順鉑聯合長春新堿對HCT-8/V腫瘤細胞耐藥逆轉的實時動態活細胞成像研究①

孫麗娜 張 婷 郭錦錦 余運運 姚新生 孫萬邦

(遵義醫科大學珠海校區/貴州省免疫學研究生教育創新基地，珠海519041)

結直腸癌(Colorectal cancer，CRC)是最常見惡性腫瘤之一，是死亡率較高的腫瘤[1,2]。CRC的發生、發展受多因素的影響，治療以手術切除聯合術后化療為主，然而多藥耐藥(Multidrug resistence，MDR)是造成CRC化療失敗的關鍵原因[3-5]。怎樣提高化療敏感性以及逆轉MDR成為了CRC治療中的關鍵問題[6]。近年來研究證實MDR與細胞凋亡和自噬關系密切[7]。自噬和凋亡作為兩種不同程序性細胞死亡途徑,二者協調地調節細胞存活和細胞死亡[8,9]。細胞凋亡對維持機體內環境的穩態有至關重要的作用[10]。自噬是區別于細胞凋亡的另一種細胞程序性死亡路徑[11,12]。因此，以自噬和凋亡的發生過程、二者間的關聯性及其對腫瘤的影響為方向展開研究，為抗癌治療打開全新的思路。

順鉑(Cisplatin，DDP)在多種腫瘤中常作為首選化療藥，臨床研究表明，對行結直腸癌根治術后的患者使用DDP腹腔持續熱灌注進行化療，可顯著降低復發率和肝轉移率，提高其免疫功能；順鉑與地西他濱或伊利替康聯合應用不僅可以緩解結直腸癌腫瘤生長速度還可以延長生存期[13,14]。而長春新堿(Vincristine，VCR)作為常用化療藥物易產生耐藥性，長春新堿與金絲桃苷或姜黃素聯合應用可產生耐藥逆轉作用[15]。本研究選用DDP與 VCR單獨及聯合用藥對HCT-8/V進行藥物干預研究，采用實時動態活細胞成像(Real-time live-cell imaging，RT-LCI)高內涵技術平臺，觀察HCT-8/V細胞生長、凋亡與自噬，以期為CRC耐藥性的治療提供理論支持。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1腫瘤細胞株 直結腸癌細胞株HCT-8細胞(3111C0001CCC000104)、直結腸癌耐長春新堿細胞株HCT-8/V細胞(3111C0001CCC000486)均由中國醫學科學院提供。

1.1.2儀器與藥物 IncuCyte ZOOM 實時動態活細胞成像系統為美國Essen Bioscience公司產品；順鉑(DDP)、長春新堿(VCR)為Sigma公司產品；CellEventTMCaspase-3/7 Green ReadyProbesTMReagent為Thermo Fisher公司產品；細胞自噬mRFP-GFP-LC3腺病毒由lgebio公司生產。

1.2方法

1.2.1RT-LCI平臺篩選腫瘤細胞生長條件 HCT-8和HCT-8/V細胞在RPMI1640培養基中培養至細胞數目分別為1×103個/ml、1×104個/ml、1×105個/ml，置于RT-LCI平臺觀察HCT-8與HCT-8/V細胞生長規律及對數生長期。

1.2.2RT-LCI平臺觀察腫瘤細胞增殖、凋亡與自噬 取傳代的細胞，分別接種于兩塊96孔培養板，調整細胞數為8 000個/孔，每孔100 μl，37℃培養24 h，待細胞完全貼壁，吸出各孔中培養基。第一板分別設置正常對照組以及16個實驗組，實驗組包括不同濃度DDP(0.5～5 μg/ml)和不同濃度的VCR(1～5 μg/ml)細胞增殖與凋亡實驗組，每組3個孔；DDP(2～4 μg/ml)分別與VCR(1.5 μg/ml)或(2 μg/ml) 聯合實驗組，每組3個孔。另一塊板分別設置HCT-8/V細胞自噬正常對照組以及16個實驗組，實驗組包括不同濃度的DDP(1～5 μg/ml)和不同濃度的VCR(0.5～3 μg/ml)細胞自噬實驗組，每組3個孔；DDP(2～4 μg/ml)分別與VCR(1.5 μg/ml)或(DDP 2 μg/ml)聯合用藥自噬實驗組，每組3個孔。

對實驗組細胞進行免疫熒光染色，加入Apo-488即用型熒光染料、CellEventTMCaspase-3/7 Green ReadyProbesTMReagent凋亡試劑和自噬腺病毒(mRFP-LC3-GFP)分別進行凋亡早期檢測和不同濃度DDP、VCR單獨以及聯合用藥對HCT-8/V自噬進行檢測。將設置好的兩塊96孔板分別置于IncuCyte系統載物臺，共觀察105孔，使用10倍物鏡，每孔每小時拍攝3個視野，第一塊板白光用于觀察每個視野中細胞增殖情況，綠光用于觀察每個視野中細胞凋亡情況；第二塊板白光用于觀察每個視野中細胞增殖情況，綠光用于觀察每個視野中自噬LC3-GFP形成過程，紅光觀察細胞自噬聚合物LC3-RFP形成過程。

2 結果

2.1RT-LCI平臺觀察HCT-8與HCT-8/V細胞生長規律 HCT-8與HCT-8/V細胞用IncuCyte ZOOM實時活細胞成像平臺觀察，細胞增殖結果(見圖1)：HCT-8細胞密度為1×103個/ml時，接種后64 h細胞增殖進入對數生長期，此時細胞融合度達40%，而細胞密度為1×104個/ml時，接種后30 h細胞增殖進入對數生長期，此時細胞融合度達80%。相比HCT-8細胞HCT-8/V細胞生長緩慢，細胞密度為1×103個/ml時，接種后120 h細胞融合度僅僅達到10%，細胞密度為1×104個/ml時，接種后64 h細胞融合度達40%，120 h之后細胞可以達到55%細胞飽和度，延長觀察時間后發現144 h達到對數生長期；HCT-8與HCT-8/V兩株細胞均以1×105個/ml密度鋪板時，因細胞太多不能觀察生長規律。

2.2DDP單獨及聯合應用VCR對HCT-8/V增殖的影響

2.2.1DDP單獨應用對HCT-8/V增殖的影響 應用IncuCyte ZOOM動態觀察DDP(0.5～5 μg/ml)對HCT-8/V(1×104)的抑制作用，結果(圖2)在觀察時間點70 h時DDP(1～5 μg/ml)對HCT-8/V均有抑制作用，與未加藥組比較有統計學意義(P<0.05)。但DDP的抑制作用出現不規律的情況，當DDP為4 μg/ml藥物濃度時抑制細胞增殖的作用效率最強。

圖1 人HCT-8與HCT-8/V細胞不同培養時間生長曲線Fig.1 Growth curve of HCT-8 and HCT-8/V in logarithmic phaseNote: HCT-8 cells were cultured at 1×104 cells/well for 30 h to enter the logarithmic growth phase.HCT-8 reached 100% cell saturation at 45 h;HCT-8/V grew slowly,and 1×104 ml-1 63 h entered the logarithmic growth phase.

2.2.2VCR單獨應用對HCT-8/V增殖的影響 應用IncuCyte ZOOM動態觀察VCR(1～5 μg/ml)對HCT-8/V(1×104)抑制細胞增殖的作用效率表現為明顯的劑量依賴關系，圖3結果顯示，5個不同藥物濃度的VCR干預HCT-8/V細胞增殖后的38 h內各濃度抑制細胞生長無差異，38 h后各濃度抑制作用逐漸加強，抑制作用的強弱與VCR的濃度呈正比，加藥組與未加藥組相比較其細胞增殖抑制率有統計學意義(P<0.05)。

2.2.3DDP聯合VCR對HCT-8/V增殖的影響 DDP(2～4 μg/ml)分別與VCR(1.5 μg/ml)聯合用藥對細胞增殖的影響，結果顯示(見圖4)聯合用藥組細胞增殖抑制率均高于無藥物干預組，藥物聯合組以DDP (2 μg/ml)+VCR(2 μg/ml)濃度聯合抑制作用最強，在加藥后24 h出現明顯的抑制作用，用藥70 h與未加藥組比較有統計學意義(P<0.05)。

2.3DDP、VCR干預對HCT-8/V細胞凋亡的影響 藥物干預對HCT-8/V細胞凋亡的影響，結果顯示(圖5)與對照組比較，DDP(0.5～5 μg/ml)20 h內與VCR(0.5～5 μg/ml)36 h內對HCT-8/V細胞的抑制作用都主要表現在抑制細胞的生長，而不是促進細胞凋亡。DDP與VCR對HCT-8/V細胞凋亡促進作用非常小，差異沒有統計學意義。

圖2 DDP對HCT-8/V增殖的影響結果Fig.2 Effect of DDP on HCT-8/V proliferationNote: Different concentrations of DDP inhibit proliferation of HCT-8/V cells，*.P<0.05 vs normal control(HCT-8/V).

圖3 VCR對HCT-8/V增殖的影響結果Fig.3 Effect of VCR on HCT-8/V proliferationNote: Different concentrations of VCR inhibit proliferation of HCT-8/V cells，*.P<0.05 vs normal control(HCT-8/V).

2.4DDP單獨及聯合應用VCR對HCT-8/V自噬的影響 應用IncuCyte ZOOM觀察DDP(1～5 μg/ml)、VCR(0.5～3 μg/ml)不同濃度單獨及聯合用藥對HCT-8/V(1×104)自噬細胞的影響。

2.4.1DDP單獨應用對HCT-8/V自噬的影響 不同濃度DDP單獨應用對HCT-8/V細胞處理后，用IncuCyte ZOOM觀察細胞自噬，計算每孔自噬體個數。圖6A是70 h未加藥物處理組與不同濃度DDP(1～5 μg/ml)對HCT-8/V細胞處理后的顯微鏡圖像結果，圖中清晰可見有自噬體的形成，其中DDP(2 μg/ml )組與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)，見圖6B。

圖4 DDP聯合VCR對HCT-8/V增殖的影響結果Fig.4 Effect of DDP alone and combined VCR on HCT-8/V proliferationNote: Combination of DDP and VCR inhibits the proliferation of HCT-8/V cells，*.P<0.05 vs normal control(HCT-8/V).

圖5 DDP、VCR干預HCT-8/V細胞70 h內凋亡檢測結果Fig.5 DDP and VCR interfered with HCT-8/V cell apoptosis within 70 hoursNote: A.Effect of DDP on the HCT-8/V cell apoptosis graph(0-70 h)；B.Effect of VCR on the HCT-8/V cell apoptosis graph(0-70 h).

圖6 DDP對HCT-8/V自噬的影響結果Fig.6 Effect of DDP on autophagy of HCT-8/VNote: A.HCT-8/V cells treated with DDP alone at different concentrat-ions were used to observe autophagy using IncuCyte ZOOM.Green light (cell autophagosomes),red light (autophagy),and yellow light (autophagosomes).A1.Non Treated;A2-A6.DDP(1 μg/ml)，(2 μg/ml)，(3 μg/ml)，(4 μg/ml)，(5 μg/ml);B.*.P<0.05 vs normal control(HCT-8/V).

圖7 VCR對HCT-8/V自噬的影響結果Fig.7 Effect of VCR on Autophagy of HCT-8/VNote: A.HCT-8/V cells treated with VCR alone at different concentrations were used to observe autophagy using IncuCyte ZOOM.Green light (cell autophagosomes),red light (autophagy),and yellow light (autophagosomes).A1.Non Treated;A2-A6.VCR(1 μg/ml)，(1.5 μg/ml)，(2 μg/ml)，(3 μg/ml);B.*.P<0.05 vs normal control(HCT-8/V).

2.4.2VCR單獨應用對HCT-8/V自噬的影響 不同濃度VCR單獨應用對HCT-8/V細胞處理后，用IncuCyte ZOOM觀察細胞自噬，計算每孔自噬體個數。圖7A是70 h未加藥物處理組與不同濃度VCR(0.5～3 μg/ml)對HCT-8/V細胞處理后的顯微鏡圖像結果，圖中清晰可見有自噬體的形成，其中VCR(0.5～1.5 μg/ml)組與對照組比較有統計學意義(P<0.05)，見圖7B。

2.4.3DDP聯合VCR對HCT-8/V自噬的影響 DDP(2～4 μg/ml)分別與VCR(1.5 μg/ml)或(2 μg/ml)聯合對HCT-8/V細胞處理后，用IncuCyte ZOOM觀察細胞自噬，計算每孔自噬體個數。圖8是70 h未加藥物處理組與不同濃度DDP(2～4 μg/ml)分別與VCR(1.5 μg/ml)或 (2 μg/ml)聯合處理后的顯微鏡圖像結果，圖中清晰可見有自噬溶酶體的形成，除了DDP(3 μg/ml)+VCR(1.5 μg/ml)與DDP(4 μg/ml)+VCR(1.5 μg/ml)兩個實驗組外，其他實驗組與對照組比較有統計學意義(P<0.01)。

圖8 DDP聯合VCR對HCT-8/V自噬檢測的結果Fig.8 Effect of DDP and combined VCR on HCT-8/V apoptosisNote: A.Combined use of DDP and VCR on HCT-8/V cells for observing autophagy using IncuCyte ZOOM.Green light (cell autophagosomes),red light (autophagy),and yellow light (autophagosomes).A1.Non Treated;A2-A7.DDP(2 μg/ml)+VCR(1.5 μg/ml);DDP(2 μg/ml)+VCR(2 μg/ml);DDP(3 μg/ml)+VCR(1.5 μg/ml);DDP(3 μg/ml)+VCR(2 μg/ml);DDP(4 μg/ml)+VCR(1.5 μg/ml);DDP(4 μg/ml)+VCR(2 μg/ml)；B.*.P<0.05 vs normal control(HCT-8/V).

3 討論

實時動態活細胞成像技術以其高通量、特異性強、靈敏度高、檢測深度較大、定量精確等優點被廣泛應用于細胞增殖、遷移與侵襲、細胞凋亡、免疫細胞殺傷、細胞自噬、三維腫瘤球體成像等細胞檢測[17-23]。常規的腫瘤細胞檢測方法多為終點法，即預先設定某時間點進行觀察[24,25]，該方法明顯的缺點就是無法記錄細胞生長時的實時動態增殖過程，更無法對細胞的生長過程做出準確分析。基于RT-LCI系統的優越性，我們采用IncuCyte ZOOM平臺對HCT-8細胞與HCT-8/V細胞進行篩選，從細胞生長規律觀察發現，HCT-8細胞1×103個/ml濃度時64 h細胞增殖進入對數生長期，1×104個/ml濃度時30 h細胞增殖進入對數生長期，細胞融合度達80%；而HCT-8/V細胞1×103個/ml濃度時120 h細胞融合度僅僅達10%，1×104個/ml濃度時64 h細胞融合度達40%，延長觀察時間后發現144 h達到對數生長期。這一結果為準確研究細胞生長時間、數量提供了參考。基于HCT-8/V生長增殖緩慢，144 h達到對數生長期。根據不同細胞濃度、不同時間結果分析，從兩株細胞同時實驗的可比性出發，實驗選擇細胞濃度1×104個/ml種植更適合生長增殖實時動態觀察。

自噬是一個吞噬自身細胞質蛋白或細胞器并使其包被進入囊泡，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內容物的過程。自噬已經在癌癥中被廣泛研究，自噬可以促進癌細胞的存活，也可以抑制癌癥[26,27]。誘導或抑制自噬在許多疾病中具有潛在價值[28]。自噬抑制可以增加癌細胞對抗癌藥物的毒性和敏感性，耐藥性是癌癥治療中的主要問題，但是對藥物抗腫瘤細胞生長的機制知之甚少。細胞自噬現象存在于結直腸癌細胞中，研究發現其在發生、發展的不同階段，自噬可能起著不同的作用[29]。Sasaki等[30]發現用5-氟尿嘧啶處理結腸癌HT-29細胞可誘導自噬產生，而抑制自噬可增強HT-29細胞對5-氟尿嘧啶的敏感性。近年來研究發現化療耐藥可能與自噬相關。Bao等[31]研究發現自噬可介導卵巢癌細胞A2780對DDP的耐藥，抑制自噬可增強DDP對A2780的細胞毒性。因此，探索自噬在腫瘤發生發展中的這把“雙刃劍”的功能，特別是化療藥物逆轉MDR為結直腸癌治療尋求新的治療靶點提供依據。

順鉑(Cisplatin)為目前常用的金屬鉑類絡合物，具有抗瘤譜廣、作用強、與多種抗腫瘤藥有協同作用、無交叉耐藥等特點，為當前聯合化療中最常用的藥物之一。但對腎、神經系統及胰腺有毒性。能與DNA結合形成交叉鍵，從而破壞DNA的功能不再復制，高濃度時也抑制RNA及蛋白質的合成，為一種周期非特異性藥物[32]。針對結直腸癌耐長春新堿細胞，本研究選用DDP聯合VCR干預HCT-8/V細胞的增殖、凋亡和自噬，實驗結果表明，DDP(0.5～5 μg/ml)、VCR(1～5 μg/ml)單獨應用抑制HCT-8/V細胞增殖，DDP(0.5～5 μg/ml)對HCT-8/V的抑制作用無規律性，而VCR(1～5 μg/ml)對HCT-8/V的抑制作用與VCR的濃度呈劑量依賴性，且與未加藥組相比較其抑制率有統計學意義(P<0.05)；DDP(2～4 μg/ml)分別與VCR(1.5 μg/ml)聯合用藥的細胞增殖抑制率均高于無藥物干預組(P<0.05)，DDP顯著增強VCR對HCT-8/V的生長抑制作用，并能減少VCR的用量。

通過IncuCyte ZOOM系統觀察，HCT-8/V細胞自然增殖過程中伴隨有細胞自噬現象，HCT-8/V細胞增殖受到了抑制作用后，自噬現象也會受到抑制，HCT-8/V細胞有可能通過細胞自噬現象產生了耐藥性，即細胞自噬現象對HCT-8/V細胞的增殖是有利的。本實驗采用DDP聯合VCR干預HCT-8/V細胞的自噬，研究發現DDP(0.5～5 μg/ml)、VCR(1～5 μg/ml) 單獨及聯合應用抑制HCT-8/V細胞自噬，且聯合用藥組對HCT-8/V的增殖與自噬的抑制作用要優于單獨用藥組。

細胞自噬與凋亡關系復雜，有研究報道在執行CRC細胞死亡時，自噬可能與凋亡并存。如Xiong等[33]用purvalanol處理結腸癌HCT116細胞后，在CRC細胞中觀察到自噬和凋亡的連續發生，提示這兩種程序性細胞死亡途徑可能分別驅動細胞死亡。本研究利用IncuCyte ZOOM實時動態活細胞成像系統觀察，參照對照組細胞凋亡水平，可以看出DDP(0.5～5 μg/ml)和VCR(0.5～5 μg/ml)對HCT-8/V細胞的抑制作用，都主要表現在抑制細胞的生長，而不促進細胞凋亡，DDP與VCR對HCT-8/V細胞凋亡的促進作用沒有統計學差異，表明DDP、VCR不能通過凋亡的途徑達到治療HCT-8/V的目的。已有文獻報道，誘導結腸癌HCT-8對VCR耐藥后，耐藥細胞表現為Bax和PUMA缺陷[34]；本實驗DDP聯合VCR抑制自噬但不可促進其凋亡，其機制可能是由于自噬無法在Bax和PUMA缺陷的HCT-8/V細胞誘導，而進一步的機制探討將在后續研究中進行。

綜 上所 述，DDP聯合VCR可抑制HCT-8/V細胞的增殖，誘導細胞自噬，DDP聯合VCR通過抑制細胞增殖與誘導細胞自噬實現耐藥性逆轉。