慢性間歇低氧對(duì)小鼠心肌低氧誘導(dǎo)因子-2α和β3腎上腺素能受體表達(dá)及心功能的影響

王 越 郝文靜 李宜嘉 王悅 吳小凡

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征（obstructive sleep apnea，OSA）是以慢性間歇低氧（chronic intermittent hypoxia，CIH）為主要病理特征的疾病，好發(fā)于肥胖人群。臨床研究證實(shí)，OSA是肥胖患者發(fā)生心力衰竭的危險(xiǎn)因素［1］。低氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor，HIF）2是機(jī)體生理性和病理性缺氧條件下發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子，由功能亞基α和結(jié)構(gòu)亞基β構(gòu)成，已有研究表明HIF-2α與心室重構(gòu)相關(guān)［2］，但是其參與心室重構(gòu)的具體機(jī)制尚未闡明。β3腎上腺素能受體（β3 adrenergic receptors，β3 AR）是廣泛表達(dá)于血管、心肌等組織的一類β腎上腺素能受體，具有調(diào)節(jié)鈉鉀泵、鈣離子通道等作用，近年來(lái)成為心力衰竭研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)［3］。然而，CIH對(duì)心肌β3 AR的表達(dá)是否具有調(diào)節(jié)作用尚未明確。本實(shí)驗(yàn)以高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠建立肥胖模型，探究CIH刺激對(duì)肥胖小鼠心肌HIF-2α和 β3 AR的調(diào)節(jié)作用及對(duì)心功能的影響，為揭示OSA促進(jìn)肥胖患者心力衰竭發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

1.研究材料 （1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無(wú)特定病原體級(jí)，ApoE-/-雄性小鼠，6～7周齡，體質(zhì)量（25±3）g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房?jī)?nèi)正常飼養(yǎng)，符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的要求。

（2）主要實(shí)驗(yàn)試劑 高脂飼料（含21%脂肪，0.15%膽固醇）購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司；蘇木素染液購(gòu)于上海碧云天公司；HIF-2α多克隆抗體、β3 AR多克隆抗體均購(gòu)于美國(guó)Abcam公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗、DAB顯色劑均購(gòu)于北京中杉金橋公司；蛋白定量試劑盒購(gòu)于賽默飛世爾科技有限公司；GAPDH多克隆抗體購(gòu)于北京普利萊基因技術(shù)有限公司。

2.方法 （1）動(dòng)物模型及分組6～7周齡無(wú)特定病原體級(jí)ApoE-/-雄性小鼠24只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為三組:對(duì)照組（n=8）:普通飼料喂養(yǎng)，無(wú)特殊處理；高脂組（n=8）:高脂飼料喂養(yǎng)12周；高脂+低氧組（n=8）:高脂飼料喂養(yǎng)4周后，將ApoE-/-小鼠放入低氧艙內(nèi)，以計(jì)算機(jī)控制艙內(nèi)氧濃度在30 s內(nèi)降至6.0%，維持5 s后向艙內(nèi)充入氧氣，在30 s內(nèi)將艙內(nèi)氧濃度升至21.0%，維持5 s后向艙內(nèi)充入氮?dú)猓?0 s為一個(gè)循環(huán)，低氧組小鼠每天在艙內(nèi)8 h，持續(xù)8周，艙內(nèi)溫度、濕度與室內(nèi)相同［4］。

（2）心臟多普勒超聲測(cè)量 8周的慢性間歇低氧結(jié)束后，采用VisualSonics Vevo 2100型超聲儀對(duì)小鼠進(jìn)行心臟多普勒超聲測(cè)量。將ApoE-/-小鼠稱重麻醉后剃去胸前毛發(fā)，固定于操作臺(tái)，將30 MHz的探頭置于左胸前，調(diào)整角度以獲得左心室的長(zhǎng)軸切面，在此切面將M型取樣線分別置于二尖瓣、乳頭肌、主動(dòng)脈根部及心尖部等部位，獲得相應(yīng)M型曲線，進(jìn)行測(cè)量；將探頭順時(shí)針轉(zhuǎn)動(dòng)900，獲得左心室短軸的各個(gè)切面。測(cè)量指標(biāo)包括:舒張末期室間隔厚度（IVSd）、收縮末期室間隔厚度（IVSs）、舒張末期左心室內(nèi)徑（LVIDd）、收縮末期左心室內(nèi)徑（LVIDs）、左心室后壁舒張末期厚度（LVPWd）、左心室后壁收縮末期厚度（LVPWs），根據(jù)所得指標(biāo)計(jì)算:左心室舒張末期容積（EDV）:EDV=［7/（2.4+LVIDd）］×LVIDd3；左心室收縮末期容積（ESV）:ESV=［7/（2.4+LVIDs）］×LVIDs3；LVEF:EF=100%×（EDV-ESV）/EDV；左心室短軸縮短分?jǐn)?shù)（FS）:FS=100%×（LVIDd-LVIDs）/LVIDd［5］。

（3）心肌HIF-2α免疫組織化學(xué)染色 超聲測(cè)量結(jié)束后剪開(kāi)小鼠胸腔，用冰肝素0.9%氯化鈉液經(jīng)心尖灌至內(nèi)臟組織變白后，分離心臟。取部分心臟組織浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定36～48 h，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度約5μm。各組小鼠心臟組織石蠟切片脫蠟后以3%過(guò)氧化氫室溫處理15 min，牛血清封閉1 h后以HIF-2α抗體（1∶200）4℃孵育過(guò)夜，羊抗兔二抗室溫孵育1 h后進(jìn)行DAB顯色，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為HIF-2α蛋白陽(yáng)性表達(dá)［6］。每只小鼠選3張切片，100倍視野下攝相，每張切片取2個(gè)視野，計(jì)算每個(gè)視野內(nèi)陽(yáng)性面積占組織總面積的百分比。

（4）心肌β3 AR免疫印跡實(shí)驗(yàn) 取各組小鼠新鮮心臟組織，稱重后按照組織質(zhì)量:裂解液體積為1∶9的比例加入組織裂解液，制備心臟組織勻漿，利用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用5%牛奶封閉液封閉1 h，加入一抗 β3 AR（1∶2 000）、GAPDH（1∶1 000），4℃孵育過(guò)夜，以羊抗兔二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，膠片發(fā)光，掃描分析各條帶吸光度值［7］。

圖1 三組小鼠心臟多普勒超聲經(jīng)線測(cè)量圖

圖2 各組小鼠心肌組織HIF-2α表達(dá)水平A:免疫組織化學(xué)染色示HIF-2α在各組小鼠心臟組織中的定位表達(dá)情況（標(biāo)尺為25um）；B:各組小鼠心臟組織HIF-2α陽(yáng)性面積占總面積的比例n=5～8），注:高脂組與對(duì)照組相比，△P＜0.05；高脂+低氧組與對(duì)照組相比，*P＜0.05；高脂+低氧組與高脂組相比，#P＜0.05

圖3 各組小鼠心肌組織β3 AR表達(dá)水平 A:各組小鼠心肌組織GAPDH和 β3 AR蛋白條帶；B:各組小鼠心肌組織β3 AR條帶吸光度值（n=6）；C:各組小鼠心肌組織GAPDH條帶吸光度值（n=6）。注:高脂組與對(duì)照組相比，△P＜0.05；高脂+低氧組與對(duì)照組相比，*P＜0.05；高脂+低氧組與高脂組相比，# P＜0.05

表1 三組小鼠心臟多普勒超聲測(cè)量結(jié)果（）

表1 三組小鼠心臟多普勒超聲測(cè)量結(jié)果（）

注:與對(duì)照組比較，#P＜0.05；與高脂組比較，*P＜0.05

項(xiàng)目 對(duì)照組（n=8） 高脂組（n=8） 高脂+低氧組（n=8） F值 P值IVSd/（mm） 0.641±0.134 0.790±0.100 0.664±0.180 1.279 0.324 IVSs/（mm） 0.839±0.203 0.840±0.136 0.874±0.366 0.024 0.976 LVIDd/（mm） 3.455±0.154 3.567±0.312 4.188±0.107#* 14.169 0.002 LVIDs/（mm） 1.733±0.180 1.997±0.494 2.924±0.248#* 13.873 0.002 LVPWd/（mm） 0.569±0.044* 0.769±0.084# 0.948±0.128#* 17.065 0.001 LVPWs/（mm） 0.842±0.081 1.010±0.272 1.524±0.323#* 8.191 0.009 EDV/（uL） 49.423±5.269 53.702±11.769 78.120±4.708#* 15.263 0.001 ESV/（uL） 8.956±2.485 13.728±7.232 33.172±7.129#* 18.065 0.001 LVEF/% 81.472±6.428 74.862±11.798 57.603±8.194#* 7.360 0.013 FS/% 49.645±6.868 44.205±12.157 30.197±5.342#* 5.405 0.029

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 24.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，三組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.多普勒超聲測(cè)量各組小鼠心臟結(jié)構(gòu)與功能多普勒超聲結(jié)果顯示:各組小鼠室間隔厚度無(wú)明顯差異；無(wú)論與對(duì)照組小鼠還是高脂組小鼠相比，高脂+低氧組小鼠左心室內(nèi)徑和左心室后壁厚度均增加，LVEF和短軸縮短分?jǐn)?shù)均減少，提示CIH使ApoE-/-小鼠左心室擴(kuò)張、心功能減低（圖1，表1）。

2.免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)心肌內(nèi)HIF-2α的表達(dá) 免疫組織化學(xué)染色可見(jiàn)HIF-2α在對(duì)照組小鼠的心肌組織中無(wú)明顯表達(dá)，在高脂組和高脂+低氧組小鼠的心肌組織中均有表達(dá)（圖2 A），高脂組和低氧組HIF-2α的陽(yáng)性比例分別為（2.98±1.03）%和（10.94±1.68）%（圖2 B），低氧組小鼠的心臟組織中HIF-2α水平明顯高于對(duì)照組和高脂組（均P＜0.05）。

3.蛋白免疫印跡檢測(cè) β3 AR在心肌組織的表達(dá)免疫印跡檢測(cè)可見(jiàn)β3 AR在各組小鼠的心肌組織中均有表達(dá)，與對(duì)照組和高脂組小鼠相比，高脂+低氧組小鼠的心肌組織中 β3 AR表達(dá)量明顯上調(diào)。高脂+低氧組、高脂組和對(duì)照組小鼠心肌組織GAPDH蛋白條帶的吸光度值分別為（253 737.40±14 954.00）（256 692.25±6 584.46）和（266 384.00±31 306.30），各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；β3 AR蛋白條帶的吸光度值分別為（235 302.40±14 552.94），（173 631.25±7 014.01）和（140 720.33±2 976.35），P＜0.05（圖3 A～C）。

討 論

OSA多發(fā)于肥胖人群，以夜間睡眠中反復(fù)發(fā)生上氣道塌陷和CIH為首要病理表現(xiàn)。已有臨床研究表明OSA可使無(wú)基礎(chǔ)心臟疾病的肥胖患者心臟舒張功能減低［8］、促進(jìn)心室重構(gòu)［1］，Warbrick等［9］發(fā)現(xiàn)，合并OSA的肥胖患者發(fā)生射血分?jǐn)?shù)保留的心力衰竭的比例明顯增加。基礎(chǔ)研究［2］發(fā)現(xiàn)在CIH環(huán)境下，脂肪組織中HIF-2α表達(dá)明顯上調(diào)，并參與心室重構(gòu)，但是具體機(jī)制尚不明確。近年來(lái)，β3 AR因其具有調(diào)節(jié)鈉鉀泵、鈣離子通道等作用而成為心力衰竭領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，但是CIH是否會(huì)影響 β3 AR在心肌組織中的表達(dá)進(jìn)而影響心功能尚不明確。本實(shí)驗(yàn)利用高脂飼料喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠構(gòu)建肥胖模型，在CIH刺激下探究其對(duì)小鼠心肌組織中HIF-2α和β3 AR表達(dá)及心臟功能的影響，為揭示CIH促進(jìn)心力衰竭的具體機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們以ApoE-/-小鼠為研究對(duì)象，通過(guò)高脂飲食喂養(yǎng)建立肥胖模型，發(fā)現(xiàn)與單一高脂喂養(yǎng)相比，CIH聯(lián)合高脂飲食喂養(yǎng)8周后，ApoE-/-小鼠的左心室出現(xiàn)明顯擴(kuò)張、心功能明顯下降，與既往臨床研究［1］提示OSA促進(jìn)肥胖患者心力衰竭進(jìn)展的結(jié)論一致。在以上實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步探究CIH對(duì)心肌組織中HIF-2α和 β3 AR表達(dá)的影響。

Lin等［10］發(fā)現(xiàn)肥胖小鼠的脂肪組織中HIF-2α明顯上調(diào)，HIF-2α可能通過(guò)調(diào)節(jié)脂肪組織內(nèi)的炎癥反應(yīng)促進(jìn)心室重構(gòu)，敲除脂肪組織中的HIF-2α可阻止心肌肥厚、心室重構(gòu)的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)生理狀態(tài)下的對(duì)照組ApoE-/-小鼠心肌組織中幾乎不表達(dá)HIF-2α，但是CIH條件下，伴隨著左心室擴(kuò)張和心功能下降，心肌組織中的HIF-2α水平明顯上調(diào)，據(jù)此我們推測(cè)HIF-2α在CIH誘導(dǎo)的心力衰竭中發(fā)揮一定作用。

已有臨床試驗(yàn)證實(shí)給予β3 AR特異性激動(dòng)劑米拉貝隆活化心肌組織中的 β3 AR，可改善慢性心力衰竭患者的預(yù)后［11］；大量基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)活化的β3 AR可以通過(guò)調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞表面的鈉鉀泵、鈣離子通道狀態(tài)和心肌細(xì)胞內(nèi)一氧化氮含量而維持心肌細(xì)胞的舒縮活性［12-14］。大量研究證實(shí)CIH可通過(guò)誘導(dǎo)心肌去甲腎上腺素水平增加，進(jìn)而導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大、心室重構(gòu)［1，15-17］，Watts等［18］發(fā)現(xiàn)在去甲腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞肥大的過(guò)程中，β3 AR基因表達(dá)增加、受體數(shù)量上調(diào)，其下游活性物質(zhì)環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷水平下降，給予β3 AR激動(dòng)劑后，β3 AR受體數(shù)量減少、下游活性物質(zhì)水平增加，心肌細(xì)胞表面積縮小。以上研究提示在心肌細(xì)胞肥大、心室重構(gòu)的病理進(jìn)程中，存在β3 AR活性下降、數(shù)量代償性增加的病理改變。本實(shí)驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn)在CIH刺激下，ApoE-/-小鼠心肌組織中 β3 AR的蛋白含量明顯增多，提示CIH使β3 AR活性受損進(jìn)而引起該受體數(shù)量的代償性增多。另外有研究發(fā)現(xiàn)在脂肪組織中HIF-2α可調(diào)節(jié) β3 AR活性［19］，但是在CIH誘導(dǎo)心室肥厚的病理進(jìn)程中，是否同樣存在HIF-2α對(duì)β3 AR活性的靶向抑制作用，仍需要進(jìn)一步探究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CIH上調(diào)心肌組織中HIF-2α和β3 AR表達(dá)，引起左心室擴(kuò)張、心功能受損。HIF-2α和β3 AR有望成為預(yù)防肥胖合并OSA患者發(fā)生心力衰竭的重要靶點(diǎn)。