT3BaxVEGFTGF-β1Blank group0.202±0.0230.142±0.0130.113±0.0140.506±0.0560.325±0.032NC group0.195±0.0200.158±0.0150.110±0.0130.519±0.0590.341±0.036si-HOXB5 group0.046±0.0071)0.053±0.0081)0.477±0.0481)0.174±0.0211)0.125±0.0151)F71.45162.889150.16548.75751.225P0.0000.0000.0000.0000.000

Note：1)P<0.05 vs NC group.

圖5 抑制STAT3信號通路對T24細胞凋亡的影響Fig.5 Effect of inhibition of STAT3 signaling pathway on apoptosis of T24 cells

表5 抑制STAT3信號通路對T24細胞凋亡的影響

Tab.5 Effect of inhibition of STAT3 signaling pathway on apoptosis of T24 cells

GroupsApoptosis rate(%)si-HOXB5 group25.88±1.77AG490 group16.54±1.09si-HOXB5+AG490 group34.61±2.181)2)F81.002P0.000

Note：1)P<0.05 vs si-HOXB5；2)P<0.05 vs AG490 group.

3 討論

近些年的研究表明，HOX家族的一些基因與膀胱癌的發生發展密切相關。如膀胱癌中HOXB7表達上調，其表達強度與TNM分期及病理分級呈現正相關[9]；HOXA13表達失調與膀胱癌預后不良有關[10]。MiR-193a-3p可靶向HOXC9增強膀胱癌的耐藥性[11]。HOXB5為HOX家族的一個成員，在腫瘤中的研究較少，有研究顯示，口腔鱗癌等腫瘤中HOXB5出現異常表達[12]，膀胱癌中HOXB5表達上調，抑制其表達可降低癌細胞生長[6]，但HOXB5對膀胱癌細胞凋亡及免疫的影響研究尚未明確。RNA干擾(RNAi)是由雙鏈RNA介導的在轉錄后水平阻斷基因表達的技術，具有高效性和特異性，利用該技術可將細胞癌變過程中抑癌基因、癌基因、凋亡相關基因、多藥耐藥基因等特異性封閉，從而達到腫瘤治療的目的，目前已在基因功能研究、腫瘤基因治療等方面有廣泛的應用[13,14]。本研究首先檢測了不同膀胱癌細胞HOXB5的表達，發現膀胱癌T24細胞HOXB5的表達最高，因此選擇T24細胞作為研究對象。通過RNAi技術抑制T24細胞HOXB5表達，發現HOXB5表達受到抑制后T24細胞的凋亡率明顯升高。

腫瘤細胞分泌的免疫抑制分子是其發生免疫逃逸的一個重要機制，可影響一些腫瘤的發生發展。迄今已報道在不同腫瘤細胞可見的免疫分子約有20余種，VEGF、TGF-β1、IL-4、IL-6和IL-10五種免疫抑制分子較為常見。TGF-β1是一種有多種功能的蛋白多肽，生物學特征復雜，與腫瘤發生發展密切相關，可對免疫細胞的增殖起抑制作用[15,16]。VEGF是一個最有效的促血管生長因子[17]，有研究表明，膀胱癌中TGF-β1和VEGF的表達均明顯升高，促進TGF-β1和VEGF表達可參與膀胱癌免疫逃逸[18]。本研究結果顯示，HOXB5表達抑制可降低T24細胞TGF-β1和VEGF表達，這提示抑制HOXB5表達可提高膀胱癌細胞免疫反應。STAT3為STATs家族成員之一，為一類核轉錄因子，參與細胞增殖、凋亡、分化等細胞內信號轉導通路的調控，其異常活化可參與膀胱癌、肺癌等多種人類惡性腫瘤的發生發展，因此被稱為癌基因，阻斷STAT3信號已成為腫瘤治療的新靶點[19,20]。目前已發現JAK2激酶抑制劑AG490為STAT3通路的特異性阻斷劑。有研究表明，AG490可誘導膀胱癌細胞凋亡[21]。此外，也有研究發現，AG490可阻斷肝癌細胞STAT3信號通路，降低TGF-β1和VEGF表達，從而逆轉免疫抑制[22]。Bax為Bcl-2家族成員之一，發揮促凋亡作用[23]。本研究檢測HOXB5表達抑制后p-JAK2、p-STAT3、Bax、VEGF和TGF-β1的表達，發現p-JAK2、p-STAT3、VEGF和TGF-β1的表達明顯受到抑制，Bax表達升高，HOXB5表達抑制與AG490共同處理T24細胞后細胞的凋亡率高于si-HOXB5組和AG490組。這提示抑制HOXB5表達可能通過下調STAT3信號影響T24細胞凋亡及免疫反應。

綜上所述，HOXB5基因表達抑制可誘導膀胱癌細胞凋亡，下調免疫抑制因子VEGF和TGF-β1表達，機制與抑制STAT3信號通路有關。本研究可能為膀胱癌的診療提供了一定的理論基礎。