曲美他嗪對(duì)心肌梗死大鼠心肌細(xì)胞凋亡和自噬及心功能的影響

浦紹文 余波

心肌梗死是由于心肌血供中斷導(dǎo)致細(xì)胞損傷或死亡的缺血性心臟病，因此快速恢復(fù)血供，抑制缺血心肌細(xì)胞死亡以及后期心室重構(gòu)，心功能的恢復(fù)是目前心肌梗死患者臨床治療的主要原則［1］，雖然近年來治療心肌梗死的方法多種多樣，但藥物仍然是抑制心肌細(xì)胞死亡和改善患者心功能的主要方法［2］。曲美他嗪臨床上用于抗心絞痛治療，可以降低血管阻力增加冠狀動(dòng)脈血流，調(diào)節(jié)心肌以葡萄糖代謝為主要產(chǎn)量方式，提高心肌氧的利用度，發(fā)揮保護(hù)心臟功能的作用［3］，大量的報(bào)道已表明曲美他嗪可以提供代謝性心肌細(xì)胞保護(hù)作用，抑制自由基對(duì)心肌細(xì)胞的損害，增加心肌細(xì)胞對(duì)低氧應(yīng)激的耐受能力，用于心肌梗死的治療［4］。本研究觀察了曲美他嗪對(duì)心肌梗死模型大鼠心肌細(xì)胞凋亡、自噬以及心功能的影響。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年雄性，SD大鼠，SPF級(jí)，90只，由湖北省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，體質(zhì)量180～210 g，平均（197.16±10.42）g，無菌飲水和飼料清潔級(jí)喂養(yǎng)3 d后，待大鼠適應(yīng)環(huán)境后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)造模。

2.實(shí)驗(yàn)造模 使用數(shù)字表法隨機(jī)分為假手術(shù)組和心肌梗死造模組。30 mg/kg戊巴比妥鈉腹注射麻醉成年雄性SD大鼠，60只SD大鼠四肢連接心電圖機(jī)，沿胸骨左側(cè)第3～4肋間切開皮膚，暴露心臟后結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，見心肌變白、心電圖ST段弓背向上，為造模成功。60只造模成功SD大鼠再使用數(shù)字表法隨機(jī)分為心肌梗死模型對(duì)照組和曲美他嗪干預(yù)組，每組30只SD大鼠。另外30只SD大鼠為假手術(shù)組，僅開胸游離左冠狀動(dòng)脈前降支不做結(jié)扎。假手術(shù)組和心肌梗死模型對(duì)照組術(shù)后不做藥物處理，無菌飼養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水。曲美他嗪干預(yù)組灌胃給予10 mg·kg-1·d-1曲美他嗪（施維雅（天津）制藥有限公司），療程4周。

3.心功能檢測 手術(shù)前和療程結(jié)束后，使用加拿大VisualSonics公司的Vevo2100小動(dòng)物超聲儀測定LVESD、短軸縮短分?jǐn)?shù)（FS）和EF。

4.心肌細(xì)胞HE染色和凋亡原位TUNEL檢測HE切片常規(guī)尹紅-蘇木素染色，心肌細(xì)胞凋亡使用TUNEL法檢測，試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，操作簡述如下:療程結(jié)束后斷頸處死所有SD大鼠，取出心臟，造模組SD大鼠沿梗死區(qū)中部垂直于左心室長軸的方向取材，假手術(shù)組也在相應(yīng)部位取材，送病理科制作病理HE切片和冰凍切片，HE切片常規(guī)制作，冰凍切片按照試劑盒說明書加入相關(guān)試劑，凋亡細(xì)胞為藍(lán)色核染色，400×熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞，計(jì)算凋亡指數(shù)，每張切片取5個(gè)不同的視野計(jì)數(shù)，然后取其平均值。

5.肌細(xì)胞自噬蛋白的Western blot檢測 療程結(jié)束后斷頸處死所有SD大鼠，取梗死區(qū)心肌組織50 mg，液氮下研磨制作細(xì)胞懸液，PBS洗滌后加入蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，蛋白定量后取10μg總蛋白經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)印蛋白至PVDF膜，非特異封閉PVDF膜后，加入LC3Ⅱ抗體以及辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，抗體購于上海康城生物科技有限公司，X-線曝光后膠片顯示目的條帶，GAPDH為內(nèi)參。軟件掃面后對(duì)照GAPDH內(nèi)參條帶計(jì)算LC3Ⅱ的相對(duì)灰度值。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料符合正態(tài)性分布，兩組間均數(shù)比較使用t檢驗(yàn)，多組間比較使用方差分析，組間相互比較使用LSD檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料使用χ2分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.三組術(shù)后存活率比較 假手術(shù)組大鼠死亡1只，存活29只，存活率為96.7 %，模型對(duì)照組死亡14只，存活16只，存活率為53.3 %，曲美他嗪干預(yù)組死亡7只，存活23只，存活率為76.7 %。三組間存活率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中假手術(shù)組存活率顯著高于曲美他嗪干預(yù)組（P＜0.05），曲美他嗪干預(yù)組又顯著高于模型對(duì)照組（P＜0.05）。

2.三組術(shù)后心肌細(xì)胞HE染色和心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)的比較 從圖1心肌細(xì)胞的病理切片可見，假手術(shù)組SD大鼠心肌細(xì)胞未見壞死以及炎性細(xì)胞浸潤變化，但模型組大鼠心肌細(xì)胞出現(xiàn)壞死，間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤，其中與模型對(duì)照組相比，曲美他嗪干預(yù)組細(xì)胞壞死減少、炎癥反應(yīng)較輕。熒光下TUNEL細(xì)胞凋亡定量分析顯示假手術(shù)組、模型對(duì)照組和曲美他嗪干預(yù)組術(shù)后4周心肌凋亡指數(shù)分別為［（0.62±0.14）%vs.（20.87±5.64）%vs.（10.26±1.88）%，P＜0.01］，其中假手術(shù)組顯著低于曲美他嗪干預(yù)組（P＜0.01），曲美他嗪干預(yù)組又顯著低于模型對(duì)照組（P＜0.01，圖2）。

圖1 心肌細(xì)胞的HE染色（200×）

圖2 心肌細(xì)胞凋亡的TUNEL檢測（200×）

3.三組術(shù)后心肌細(xì)胞LC3Ⅱ自噬蛋白表達(dá)的比較 假手術(shù)組、模型對(duì)照組和曲美他嗪干預(yù)組心肌細(xì)胞LC3Ⅱ自噬蛋白的相對(duì)灰度值分別為［（0.13±0.02）vs.（0.42±0.09）vs.（0.73±0.14），P＜0.01］。假手術(shù)組LC3Ⅱ表達(dá)顯著低于模型對(duì)照組（P＜0.01），模型對(duì)照組又顯著低于曲美他嗪干預(yù)組（P＜0.01，圖3）。

圖3 三組心肌細(xì)胞LC3Ⅱ自噬蛋白表達(dá)的Western blot檢測

4.三組大鼠心功能的比較 手術(shù)前三組大鼠LVESD、FS和EF，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），術(shù)后4周，假手術(shù)組LVEDD、FS和EF較術(shù)前無顯著變化（P＞0.05），但模型對(duì)照組和曲美他嗪干預(yù)組LVEDD較術(shù)前顯著升高（P＜0.05和P＜0.01），F(xiàn)S和EF較術(shù)前又顯著減低（P＜0.05和P＜0.01），曲美他嗪干預(yù)組LVEDD顯著低于模型對(duì)照組（P＜0.05），而FS和EF又顯著高于模型對(duì)照組（P＜0.05，表1）。

表1 三組LVEF、LVEDD和LVESD的比較

討 論

心肌細(xì)胞壞死后基本不能再生，心肌缺血時(shí)細(xì)胞凋亡是心肌梗死患者心肌細(xì)胞死亡的主要方式，心肌細(xì)胞丟失激發(fā)的炎癥反應(yīng)為后期間質(zhì)纖維化修復(fù)提供了大量的活性因子，后期心室肌的重構(gòu)就會(huì)導(dǎo)致心功能不全的發(fā)生［5］。自噬機(jī)制參與心肌細(xì)胞缺血損傷已在大多數(shù)研究中觀察到［6］，有研究顯示改善自噬流后可以調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞缺血誘發(fā)的凋亡，顯著減少心肌梗死面積和改善后期的心功能［7］。

大量研究顯示自噬可以作為心臟細(xì)胞創(chuàng)傷激活的一種保護(hù)性反應(yīng)，心肌細(xì)胞缺血時(shí)，細(xì)胞ATP水平降低會(huì)刺激細(xì)胞能量感受器，激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的beclin-1蛋白，誘發(fā)自噬的發(fā)生，自噬溶酶體形成可以分解受損心肌細(xì)胞中的紊亂成分，提供游離脂肪酸和氨基酸，作為能量來源的一部分，自噬溶酶體清除功能紊亂的線粒體，這樣就抑制了受損線粒體激發(fā)的過氧化反應(yīng)，避免了活性氧的大量產(chǎn)生，自噬溶酶體可以清除細(xì)胞內(nèi)泛素化蛋白，維持細(xì)胞內(nèi)蛋白平衡穩(wěn)定［8］。也有研究觀察到心肌梗死后遠(yuǎn)期心肌纖維進(jìn)程也有自噬調(diào)節(jié)機(jī)制的參與［9］。

曲美他嗪作為一種哌嗪類抗心絞痛藥物，在心肌細(xì)胞損傷中的保護(hù)作用被越來越多的研究證實(shí)［10］，其中對(duì)自噬的調(diào)節(jié)是曲美他嗪發(fā)揮心肌保護(hù)作用的一個(gè)機(jī)制，李艷紅等［11］的研究發(fā)現(xiàn)曲美他嗪通過激活自噬增加巨噬細(xì)胞處理膽固醇的能力，發(fā)揮心血管保護(hù)作用，龍玉瑩等［12］在大鼠心肌缺血再灌注損傷模型中的研究發(fā)現(xiàn)，曲美他嗪通過調(diào)控自噬發(fā)揮心肌損傷保護(hù)作用，譚淑娜等［13］在心肌梗死伴發(fā)心力衰竭大鼠模型中發(fā)現(xiàn)曲美他嗪升高了心肌細(xì)胞的自噬水平，對(duì)后期心功能的改善具有促進(jìn)作用。心肌細(xì)胞自噬和凋亡之間存在相互調(diào)控，自噬體膜型（LC3-II）蛋白是一種自噬相關(guān)蛋白，細(xì)胞自噬激活時(shí)胞漿型LC3（LC3-I）蛋白會(huì)被酶解掉一小段多肽成為LC3-II，因此檢測LC3Ⅱ蛋白表達(dá)的變化可以反映出細(xì)胞自噬水平，本研究在大鼠心肌梗死模型基礎(chǔ)上觀察了曲美他嗪對(duì)缺血心肌細(xì)胞凋亡和自噬的影響，結(jié)果顯示曲美他嗪干預(yù)組心肌細(xì)胞凋亡率顯著低于模型對(duì)照組，曲美他嗪干預(yù)組LC3Ⅱ表達(dá)水平又顯著高于模型對(duì)照組，說明了曲美他嗪激活了心肌梗死區(qū)域心肌細(xì)胞的自噬應(yīng)激修復(fù)機(jī)制，這種修復(fù)參與了對(duì)受損細(xì)胞凋亡的調(diào)控［14］，后期心功能分析顯示曲美他嗪干預(yù)組LVEDD顯著低于模型對(duì)照組，而FS和EF又顯著高于模型對(duì)照組，說明了曲美他嗪干預(yù)有利于心肌梗死模型大鼠后期心功能的恢復(fù)。

綜上所述，本研究顯示曲美他嗪減低了心肌梗死模型大鼠心肌細(xì)胞凋亡和增加了心肌細(xì)胞自噬，有利于遠(yuǎn)期心功能的恢復(fù)。