轉錄因子c-Jun對人血管平滑肌細胞中線粒體融合基因2表達調控作用的實驗研究

李 笑 羅興才 王佐廣 吳瓊 辛毅 劉潔琳 劉雅 魏永祥

增殖性心血管疾病（proliferative cardiovascular diseases，PCVDs）如動脈粥樣硬化、動脈損傷后再狹窄和高血壓等是導致全球人類死亡的主要原因之一，其特征是血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）遷移、增殖和細胞外基質的合成［1］。 值得注意的是，VSMCs增殖在PCVDs中的作用尚未完全闡明［2］。因而，探討VSMCs的增殖機制并找出調節其增殖的關鍵物質，已成為防治高血壓、冠心病等各種PCVDs的重點［3］。

2004年，陳光慧等發現的一種基因線粒體融合基因2（Mitofusin 2，Mfn2）在自發性高血壓大鼠（SHRs） 的VSMCs、 心臟、大腦中的表達顯著下調［4］。迄今為止，雖然Mfn2對VSMCs增殖的負向調控作用已明確，但Mfn2的轉錄調控機制仍未完全闡明［4-5］。

激活蛋白1（activator protein 1，AP1）是一種重要的核轉錄因子，以高度保守的二聚體堿性亮氨酸拉鏈（bZIP）DNA結合域為特征，是由Jun（v-Jun、c-Jun、JunB和JunD）、Fos（v-Fos、c-Fos、Fos b、Fra-1和Fra-2）、ATF（ATF2、ATF3/LRF1、B-ATF、JDP1和JDP2） 和MAF（c-Maf、MafB、MafA、MafG/F/K和Nrl）蛋白家族組成的同源或異源二聚體，其中典型的是由c-Jun與c-Fos組成的異源二聚體［6］。大量證據表明AP1經過AKT1/AP1［7］、JNK和AP1［8］等多種信號通路參與了VSMCs的增殖。

本研究的目的是探討轉錄因子c-Jun對人血管平滑肌細胞（hVSMCs）中Mfn2表達的調控作用，為Mfn2在EH、冠心病及其他PCVDs的表達下調提供線索并提供其潛在的治療靶點，同時為預防血管成形術后再狹窄和冠狀動脈旁路移植術后再狹窄提供參考。

材料與方法

1.siRNA、慢病毒載體與試劑 c-Jun siRNA及對照siRNA購自廣州市銳博生物科技有限公司，EntransterTM-R4000轉染試劑購自英格恩生物公司。c-Jun基因過表達慢病毒載體（GV358）和空載體、感染添加劑、感染增強溶液購自上海吉凱基因化學技術有限公司。

2.細胞培養與處理 hVSMCs來源于正常人主動脈的中間層，購自上海信裕生物科技有限公司。將細胞置于常規培養皿內，以添加了10%胎牛血清（Gibco）、100 U/mL鏈霉素和100 mg/mL青霉素的DMEM（Thermo Scientific）為培養基，培養環境為37℃含5%CO2飽和濕度的細胞培養箱，培養基隔天更換，3～4 d達到融合。

3.siRNA轉染 提前24 h將hVSMCs以3×105個細胞/2 mL/孔的密度接種到6孔板中，然后轉染時即鋪板第二天細胞匯合度約為30%。依照轉染試劑EntransterTM-R4000說明進行siRNA轉染。轉染體系為每孔:2.412μg siRNA，3.6μL EntransterTM-R4000，轉染并繼續培養26 h后，分別提取細胞RNA、蛋白進行RT-PCR、Western blot分析結果。c-Jun siRNA靶序列為:5'-CAAACCTCAGCAACTTCAA-3'。

圖1 慢病毒載體（GV358）及克隆位點圖譜（MCS為多克隆位點）

4.慢病毒轉染 提前一天用完全培養基制備密度為3×104個/mL的hVSMCs細胞懸液，并將hVSMCs以3×104個細胞/2 mL/孔的密度接種到6孔板中。利用由上海吉凱基因技術有限公司構建的攜帶c-Jun基因過表達慢病毒載體（GV358，圖1）的慢病毒轉染hVSMCs，轉染體系見表1。轉染10 h后，換回常規培養基繼續培養。轉染約96 h，熒光表達豐度較高時，用顯微鏡觀察，然后分別提取細胞RNA、蛋白做進一步實驗（RT-PCR、Western blot）分析結果。

表1 慢病毒轉染體系

5.RT-PCR檢測細胞c-Jun和Mfn2的mRNA水平 根據Trizol試劑（Invitrogen）從hVSMCs中提取總RNA。按照cDNA反轉錄試劑盒（Promega）將總RNA逆轉錄成cDNA。測定RNA濃度和純度后進行PCR擴增。引物用Primer-BLAST進行設計（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

6.Western blot法檢測細胞c-Jun和Mfn2的蛋白水平用含有蛋白酶抑制劑混合物的RIPA裂解緩沖液（北京康為世紀生物科技有限公司）提取hVSMCs總蛋白。根據BCA蛋白檢測試劑盒（Thermo Scientific）測定蛋白濃度。用10% SDSPAGE凝膠將蛋白樣品電泳分離，然后轉移到PVDF膜（Millipore）上，用5% BSA封閉液室溫封閉1 h，分別對應加入一抗c-Jun（No.9165；Cell Signaling，1∶1 000），Mfn2（No.11925；Cell Signaling，1∶1 000），和GAPDH（No.GA003-R； 北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，1∶2 500），4℃搖床上孵育過夜。用TBST緩沖液（北京康為世紀生物科技有限公司）洗膜3次，10 min/次。用IRDye 680RD?山羊抗兔（No.926-68071；LI-COR，Inc.，1∶10 000）室溫孵育1 h。使用Odyssey紅外成像系統（基因公司）掃描和光密度分析。

7.統計學方法 使用SPSS 20.0軟件進行統計分析。計量資料用均數±標準差表示。通過單因素方差分析（ANOVA）和LSD post hoc比較得出多重比較的P值。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

結 果

1.Mfn2在轉錄因子c-Jun敲除hVSMCs中的表達情況 在光鏡下，siRNA干擾組hVSMCs數目較陰性siRNA對照組和正常對照組明顯增加（圖2 A）。此外，在熒光顯微鏡下觀察培養的hVSMCs中Cy3的表達，經熒光標記的非靶向siRNA處理的hVSMCs中有大量的亮紅色熒光，表明其轉染效率較高。進一步用RT-PCR在培養的hVSMCs中檢測到Mfn2的表達（圖2B），siRNA干擾組（0.671±0.061）明顯低于陰性siRNA對照組（1.110±0.080，P＜0.01）和正常對照組（1.000±0，P＜0.01）。 此外，與陰性siRNA對照組（1.042±0.039，P＜0.01）和正常對照組（1.000±0，P＜0.01）相比，用Western blot檢測到siRNA干擾組（0.571±0.049）Mfn2蛋白水平（圖2C）顯著降低。

2.過表達c-Jun后hVSMCs中Mfn2的表達情況 轉染慢病毒并繼續培養96 h后，用熒光顯微鏡察看培養的hVSMCs中EGFP的表達狀況。病毒組有大量亮綠色熒光（圖3 A），這表明轉染效率相對較高。進一步用RT-PCR檢測到慢病毒過表達組（1.414±0.063）在培養的hVSMCs中Mfn2 mRNA的表達（圖3B）明顯高于陰性病毒對照組（1.056±0.020，P＜0.01）和正常對照組（1.000±0，P＜0.01）。此外，與陰性病毒對照組（1.089±0.026，P＜0.01）和正常對照組（1.000±0，P＜0.01）相比，用Western blot檢測到慢病毒過表達組（1.449±0.044）Mfn2蛋白水平（圖3C）顯著升高。值得注意的是，慢病毒轉染96 h后，在光鏡下觀察到慢病毒過表達組的hVSMCs數量明顯低于陰性病毒對照組和正常對照組（圖3 A）。

討 論

在前期研究中，我們已經報道了Mfn2的表達在高血壓患者的血管組織和VSMCs中明顯低于對照組，且在SHR VSMCs內顯著低于WKY大鼠［9-11］。關于Mfn2基因的轉錄調控機制方面，目前國內、外已經進行了一些研究，如Sorianello E等的研究報道轉錄因子特異性蛋白質1（Sp1）是VSMCs中正向調控Mfn2表達的關鍵因子之一［12］。然而，他們僅部分闡明了Mfn2表達的調控機制，且轉錄因子在基因表達調控中發揮著十分重要的作用，因此研究除Sp1外的其他轉錄因子對Mfn2的調控非常重要。

表2 所用引物序列、退火溫度及其擴增產物片段的大小

圖2 siRNA敲減c-Jun抑制了培養的hVSMCs中Mfn2 mRNA和蛋白的表達 A:不同siRNA轉染26 h后，光鏡下hVSMCs的增殖情況；B:以GAPDH為對照的代表性RT-PCR及c-Jun和Mfn2的mRNA表達定量:Mfn2、c-Jun和GAPDH（n=3）。 與正常對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與陰性siRNA對照組相比，?P＜0.05，??P＜0.01；C:以GAPDH為對照的代表性蛋白質印跡及c-Jun和Mfn2的蛋白表達定量:Mfn2、c-Jun和GAPDH（n=3）。與正常對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與陰性siRNA對照組相比，?P＜0.05，??P＜0.01

圖3 過表達c-Jun促進了培養的hVSMCs中Mfn2 mRNA和蛋白的表達 A:用攜帶不同慢病毒載體的慢病毒處理培養的hVSMCs 96 h后，熒光顯微鏡下EGFP的表達和hVSMCs的增殖情況；B:未轉染或用攜帶過表達c-Jun基因慢病毒載體的慢病毒轉染培養的hVSMCs后，c-Jun對hVSMCs中Mfn2 mRNA表達的影響。以GAPDH為對照的代表性RT-PCR及c-Jun和Mfn2的mRNA表達定量:Mfn2、c-Jun和GAPDH（n=3）。 與正常對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與陰性對照病毒組相比，?P＜0.05，??P＜0.01；C:以GAPDH為對照的代表性蛋白質印跡及c-Jun和Mfn2的蛋白表達定量:Mfn2、c-Jun和GAPDH（n=3）。與正常對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與陰性對照病毒組相比，?P＜0.05，??P＜0.01

目前已證實人類c-Jun定位于1號染色體短臂32.1部位。轉錄因子c-Jun通過靶基因如EGFR和FAS等參與了廣泛的細胞進程，包括增殖、分化和凋亡［13］。許多研究已報道c-Jun通過轉錄調控調節涉及VSMCs增殖、遷移、ROS產生和胞外基質降解的細胞過程的多種基因，在VSMCs增殖中起著重要作用［14-15］。由于已有大量研究表明Mfn2在增殖的VSMCs中 低 表 達［5］，c-Jun也 與VSMCs增 殖 有關［14］，因此，我們推測Mfn2可能是轉錄因子c-Jun的潛在靶基因之一，并且我們前期生物信息學分析發現Mfn2基因啟動子區存在著c-Jun結合位點。然而，目前尚未檢索到國、內外對于c-Jun與Mfn2相關的報道。

為了闡明c-Jun對Mfn2的調控作用，本研究首先采用了比較經典可靠的RNA干擾實驗。發現用c-Jun siRNA處理培養的hVSMCs沉默靶基因c-Jun后（圖2），與陰性siRNA對照和正常對照組相比，siRNA干擾組Mfn2 mRNA和蛋白的表達均顯著降低，且差異具有統計學意義（P＜0.01），而hVSMCs的數量明顯增多，表明c-Jun siRNA在培養的hVSMCs中干擾成功，且能抑制Mfn2的表達并促進hVSMCs的增殖。

本研究進一步應用慢病毒過表達載體將c-Jun基因轉入hVSMCs。研究結果顯示，當hVSMCs被攜帶c-Jun基因過表達慢病毒載體的慢病毒轉染后（圖3），慢病毒過表達組Mfn2 mRNA和蛋白的表達均顯著增多，且差異具有統計學意義（P＜0.01），而hVSMCs的數量明顯減少，提示過表達c-Jun可以促進Mfn2的表達從而抑制hVSMCs的增殖。結合RNA干擾實驗的結果，可以得知c-Jun在轉錄水平上能正向調控Mfn2的表達；而且在翻譯水平上，c-Jun與Mfn2的表達趨勢也一致。在調控機制方面，由于Mfn2基因啟動子區存在多個轉錄因子結合位點，因此，c-Jun對Mfn2的調控機制也可能是通過與其啟動子區結合實現的。此外，本研究表明hVSMCs的增殖隨Mfn2基因表達的變化而出現相應的變化，這與以前的研究結果即Mfn2可以負向調控VSMCs的增殖一致［9-10］。

關于Mfn2調控VSMCs增殖方面，已有研究報道Mfn2通過抑制ras-raf-MEK/MAPK信號通路的表達進而抑制VSMCs增殖［4］，值得注意的是，c-Jun在VSMCs增殖中的作用也與ras-raf-MEK/MAPK信號通路有關［16］，因而，c-Jun在VSMCs增殖中的調控作用可能是通過Mfn2基因與此信號通路關聯的，具體機制仍需進一步研究驗證。

綜上所述，本研究首次證明c-Jun在培養的hVSMCs中調控Mfn2的表達。下調c-Jun的表達可以導致培養的hVSMCs中Mfn2 mRNA和蛋白的表達均顯著降低；而上調c-Jun的表達可引起培養的hVSMCs中Mfn2 mRNA和蛋白的表達顯著增加，并影響hVSMCs增殖。因此，c-Jun可能是一種新的調節Mfn2表達的轉錄調節因子，這為Mfn2在EH和其他PCVDs增殖的hVSMCs中低表達的進一步研究提供了參考。