慢性間歇低氧對小鼠心肌低氧誘導因子-2α和β3腎上腺素能受體表達及心功能的影響

王 越 郝文靜 李宜嘉 王悅 吳小凡

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征（obstructive sleep apnea，OSA）是以慢性間歇低氧（chronic intermittent hypoxia，CIH）為主要病理特征的疾病，好發于肥胖人群。臨床研究證實，OSA是肥胖患者發生心力衰竭的危險因素［1］。低氧誘導因子（hypoxia inducible factor，HIF）2是機體生理性和病理性缺氧條件下發揮調節作用的轉錄因子，由功能亞基α和結構亞基β構成，已有研究表明HIF-2α與心室重構相關［2］，但是其參與心室重構的具體機制尚未闡明。β3腎上腺素能受體（β3 adrenergic receptors，β3 AR）是廣泛表達于血管、心肌等組織的一類β腎上腺素能受體，具有調節鈉鉀泵、鈣離子通道等作用，近年來成為心力衰竭研究領域的熱點［3］。然而，CIH對心肌β3 AR的表達是否具有調節作用尚未明確。本實驗以高脂飲食喂養ApoE-/-小鼠建立肥胖模型，探究CIH刺激對肥胖小鼠心肌HIF-2α和 β3 AR的調節作用及對心功能的影響，為揭示OSA促進肥胖患者心力衰竭發生發展的具體機制提供實驗依據。

材料與方法

1.研究材料 （1）實驗動物 無特定病原體級，ApoE-/-雄性小鼠，6～7周齡，體質量（25±3）g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。實驗動物在首都醫科大學附屬北京安貞醫院實驗動物房內正常飼養，符合實驗動物倫理委員會的要求。

（2）主要實驗試劑 高脂飼料（含21%脂肪，0.15%膽固醇）購自北京華阜康生物科技股份有限公司；蘇木素染液購于上海碧云天公司；HIF-2α多克隆抗體、β3 AR多克隆抗體均購于美國Abcam公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗、DAB顯色劑均購于北京中杉金橋公司；蛋白定量試劑盒購于賽默飛世爾科技有限公司；GAPDH多克隆抗體購于北京普利萊基因技術有限公司。

2.方法 （1）動物模型及分組6～7周齡無特定病原體級ApoE-/-雄性小鼠24只，適應性喂養1周后隨機分為三組:對照組（n=8）:普通飼料喂養，無特殊處理；高脂組（n=8）:高脂飼料喂養12周；高脂+低氧組（n=8）:高脂飼料喂養4周后，將ApoE-/-小鼠放入低氧艙內，以計算機控制艙內氧濃度在30 s內降至6.0%，維持5 s后向艙內充入氧氣，在30 s內將艙內氧濃度升至21.0%，維持5 s后向艙內充入氮氣，70 s為一個循環，低氧組小鼠每天在艙內8 h，持續8周，艙內溫度、濕度與室內相同［4］。

（2）心臟多普勒超聲測量 8周的慢性間歇低氧結束后，采用VisualSonics Vevo 2100型超聲儀對小鼠進行心臟多普勒超聲測量。將ApoE-/-小鼠稱重麻醉后剃去胸前毛發，固定于操作臺，將30 MHz的探頭置于左胸前，調整角度以獲得左心室的長軸切面，在此切面將M型取樣線分別置于二尖瓣、乳頭肌、主動脈根部及心尖部等部位，獲得相應M型曲線，進行測量；將探頭順時針轉動900，獲得左心室短軸的各個切面。測量指標包括:舒張末期室間隔厚度（IVSd）、收縮末期室間隔厚度（IVSs）、舒張末期左心室內徑（LVIDd）、收縮末期左心室內徑（LVIDs）、左心室后壁舒張末期厚度（LVPWd）、左心室后壁收縮末期厚度（LVPWs），根據所得指標計算:左心室舒張末期容積（EDV）:EDV=［7/（2.4+LVIDd）］×LVIDd3；左心室收縮末期容積（ESV）:ESV=［7/（2.4+LVIDs）］×LVIDs3；LVEF:EF=100%×（EDV-ESV）/EDV；左心室短軸縮短分數（FS）:FS=100%×（LVIDd-LVIDs）/LVIDd［5］。

（3）心肌HIF-2α免疫組織化學染色 超聲測量結束后剪開小鼠胸腔，用冰肝素0.9%氯化鈉液經心尖灌至內臟組織變白后，分離心臟。取部分心臟組織浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定36～48 h，常規石蠟包埋，連續切片，厚度約5μm。各組小鼠心臟組織石蠟切片脫蠟后以3%過氧化氫室溫處理15 min，牛血清封閉1 h后以HIF-2α抗體（1∶200）4℃孵育過夜，羊抗兔二抗室溫孵育1 h后進行DAB顯色，細胞質中出現黃色或棕黃色顆粒為HIF-2α蛋白陽性表達［6］。每只小鼠選3張切片，100倍視野下攝相，每張切片取2個視野，計算每個視野內陽性面積占組織總面積的百分比。

（4）心肌β3 AR免疫印跡實驗 取各組小鼠新鮮心臟組織，稱重后按照組織質量:裂解液體積為1∶9的比例加入組織裂解液，制備心臟組織勻漿，利用BCA法測定蛋白質含量。進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉移到硝酸纖維素膜上，用5%牛奶封閉液封閉1 h，加入一抗 β3 AR（1∶2 000）、GAPDH（1∶1 000），4℃孵育過夜，以羊抗兔二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，膠片發光，掃描分析各條帶吸光度值［7］。

圖1 三組小鼠心臟多普勒超聲經線測量圖

圖2 各組小鼠心肌組織HIF-2α表達水平A:免疫組織化學染色示HIF-2α在各組小鼠心臟組織中的定位表達情況（標尺為25um）；B:各組小鼠心臟組織HIF-2α陽性面積占總面積的比例n=5～8），注:高脂組與對照組相比，△P＜0.05；高脂+低氧組與對照組相比，*P＜0.05；高脂+低氧組與高脂組相比，#P＜0.05

圖3 各組小鼠心肌組織β3 AR表達水平 A:各組小鼠心肌組織GAPDH和 β3 AR蛋白條帶；B:各組小鼠心肌組織β3 AR條帶吸光度值（n=6）；C:各組小鼠心肌組織GAPDH條帶吸光度值（n=6）。注:高脂組與對照組相比，△P＜0.05；高脂+低氧組與對照組相比，*P＜0.05；高脂+低氧組與高脂組相比，# P＜0.05

表1 三組小鼠心臟多普勒超聲測量結果（）

表1 三組小鼠心臟多普勒超聲測量結果（）

注:與對照組比較，#P＜0.05；與高脂組比較，*P＜0.05

項目 對照組（n=8） 高脂組（n=8） 高脂+低氧組（n=8） F值 P值IVSd/（mm） 0.641±0.134 0.790±0.100 0.664±0.180 1.279 0.324 IVSs/（mm） 0.839±0.203 0.840±0.136 0.874±0.366 0.024 0.976 LVIDd/（mm） 3.455±0.154 3.567±0.312 4.188±0.107#* 14.169 0.002 LVIDs/（mm） 1.733±0.180 1.997±0.494 2.924±0.248#* 13.873 0.002 LVPWd/（mm） 0.569±0.044* 0.769±0.084# 0.948±0.128#* 17.065 0.001 LVPWs/（mm） 0.842±0.081 1.010±0.272 1.524±0.323#* 8.191 0.009 EDV/（uL） 49.423±5.269 53.702±11.769 78.120±4.708#* 15.263 0.001 ESV/（uL） 8.956±2.485 13.728±7.232 33.172±7.129#* 18.065 0.001 LVEF/% 81.472±6.428 74.862±11.798 57.603±8.194#* 7.360 0.013 FS/% 49.645±6.868 44.205±12.157 30.197±5.342#* 5.405 0.029

3.統計學分析 采用SPSS 24.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差表示，三組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.多普勒超聲測量各組小鼠心臟結構與功能多普勒超聲結果顯示:各組小鼠室間隔厚度無明顯差異；無論與對照組小鼠還是高脂組小鼠相比，高脂+低氧組小鼠左心室內徑和左心室后壁厚度均增加，LVEF和短軸縮短分數均減少，提示CIH使ApoE-/-小鼠左心室擴張、心功能減低（圖1，表1）。

2.免疫組織化學染色檢測心肌內HIF-2α的表達 免疫組織化學染色可見HIF-2α在對照組小鼠的心肌組織中無明顯表達，在高脂組和高脂+低氧組小鼠的心肌組織中均有表達（圖2 A），高脂組和低氧組HIF-2α的陽性比例分別為（2.98±1.03）%和（10.94±1.68）%（圖2 B），低氧組小鼠的心臟組織中HIF-2α水平明顯高于對照組和高脂組（均P＜0.05）。

3.蛋白免疫印跡檢測 β3 AR在心肌組織的表達免疫印跡檢測可見β3 AR在各組小鼠的心肌組織中均有表達，與對照組和高脂組小鼠相比，高脂+低氧組小鼠的心肌組織中 β3 AR表達量明顯上調。高脂+低氧組、高脂組和對照組小鼠心肌組織GAPDH蛋白條帶的吸光度值分別為（253 737.40±14 954.00）（256 692.25±6 584.46）和（266 384.00±31 306.30），各組間差異無統計學意義；β3 AR蛋白條帶的吸光度值分別為（235 302.40±14 552.94），（173 631.25±7 014.01）和（140 720.33±2 976.35），P＜0.05（圖3 A～C）。

討 論

OSA多發于肥胖人群，以夜間睡眠中反復發生上氣道塌陷和CIH為首要病理表現。已有臨床研究表明OSA可使無基礎心臟疾病的肥胖患者心臟舒張功能減低［8］、促進心室重構［1］，Warbrick等［9］發現，合并OSA的肥胖患者發生射血分數保留的心力衰竭的比例明顯增加。基礎研究［2］發現在CIH環境下，脂肪組織中HIF-2α表達明顯上調，并參與心室重構，但是具體機制尚不明確。近年來，β3 AR因其具有調節鈉鉀泵、鈣離子通道等作用而成為心力衰竭領域的研究熱點，但是CIH是否會影響 β3 AR在心肌組織中的表達進而影響心功能尚不明確。本實驗利用高脂飼料喂養ApoE-/-小鼠構建肥胖模型，在CIH刺激下探究其對小鼠心肌組織中HIF-2α和β3 AR表達及心臟功能的影響，為揭示CIH促進心力衰竭的具體機制提供實驗依據。

在本實驗中，我們以ApoE-/-小鼠為研究對象，通過高脂飲食喂養建立肥胖模型，發現與單一高脂喂養相比，CIH聯合高脂飲食喂養8周后，ApoE-/-小鼠的左心室出現明顯擴張、心功能明顯下降，與既往臨床研究［1］提示OSA促進肥胖患者心力衰竭進展的結論一致。在以上實驗的基礎上，我們進一步探究CIH對心肌組織中HIF-2α和 β3 AR表達的影響。

Lin等［10］發現肥胖小鼠的脂肪組織中HIF-2α明顯上調，HIF-2α可能通過調節脂肪組織內的炎癥反應促進心室重構，敲除脂肪組織中的HIF-2α可阻止心肌肥厚、心室重構的發生。本實驗發現生理狀態下的對照組ApoE-/-小鼠心肌組織中幾乎不表達HIF-2α，但是CIH條件下，伴隨著左心室擴張和心功能下降，心肌組織中的HIF-2α水平明顯上調，據此我們推測HIF-2α在CIH誘導的心力衰竭中發揮一定作用。

已有臨床試驗證實給予β3 AR特異性激動劑米拉貝隆活化心肌組織中的 β3 AR，可改善慢性心力衰竭患者的預后［11］；大量基礎研究發現活化的β3 AR可以通過調節心肌細胞表面的鈉鉀泵、鈣離子通道狀態和心肌細胞內一氧化氮含量而維持心肌細胞的舒縮活性［12-14］。大量研究證實CIH可通過誘導心肌去甲腎上腺素水平增加，進而導致心肌細胞肥大、心室重構［1，15-17］，Watts等［18］發現在去甲腎上腺素誘導的大鼠心肌細胞肥大的過程中，β3 AR基因表達增加、受體數量上調，其下游活性物質環磷酸鳥苷水平下降，給予β3 AR激動劑后，β3 AR受體數量減少、下游活性物質水平增加，心肌細胞表面積縮小。以上研究提示在心肌細胞肥大、心室重構的病理進程中，存在β3 AR活性下降、數量代償性增加的病理改變。本實驗同樣發現在CIH刺激下，ApoE-/-小鼠心肌組織中 β3 AR的蛋白含量明顯增多，提示CIH使β3 AR活性受損進而引起該受體數量的代償性增多。另外有研究發現在脂肪組織中HIF-2α可調節 β3 AR活性［19］，但是在CIH誘導心室肥厚的病理進程中，是否同樣存在HIF-2α對β3 AR活性的靶向抑制作用，仍需要進一步探究。

綜上所述，本實驗發現CIH上調心肌組織中HIF-2α和β3 AR表達，引起左心室擴張、心功能受損。HIF-2α和β3 AR有望成為預防肥胖合并OSA患者發生心力衰竭的重要靶點。