曲美他嗪對心肌梗死大鼠心肌細胞凋亡和自噬及心功能的影響

浦紹文 余波

心肌梗死是由于心肌血供中斷導致細胞損傷或死亡的缺血性心臟病，因此快速恢復血供，抑制缺血心肌細胞死亡以及后期心室重構，心功能的恢復是目前心肌梗死患者臨床治療的主要原則［1］，雖然近年來治療心肌梗死的方法多種多樣，但藥物仍然是抑制心肌細胞死亡和改善患者心功能的主要方法［2］。曲美他嗪臨床上用于抗心絞痛治療，可以降低血管阻力增加冠狀動脈血流，調節心肌以葡萄糖代謝為主要產量方式，提高心肌氧的利用度，發揮保護心臟功能的作用［3］，大量的報道已表明曲美他嗪可以提供代謝性心肌細胞保護作用，抑制自由基對心肌細胞的損害，增加心肌細胞對低氧應激的耐受能力，用于心肌梗死的治療［4］。本研究觀察了曲美他嗪對心肌梗死模型大鼠心肌細胞凋亡、自噬以及心功能的影響。

材料與方法

1.實驗動物 成年雄性，SD大鼠，SPF級，90只，由湖北省動物實驗中心提供，體質量180～210 g，平均（197.16±10.42）g，無菌飲水和飼料清潔級喂養3 d后，待大鼠適應環境后進行實驗造模。

2.實驗造模 使用數字表法隨機分為假手術組和心肌梗死造模組。30 mg/kg戊巴比妥鈉腹注射麻醉成年雄性SD大鼠，60只SD大鼠四肢連接心電圖機，沿胸骨左側第3～4肋間切開皮膚，暴露心臟后結扎左冠狀動脈前降支，見心肌變白、心電圖ST段弓背向上，為造模成功。60只造模成功SD大鼠再使用數字表法隨機分為心肌梗死模型對照組和曲美他嗪干預組，每組30只SD大鼠。另外30只SD大鼠為假手術組，僅開胸游離左冠狀動脈前降支不做結扎。假手術組和心肌梗死模型對照組術后不做藥物處理，無菌飼養，自由進食和飲水。曲美他嗪干預組灌胃給予10 mg·kg-1·d-1曲美他嗪（施維雅（天津）制藥有限公司），療程4周。

3.心功能檢測 手術前和療程結束后，使用加拿大VisualSonics公司的Vevo2100小動物超聲儀測定LVESD、短軸縮短分數（FS）和EF。

4.心肌細胞HE染色和凋亡原位TUNEL檢測HE切片常規尹紅-蘇木素染色，心肌細胞凋亡使用TUNEL法檢測，試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，操作簡述如下:療程結束后斷頸處死所有SD大鼠，取出心臟，造模組SD大鼠沿梗死區中部垂直于左心室長軸的方向取材，假手術組也在相應部位取材，送病理科制作病理HE切片和冰凍切片，HE切片常規制作，冰凍切片按照試劑盒說明書加入相關試劑，凋亡細胞為藍色核染色，400×熒光顯微鏡下計數陽性細胞，計算凋亡指數，每張切片取5個不同的視野計數，然后取其平均值。

5.肌細胞自噬蛋白的Western blot檢測 療程結束后斷頸處死所有SD大鼠，取梗死區心肌組織50 mg，液氮下研磨制作細胞懸液，PBS洗滌后加入蛋白裂解液提取細胞總蛋白，蛋白定量后取10μg總蛋白經SDS-PAGE凝膠電泳，電轉印蛋白至PVDF膜，非特異封閉PVDF膜后，加入LC3Ⅱ抗體以及辣根過氧化物酶標記二抗，抗體購于上海康城生物科技有限公司，X-線曝光后膠片顯示目的條帶，GAPDH為內參。軟件掃面后對照GAPDH內參條帶計算LC3Ⅱ的相對灰度值。

6.統計學方法 SPSS 18.0統計軟件處理數據。計量資料符合正態性分布，兩組間均數比較使用t檢驗，多組間比較使用方差分析，組間相互比較使用LSD檢驗；計數資料使用χ2分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.三組術后存活率比較 假手術組大鼠死亡1只，存活29只，存活率為96.7 %，模型對照組死亡14只，存活16只，存活率為53.3 %，曲美他嗪干預組死亡7只，存活23只，存活率為76.7 %。三組間存活率差異有統計學意義（P＜0.05），其中假手術組存活率顯著高于曲美他嗪干預組（P＜0.05），曲美他嗪干預組又顯著高于模型對照組（P＜0.05）。

2.三組術后心肌細胞HE染色和心肌細胞凋亡指數的比較 從圖1心肌細胞的病理切片可見，假手術組SD大鼠心肌細胞未見壞死以及炎性細胞浸潤變化，但模型組大鼠心肌細胞出現壞死，間質炎癥細胞浸潤，其中與模型對照組相比，曲美他嗪干預組細胞壞死減少、炎癥反應較輕。熒光下TUNEL細胞凋亡定量分析顯示假手術組、模型對照組和曲美他嗪干預組術后4周心肌凋亡指數分別為［（0.62±0.14）%vs.（20.87±5.64）%vs.（10.26±1.88）%，P＜0.01］，其中假手術組顯著低于曲美他嗪干預組（P＜0.01），曲美他嗪干預組又顯著低于模型對照組（P＜0.01，圖2）。

圖1 心肌細胞的HE染色（200×）

圖2 心肌細胞凋亡的TUNEL檢測（200×）

3.三組術后心肌細胞LC3Ⅱ自噬蛋白表達的比較 假手術組、模型對照組和曲美他嗪干預組心肌細胞LC3Ⅱ自噬蛋白的相對灰度值分別為［（0.13±0.02）vs.（0.42±0.09）vs.（0.73±0.14），P＜0.01］。假手術組LC3Ⅱ表達顯著低于模型對照組（P＜0.01），模型對照組又顯著低于曲美他嗪干預組（P＜0.01，圖3）。

圖3 三組心肌細胞LC3Ⅱ自噬蛋白表達的Western blot檢測

4.三組大鼠心功能的比較 手術前三組大鼠LVESD、FS和EF，差異無統計學意義（P＞0.05），術后4周，假手術組LVEDD、FS和EF較術前無顯著變化（P＞0.05），但模型對照組和曲美他嗪干預組LVEDD較術前顯著升高（P＜0.05和P＜0.01），FS和EF較術前又顯著減低（P＜0.05和P＜0.01），曲美他嗪干預組LVEDD顯著低于模型對照組（P＜0.05），而FS和EF又顯著高于模型對照組（P＜0.05，表1）。

表1 三組LVEF、LVEDD和LVESD的比較

討 論

心肌細胞壞死后基本不能再生，心肌缺血時細胞凋亡是心肌梗死患者心肌細胞死亡的主要方式，心肌細胞丟失激發的炎癥反應為后期間質纖維化修復提供了大量的活性因子，后期心室肌的重構就會導致心功能不全的發生［5］。自噬機制參與心肌細胞缺血損傷已在大多數研究中觀察到［6］，有研究顯示改善自噬流后可以調節心肌細胞缺血誘發的凋亡，顯著減少心肌梗死面積和改善后期的心功能［7］。

大量研究顯示自噬可以作為心臟細胞創傷激活的一種保護性反應，心肌細胞缺血時，細胞ATP水平降低會刺激細胞能量感受器，激活內質網的beclin-1蛋白，誘發自噬的發生，自噬溶酶體形成可以分解受損心肌細胞中的紊亂成分，提供游離脂肪酸和氨基酸，作為能量來源的一部分，自噬溶酶體清除功能紊亂的線粒體，這樣就抑制了受損線粒體激發的過氧化反應，避免了活性氧的大量產生，自噬溶酶體可以清除細胞內泛素化蛋白，維持細胞內蛋白平衡穩定［8］。也有研究觀察到心肌梗死后遠期心肌纖維進程也有自噬調節機制的參與［9］。

曲美他嗪作為一種哌嗪類抗心絞痛藥物，在心肌細胞損傷中的保護作用被越來越多的研究證實［10］，其中對自噬的調節是曲美他嗪發揮心肌保護作用的一個機制，李艷紅等［11］的研究發現曲美他嗪通過激活自噬增加巨噬細胞處理膽固醇的能力，發揮心血管保護作用，龍玉瑩等［12］在大鼠心肌缺血再灌注損傷模型中的研究發現，曲美他嗪通過調控自噬發揮心肌損傷保護作用，譚淑娜等［13］在心肌梗死伴發心力衰竭大鼠模型中發現曲美他嗪升高了心肌細胞的自噬水平，對后期心功能的改善具有促進作用。心肌細胞自噬和凋亡之間存在相互調控，自噬體膜型（LC3-II）蛋白是一種自噬相關蛋白，細胞自噬激活時胞漿型LC3（LC3-I）蛋白會被酶解掉一小段多肽成為LC3-II，因此檢測LC3Ⅱ蛋白表達的變化可以反映出細胞自噬水平，本研究在大鼠心肌梗死模型基礎上觀察了曲美他嗪對缺血心肌細胞凋亡和自噬的影響，結果顯示曲美他嗪干預組心肌細胞凋亡率顯著低于模型對照組，曲美他嗪干預組LC3Ⅱ表達水平又顯著高于模型對照組，說明了曲美他嗪激活了心肌梗死區域心肌細胞的自噬應激修復機制，這種修復參與了對受損細胞凋亡的調控［14］，后期心功能分析顯示曲美他嗪干預組LVEDD顯著低于模型對照組，而FS和EF又顯著高于模型對照組，說明了曲美他嗪干預有利于心肌梗死模型大鼠后期心功能的恢復。

綜上所述，本研究顯示曲美他嗪減低了心肌梗死模型大鼠心肌細胞凋亡和增加了心肌細胞自噬，有利于遠期心功能的恢復。