低氧誘導因子-1α減輕七氟烷處理小鼠心肌缺血再灌注損傷中的研究

徐聰杰 景曉剛

心肌缺血/再灌注（ischemic/reperfusion，I/R）在心血管疾病中是一種常見的損傷和危險，在發(fā)生缺血心肌再灌注時，心肌細胞以及內(nèi)皮細胞受到損傷應激而釋放IL-1β，IL-6，TNF-α等炎性因子［1-3］，誘發(fā)心臟部位局部的炎癥性反應，最終導致心肌纖維化，心肌細胞凋亡，心功能受損以及心肌梗死面積擴大化等不良影響。而在長時間心肌缺血到來之前的短暫缺血可以對心肌有一定的保護作用，長期缺血則引發(fā)炎癥反應［4-6］。缺血/再灌注時期，受損的心肌細胞可釋放DAMPs蛋白由Toll樣受體4（Tolllike receptor 4，TLR4）蛋白識別，TLR4被激活參與多條通路反應后進一步使NF-κB被激活進一步促進炎性因子的表達釋放，從而誘發(fā)炎性反應，有可能使心肌細胞走向凋亡［7-9］。

缺血/再灌注時心肌細胞中會出現(xiàn)線粒體形態(tài)和結(jié)構(gòu)的動力學改變，打破了線粒體融合裂解的動態(tài)平衡，最終易引發(fā)凋亡。七氟烷在臨床上廣泛應用于揮發(fā)性吸入麻藥，有研究發(fā)現(xiàn)，七氟烷的后處理可增強線粒體外膜上的Mfnl蛋白表達，使心肌受到保護［10］。

低氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1，HIF-1α）是一種在細胞核內(nèi)表達的轉(zhuǎn)錄因子HIF-1的亞基α亞基，其作用在于作為氧調(diào)節(jié)單位來決定HIF-1的生物學活性［11-13］。當環(huán)境中氧濃度在5%以上時，HIF-1α在雌三醇泛素連接酶的作用下被降解，因而在高氧濃度中很難檢測到HIF-1α。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，在動物I/R中，HIF-1α的表達上調(diào)能保護到I/R心肌細胞，因其在生理和病理條件下可參與調(diào)控多種基因表達，使機體對低氧環(huán)境應激而逐漸適應。有研究證明，HIF-1α可降低心肌酶活，抑制心肌細胞凋亡，減少心肌梗死的面積。本次研究，我們擬采取心肌損傷/再灌注并用七氟烷后處理的小鼠作為研究模型來探究HIF-1α在此過程中的作用，從而為臨床缺血性心臟病的治療提供理論和實踐依據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報告如下:

材料與方法

1.實驗動物分組與處理 選取健康，雄性，小鼠，8周齡，50只，隨機分為五組每組10只分籠飼養(yǎng)，保持飼養(yǎng)環(huán)境清潔，室溫在25℃左右，濕度在60%左右，使小鼠適應一周。五組小鼠分別進行如下處理:（1）對照組:對小鼠的心臟冠狀動脈左前降支進行穿線處理但不結(jié)扎，即刻吸入濃度為1.0 MAC（約1.7%）七氟烷3 min。 （2）I/R組:將小鼠心肌缺血處理45 min，而后再灌注3 h，使用0.9%氯化鈉溶液進行干預，即刻吸入濃度為1.0 MAC（約1.7%）七氟烷3 min。 （3）DMOG+I/R組（HIF-1α穩(wěn)定劑聯(lián)合心肌缺血/再灌注）:將小鼠心肌缺血處理45 min，而后再灌注3 h，使用0.9%氯化鈉溶液進行干預，即刻吸入濃度為1.0 MAC（約1.7%）七氟烷3 min，術(shù)前24 h進行40 mg/kg的DMOG腹腔注射。（4）YC-1+I/R組（HIF-1α抑制劑聯(lián)合心肌缺血/再灌注）:將小鼠心肌缺血處理45 min，而后再灌注3 h，使用0.9%氯化鈉溶液進行干預，即刻吸入濃度為1.0 MAC（約1.7%）七氟烷3 min，術(shù)前30 min進行2 mg/kg的YC-1股靜脈注射。

2.儀器與試劑 （1）主要儀器:HX-300動物呼吸機，熒光定量PCR儀，電泳儀，濕轉(zhuǎn)膜儀，冷凍離心機，多功能酶標儀。

（2）主要試劑:3% Evans blue，TTC，DMOG，YC-1，GAPDH一 抗，HIF-1α一 抗，NF-κB一 抗，TLR4一抗，SOD一抗，BCL-2一抗，Bax一抗，ECL發(fā)光試劑盒，real-time PCR試劑盒，dNTP，RNA提取試劑盒，MPO試劑盒。

3.實驗方法:（1）I/R模型制備:將小鼠術(shù)前禁食12 h，腹腔注射0.1 mL 10%水合氯醛/100 g體質(zhì)量，待小鼠麻醉后使其仰臥固定，連接好心電監(jiān)測電極，于頸部正中行2 cm左右切口，分離肌肉制作氣管插管，連接呼吸機輔助呼吸，參數(shù)設定為潮氣量2～3 mL，吸入氧濃度為50%，呼吸頻率為60～0次/min。同時記錄好標準Ⅱ?qū)?lián)心電圖。于小鼠胸骨正中左側(cè)部位縱向切口，約2 cm，分離皮下組織與肌肉，剪斷第3，4肋骨，借助擴胸器撐開胸部，將冠狀動脈左前降支結(jié)扎，再將線兩端穿入PE管，再用持針器夾PE管前推使心臟缺血。心電圖若顯示ST段有抬高則為造模成功。缺血45 min之后可打開結(jié)扎線，關閉胸腔使再灌注，持續(xù)3 h后處死小鼠。取出心臟左心室前壁組織待用。

（2）七氟烷后處理:在小鼠恢復供血的開始立即使其吸入1.0 MAC的七氟烷約3 min。

（3）測定心肌梗死面積:采取TTC/Evans blue雙染法，將小鼠開胸后鉗夾左前降支，向頸靜脈注入2～3 mL的3%Evans blue，則缺血的心肌不變色，未缺血心肌為藍色。之后經(jīng)耳緣靜脈注入10%氯化鉀（2 mL/kg），心臟停跳可開胸取出心臟，用0.9%氯化鈉液沖洗并剝離心包，用保鮮膜包裹離體心臟后于-20℃保存1 h，由非梗死區(qū)縱切左心室，然后將通過在平行于房室溝的方向?qū)⑷毖獏^(qū)切成厚度為1～2 mm的4片，再用1%的TTC浸沒，37℃避光水浴10～15 min。之后用10%的甲醛固定10 min。

若心肌組織正常則可被染為藍色，若發(fā)生缺血但未發(fā)生梗死則為紅色，若發(fā)生梗死則為白色。將圖像拍照后使用Image pro plus 6.0軟件分析各區(qū)域的面積，計算危險區(qū)面積%（即非正常區(qū)）（AAR/LV，%）=（危險區(qū)總面積/左心室總面積）×100%，以及心梗面積%（An/AAR，%）=（梗死區(qū)面積/危險區(qū)總面積）×100%。

（4）對小鼠心肌細胞的相關檢測:提取小鼠心肌細胞蛋白與RNA，檢測其中HIF-1α，NF-κB，TLR4，SOD的mRNA水平以及蛋白表達水平，凋亡相關蛋白Bax，BCL2的表達水平；利用試劑盒檢測心肌組織MPO活性等。

1）western blot檢測蛋白表達:蛋白提取:取小鼠心臟約50 mg剪碎勻漿后，加入混合有PMSF的RIPA裂解液（PMSF∶RIPA=1∶1 000）500μL，冰上裂解1 h后置于冷凍離心機中12 000 g離心15 min，取上清混入SDS置于100℃煮沸變性10 min，冰上放置10 min，而后置于-20℃待用。電泳檢測:制作SDS-PAGE凝膠后將上述提取得到的蛋白上樣跑電泳，轉(zhuǎn)膜，5%的脫脂奶粉封閉后用對應的一抗孵育，4℃過夜，之后用二抗孵育1 h后洗膜顯色，即去顯影，之后借助軟件Image J對蛋白條帶的灰度進行定量。

2）real time PCR檢測mRNA表達水平:利用RNA提取試劑盒提取細胞內(nèi)的總RNA，之后反轉(zhuǎn)錄成cDNA進行real-time PCR。

3）MPO活性檢測:MPO為心肌組織髓過氧化物酶，可以指示中性粒細胞激活程度。稱取心肌適宜重量后，將試劑盒試劑與組織按照9∶1混合制備5%的組織勻漿，取其中0.9 mL組織勻漿加入0.1 mL的3號試劑，充分混合后置于37℃進行水浴15 min，之后于460 nm處測定吸光度值。MPO活性=（實驗組OD值-對照組OD值）/11.3×質(zhì)量。

4.統(tǒng)計學方法 本次研究SPSS 20.0軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標準差表示，多組間采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。計數(shù)資料以頻數(shù)（率）表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1.四組小鼠心肌梗死面積變化 在進行處理之前，四組小鼠的AAR/LV以及An/AAR差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；經(jīng)過處理后，I/R組小鼠的AAR/LV以及An/AAR均顯著高于對照組（P＜0.001），DMOG+I/R組相比I/R組，AAR/LV以及An/AAR均發(fā)生了顯著降低（P＜0.001），YC-1+I/R組相比I/R組，AAR/LV以及An/AAR又均發(fā)生了顯著升高（P＜0.01），具體見圖1。

2.四組小鼠相關蛋白表達情況 當小鼠發(fā)生心肌缺血/再灌注時，小鼠體內(nèi)的HIF-1α蛋白水平顯著下調(diào)（t=6.585，P=0.000 1），炎癥因子NF-κB和TLR4顯著上升（t=8.236，7.119，P=0.000 1，0.000 1），抗氧化蛋白SOD顯著下降（t=7.266，P=0.000 1），促凋亡蛋白Bax顯著升高（t=8.012，P=0.000 1），抗凋亡蛋白BCL2水平顯著下降（t=12.437，P=0.000 1），表明心肌細胞發(fā)生氧化應激發(fā)生炎癥反應，并誘發(fā)凋亡；而當在此基礎上加入HIF-1α增強劑DMOG時，可以使炎癥因子NF-κB和TLR4顯著下調(diào)（t=8.557，9.015，P=0.000 1，0.000 1），抗氧化蛋白SOD顯著上升（t=6.232 3，P=0.000 1），促凋亡蛋白Bax顯著下降（t=9.117，P=0.000 1），抗凋亡蛋白BCL2水平顯著升高（t=11.546，P=0.000 1），加入HIF-1α抑制劑YC-1現(xiàn)象相反（分別為t=4.279，3.927，3.108，4.217，4.538，P=0.002 3，0.004 8，0.002 9，0.000 1，0.002 1），表明HIF-1α有利于保護心肌細胞，具體見表1。

3.四組小鼠相關基因mRNA水平 經(jīng)過處理后，I/R組小鼠的NF-κB和TLR4水平顯著升高（t=4.687，5.124，P=0.000 1），DMOG+I/R組相比I/R組，其NF-κB和TLR4水平發(fā)生顯著下降（t=4.112，4.197，P=0.000 1，0.000 1），YC-1+I/R組相比I/R組，其NF-κB和TLR4水平發(fā)生顯著回升（t=2.335，2.138，P=0.000 1，0.000 1），具體見表2。

4.四組小鼠心肌組織MPO活性 經(jīng)過處理之后，對照組小鼠的MPO活性為（0.28±0.54），I/R組小鼠的為（1.45±0.31），顯著升高（t=3.875，P＜0.05），DMOG+I/R組的為（0.88±0.23），相比I/R組發(fā)生了顯著降低（t=3.224，P＜0.05）；而YC-1+I/R組的為（1.98±0.39），相比I/R組發(fā)生了顯著回升（t=3.015，P＜0.05），證明HIF-1α的存在可以抑制中性粒細胞的活性。

討 論

對于心肌細胞而言，缺血，缺氧，氧化應激等容易引起心肌細胞損傷和凋亡，與其他種類的心血管疾病相比，I/R所導致的心肌梗死是造成心衰的主要原因，并具有較高的致死率，這是由于I/R發(fā)生時缺血的心肌細胞釋放炎癥性因子激活炎癥反應，誘發(fā)成纖維細胞增殖和胞外基質(zhì)沉積［14-16］，造成心肌炎性應激，纖維化以及凋亡。急性缺血性心臟病的治療目的是使得血流及時迅速地回流到心肌缺血區(qū)，即再灌注，使原本造成的死亡率減半，但同時也會導致心肌細胞不可逆的損傷甚至壞死或者凋亡。最近發(fā)現(xiàn)［17］，心臟具有適應缺血/再灌注的能力，是一種較好的適應性反應，短時間內(nèi)缺血有利于增強心臟抵抗后續(xù)缺血性損傷能力。使用七氟烷進行缺血/再灌注后處理可有效減輕再灌注的損傷，其機制在于七氟烷是在臨床手術(shù)中應用廣泛的吸入性麻藥，可通過將線粒體KATP通道打開后對谷氨酸等一些興奮性氨基酸的釋放抑制，降低細胞內(nèi)鈣連受體作用的發(fā)揮。而七氟烷的后處理，有研究顯示七氟烷的后處理可激活更多PI3K/Akt通路，另外通過抑制自噬極大地降低了腦缺血再灌注中發(fā)生的損傷，對大腦起到保護作用，因而將七氟烷后處理作為小鼠缺血再灌注損傷挽救的模型進行研究，探究其中起到直接影響的分子機制。當心肌細胞缺血時，PI3K被激活而進一步激活PKB，進一步磷酸化下游底物，從而減輕損傷。或者是ERK1/2通路被活化從而增強對于細胞生長，分化的調(diào)節(jié)。而研究發(fā)現(xiàn)［18］，線粒體膜上的非特異性通道轉(zhuǎn)換孔mPTP在再灌注時受到ROS影響而開放，使細胞受到損傷。

表1 四組小鼠相關蛋白表達情況（）

表1 四組小鼠相關蛋白表達情況（）

注:與對照組對比，*P＜0.05；與I/R組對比，#P＜0.05

組別 對照組（n=10） I/R組（n=10） DMOG+I/R組（n=10） YC-1+I/R組（n=10） F值 P值HIF-1α 4.43±0.58 0.76±0.03* 7.18±0.03# 0.87±0.04# 3.272 0.0003 NF-κB 5.72±0.48 17.44±2.35* 6.67±1.22# 19.73±2.38# 3.113 0.000 1 TLR4 3.16±0.89 13.11±1.27* 4.45±0.23# 15.56±1.39# 3.074 0.000 1 SOD 15.23±1.85 4.28±0.75* 10.77±1.01# 5.29±1.33# 4.256 0.000 1 Bax 2.08±0.07 15.48±2.65* 4.82±0.84# 19.66±3.48# 2.835 0.000 1 BCL2 32.33±0.12 4.67±3.33* 29.88±1.52# 8.66±1.25# 4.117 0.000 1

表2 四組小鼠相關基因mRNA水平（）

HIF-1α在低氧條件下存在，高氧環(huán)境中被降解，被認為參與生物體低氧環(huán)境中適應性調(diào)控。而當發(fā)生炎癥反應時，HIF-1α被認為與NF-κB的激活密切相關。已經(jīng)有超過100種基因被發(fā)現(xiàn)可以作為HIF-1α的靶基因進行細胞調(diào)控，例如細胞凋亡。而HIF-1α除了在缺氧條件下表達，非缺氧狀態(tài)下也有穩(wěn)定表達，而其功能會受到NF-κB的調(diào)控，有研究顯示若體內(nèi)NF-κB表達缺失，即使創(chuàng)造缺氧環(huán)境并延長時間，HIF-1α也不會被激活。Toll樣受體TLR4是NF-κB的上游，當發(fā)生缺血損傷時，心肌組織會釋放損傷相關蛋白將TLR4激活，進而激活NF-κB，使得心肌損傷增強，由此可見，TLR4也可指示細胞的炎性應激以及受損傷水平［19］。

超氧化物歧化酶SOD是細胞內(nèi)一種主要的抗氧化酶，用于清除細胞內(nèi)氧化自由基，因而避免了自由基帶給機體的危害。SOD水平高低可以反映細胞內(nèi)氧化水平的高低。若SOD水平上升，說明活性氧水平升高，使細胞容易激發(fā)炎性應激過程。

而當?shù)蛲鲂盘柍霈F(xiàn)時，抗凋亡蛋白BCL2表達會降低，則不能結(jié)合抑制促凋亡蛋白Bax，則Bax可結(jié)合到線粒體外膜改變其通透性［20］，最終使細胞色素c釋放到胞漿中引起內(nèi)源途徑的凋亡。

本次研究發(fā)現(xiàn)，在進行處理之前，四組小鼠的AAR/LV以及An/AAR差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；經(jīng)過處理后，I/R組小鼠的AAR/LV以及An/AAR均顯著高于對照組（P＜0.001），DMOG+I/R組相比I/R組，AAR/LV以及An/AAR均發(fā)生了顯著降低（P＜0.001），YC-1+I/R組相比I/R組，AAR/LV以及An/AAR又均發(fā)生了顯著升高（P＜0.01），說明心肌缺血再灌注過程中心肌組織的缺血以及梗死面積增多，而當加強HIF-1α的作用時可以顯著減少心肌組織缺血面積或者梗死面積的比例，當減弱HIF-1α的作用時心肌組織缺血面積或者梗死面積比例又顯著上調(diào)；當小鼠發(fā)生心肌缺血/再灌注時，小鼠體內(nèi)的HIF-1α蛋白水平顯著下調(diào)，炎癥因子NF-κB和TLR4顯著上升，抗氧化蛋白SOD顯著下降，促凋亡蛋白Bax顯著升高，抗凋亡蛋白BCL2水平顯著下降，表明心肌細胞發(fā)生氧化應激發(fā)生炎癥反應，并誘發(fā)凋亡；而當在此基礎上加入HIF-1α增強劑DMOG時，可以使炎癥因子NF-κB和TLR4顯著下調(diào)，抗氧化蛋白SOD顯著上升，促凋亡蛋白Bax顯著下降，抗凋亡蛋白BCL2水平顯著升高，加入HIF-1α抑制劑YC-1現(xiàn)象相反，表明HIF-1α有利于保護心肌細胞；I/R組小鼠的NF-κB和TLR4水平顯著升高（t=4.687，5.124，P＜0.05），DMOG+I/R組相比I/R組，其NF-κB和TLR4水平發(fā)生顯著下降（t=4.112，4.197，P＜0.05），YC-1+I/R組相比I/R組，其NF-κB和TLR4水平發(fā)生顯著回升（t=2.335，2.138，P＜0.05）；經(jīng)過處理之后，對照組小鼠的MPO活性為（0.28±0.54），I/R組小鼠的為（1.45±0.31），顯著升高（t=3.875，P＜0.05），DMOG+I/R組的為（0.88±0.23），相比I/R組發(fā)生了顯著降低（t=3.224，P＜0.05）；而YC-1+I/R組的為（1.98±0.39），相比I/R組發(fā)生了顯著回升（t=3.015，P＜0.05），證明HIF-1α的存在可以抑制中性粒細胞的活性。由此顯示，HIF-1α可有效減輕大鼠在心肌損傷/再灌注所致的炎性損傷并避免心肌細胞凋亡，對心肌細胞起到良好的保護作用。DMOG有利于穩(wěn)定HIF-1α的表達及水平，從而更好地保護心肌細胞，為臨床上治療心肌缺血藥物研發(fā)提供理論以及和實踐基礎。