低氧誘導(dǎo)因子-1α減輕七氟烷處理小鼠心肌缺血再灌注損傷中的研究

徐聰杰 景曉剛

心肌缺血/再灌注（ischemic/reperfusion，I/R）在心血管疾病中是一種常見的損傷和危險(xiǎn)，在發(fā)生缺血心肌再灌注時(shí)，心肌細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞受到損傷應(yīng)激而釋放IL-1β，IL-6，TNF-α等炎性因子［1-3］，誘發(fā)心臟部位局部的炎癥性反應(yīng)，最終導(dǎo)致心肌纖維化，心肌細(xì)胞凋亡，心功能受損以及心肌梗死面積擴(kuò)大化等不良影響。而在長(zhǎng)時(shí)間心肌缺血到來(lái)之前的短暫缺血可以對(duì)心肌有一定的保護(hù)作用，長(zhǎng)期缺血?jiǎng)t引發(fā)炎癥反應(yīng)［4-6］。缺血/再灌注時(shí)期，受損的心肌細(xì)胞可釋放DAMPs蛋白由Toll樣受體4（Tolllike receptor 4，TLR4）蛋白識(shí)別，TLR4被激活參與多條通路反應(yīng)后進(jìn)一步使NF-κB被激活進(jìn)一步促進(jìn)炎性因子的表達(dá)釋放，從而誘發(fā)炎性反應(yīng)，有可能使心肌細(xì)胞走向凋亡［7-9］。

缺血/再灌注時(shí)心肌細(xì)胞中會(huì)出現(xiàn)線粒體形態(tài)和結(jié)構(gòu)的動(dòng)力學(xué)改變，打破了線粒體融合裂解的動(dòng)態(tài)平衡，最終易引發(fā)凋亡。七氟烷在臨床上廣泛應(yīng)用于揮發(fā)性吸入麻藥，有研究發(fā)現(xiàn)，七氟烷的后處理可增強(qiáng)線粒體外膜上的Mfnl蛋白表達(dá)，使心肌受到保護(hù)［10］。

低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1，HIF-1α）是一種在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子HIF-1的亞基α亞基，其作用在于作為氧調(diào)節(jié)單位來(lái)決定HIF-1的生物學(xué)活性［11-13］。當(dāng)環(huán)境中氧濃度在5%以上時(shí)，HIF-1α在雌三醇泛素連接酶的作用下被降解，因而在高氧濃度中很難檢測(cè)到HIF-1α。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，在動(dòng)物I/R中，HIF-1α的表達(dá)上調(diào)能保護(hù)到I/R心肌細(xì)胞，因其在生理和病理?xiàng)l件下可參與調(diào)控多種基因表達(dá)，使機(jī)體對(duì)低氧環(huán)境應(yīng)激而逐漸適應(yīng)。有研究證明，HIF-1α可降低心肌酶活，抑制心肌細(xì)胞凋亡，減少心肌梗死的面積。本次研究，我們擬采取心肌損傷/再灌注并用七氟烷后處理的小鼠作為研究模型來(lái)探究HIF-1α在此過(guò)程中的作用，從而為臨床缺血性心臟病的治療提供理論和實(shí)踐依據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下:

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理 選取健康，雄性，小鼠，8周齡，50只，隨機(jī)分為五組每組10只分籠飼養(yǎng)，保持飼養(yǎng)環(huán)境清潔，室溫在25℃左右，濕度在60%左右，使小鼠適應(yīng)一周。五組小鼠分別進(jìn)行如下處理:（1）對(duì)照組:對(duì)小鼠的心臟冠狀動(dòng)脈左前降支進(jìn)行穿線處理但不結(jié)扎，即刻吸入濃度為1.0 MAC（約1.7%）七氟烷3 min。 （2）I/R組:將小鼠心肌缺血處理45 min，而后再灌注3 h，使用0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行干預(yù)，即刻吸入濃度為1.0 MAC（約1.7%）七氟烷3 min。 （3）DMOG+I/R組（HIF-1α穩(wěn)定劑聯(lián)合心肌缺血/再灌注）:將小鼠心肌缺血處理45 min，而后再灌注3 h，使用0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行干預(yù)，即刻吸入濃度為1.0 MAC（約1.7%）七氟烷3 min，術(shù)前24 h進(jìn)行40 mg/kg的DMOG腹腔注射。（4）YC-1+I/R組（HIF-1α抑制劑聯(lián)合心肌缺血/再灌注）:將小鼠心肌缺血處理45 min，而后再灌注3 h，使用0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行干預(yù)，即刻吸入濃度為1.0 MAC（約1.7%）七氟烷3 min，術(shù)前30 min進(jìn)行2 mg/kg的YC-1股靜脈注射。

2.儀器與試劑 （1）主要儀器:HX-300動(dòng)物呼吸機(jī)，熒光定量PCR儀，電泳儀，濕轉(zhuǎn)膜儀，冷凍離心機(jī)，多功能酶標(biāo)儀。

（2）主要試劑:3% Evans blue，TTC，DMOG，YC-1，GAPDH一 抗，HIF-1α一 抗，NF-κB一 抗，TLR4一抗，SOD一抗，BCL-2一抗，Bax一抗，ECL發(fā)光試劑盒，real-time PCR試劑盒，dNTP，RNA提取試劑盒，MPO試劑盒。

3.實(shí)驗(yàn)方法:（1）I/R模型制備:將小鼠術(shù)前禁食12 h，腹腔注射0.1 mL 10%水合氯醛/100 g體質(zhì)量，待小鼠麻醉后使其仰臥固定，連接好心電監(jiān)測(cè)電極，于頸部正中行2 cm左右切口，分離肌肉制作氣管插管，連接呼吸機(jī)輔助呼吸，參數(shù)設(shè)定為潮氣量2～3 mL，吸入氧濃度為50%，呼吸頻率為60～0次/min。同時(shí)記錄好標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖。于小鼠胸骨正中左側(cè)部位縱向切口，約2 cm，分離皮下組織與肌肉，剪斷第3，4肋骨，借助擴(kuò)胸器撐開胸部，將冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎，再將線兩端穿入PE管，再用持針器夾PE管前推使心臟缺血。心電圖若顯示ST段有抬高則為造模成功。缺血45 min之后可打開結(jié)扎線，關(guān)閉胸腔使再灌注，持續(xù)3 h后處死小鼠。取出心臟左心室前壁組織待用。

（2）七氟烷后處理:在小鼠恢復(fù)供血的開始立即使其吸入1.0 MAC的七氟烷約3 min。

（3）測(cè)定心肌梗死面積:采取TTC/Evans blue雙染法，將小鼠開胸后鉗夾左前降支，向頸靜脈注入2～3 mL的3%Evans blue，則缺血的心肌不變色，未缺血心肌為藍(lán)色。之后經(jīng)耳緣靜脈注入10%氯化鉀（2 mL/kg），心臟停跳可開胸取出心臟，用0.9%氯化鈉液沖洗并剝離心包，用保鮮膜包裹離體心臟后于-20℃保存1 h，由非梗死區(qū)縱切左心室，然后將通過(guò)在平行于房室溝的方向?qū)⑷毖獏^(qū)切成厚度為1～2 mm的4片，再用1%的TTC浸沒，37℃避光水浴10～15 min。之后用10%的甲醛固定10 min。

若心肌組織正常則可被染為藍(lán)色，若發(fā)生缺血但未發(fā)生梗死則為紅色，若發(fā)生梗死則為白色。將圖像拍照后使用Image pro plus 6.0軟件分析各區(qū)域的面積，計(jì)算危險(xiǎn)區(qū)面積%（即非正常區(qū)）（AAR/LV，%）=（危險(xiǎn)區(qū)總面積/左心室總面積）×100%，以及心梗面積%（An/AAR，%）=（梗死區(qū)面積/危險(xiǎn)區(qū)總面積）×100%。

（4）對(duì)小鼠心肌細(xì)胞的相關(guān)檢測(cè):提取小鼠心肌細(xì)胞蛋白與RNA，檢測(cè)其中HIF-1α，NF-κB，TLR4，SOD的mRNA水平以及蛋白表達(dá)水平，凋亡相關(guān)蛋白Bax，BCL2的表達(dá)水平；利用試劑盒檢測(cè)心肌組織MPO活性等。

1）western blot檢測(cè)蛋白表達(dá):蛋白提取:取小鼠心臟約50 mg剪碎勻漿后，加入混合有PMSF的RIPA裂解液（PMSF∶RIPA=1∶1 000）500μL，冰上裂解1 h后置于冷凍離心機(jī)中12 000 g離心15 min，取上清混入SDS置于100℃煮沸變性10 min，冰上放置10 min，而后置于-20℃待用。電泳檢測(cè):制作SDS-PAGE凝膠后將上述提取得到的蛋白上樣跑電泳，轉(zhuǎn)膜，5%的脫脂奶粉封閉后用對(duì)應(yīng)的一抗孵育，4℃過(guò)夜，之后用二抗孵育1 h后洗膜顯色，即去顯影，之后借助軟件Image J對(duì)蛋白條帶的灰度進(jìn)行定量。

2）real time PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)水平:利用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞內(nèi)的總RNA，之后反轉(zhuǎn)錄成cDNA進(jìn)行real-time PCR。

3）MPO活性檢測(cè):MPO為心肌組織髓過(guò)氧化物酶，可以指示中性粒細(xì)胞激活程度。稱取心肌適宜重量后，將試劑盒試劑與組織按照9∶1混合制備5%的組織勻漿，取其中0.9 mL組織勻漿加入0.1 mL的3號(hào)試劑，充分混合后置于37℃進(jìn)行水浴15 min，之后于460 nm處測(cè)定吸光度值。MPO活性=（實(shí)驗(yàn)組OD值-對(duì)照組OD值）/11.3×質(zhì)量。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本次研究SPSS 20.0軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)（率）表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.四組小鼠心肌梗死面積變化 在進(jìn)行處理之前，四組小鼠的AAR/LV以及An/AAR差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；經(jīng)過(guò)處理后，I/R組小鼠的AAR/LV以及An/AAR均顯著高于對(duì)照組（P＜0.001），DMOG+I/R組相比I/R組，AAR/LV以及An/AAR均發(fā)生了顯著降低（P＜0.001），YC-1+I/R組相比I/R組，AAR/LV以及An/AAR又均發(fā)生了顯著升高（P＜0.01），具體見圖1。

2.四組小鼠相關(guān)蛋白表達(dá)情況 當(dāng)小鼠發(fā)生心肌缺血/再灌注時(shí)，小鼠體內(nèi)的HIF-1α蛋白水平顯著下調(diào)（t=6.585，P=0.000 1），炎癥因子NF-κB和TLR4顯著上升（t=8.236，7.119，P=0.000 1，0.000 1），抗氧化蛋白SOD顯著下降（t=7.266，P=0.000 1），促凋亡蛋白Bax顯著升高（t=8.012，P=0.000 1），抗凋亡蛋白BCL2水平顯著下降（t=12.437，P=0.000 1），表明心肌細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激發(fā)生炎癥反應(yīng)，并誘發(fā)凋亡；而當(dāng)在此基礎(chǔ)上加入HIF-1α增強(qiáng)劑DMOG時(shí)，可以使炎癥因子NF-κB和TLR4顯著下調(diào)（t=8.557，9.015，P=0.000 1，0.000 1），抗氧化蛋白SOD顯著上升（t=6.232 3，P=0.000 1），促凋亡蛋白Bax顯著下降（t=9.117，P=0.000 1），抗凋亡蛋白BCL2水平顯著升高（t=11.546，P=0.000 1），加入HIF-1α抑制劑YC-1現(xiàn)象相反（分別為t=4.279，3.927，3.108，4.217，4.538，P=0.002 3，0.004 8，0.002 9，0.000 1，0.002 1），表明HIF-1α有利于保護(hù)心肌細(xì)胞，具體見表1。

3.四組小鼠相關(guān)基因mRNA水平 經(jīng)過(guò)處理后，I/R組小鼠的NF-κB和TLR4水平顯著升高（t=4.687，5.124，P=0.000 1），DMOG+I/R組相比I/R組，其NF-κB和TLR4水平發(fā)生顯著下降（t=4.112，4.197，P=0.000 1，0.000 1），YC-1+I/R組相比I/R組，其NF-κB和TLR4水平發(fā)生顯著回升（t=2.335，2.138，P=0.000 1，0.000 1），具體見表2。

4.四組小鼠心肌組織MPO活性 經(jīng)過(guò)處理之后，對(duì)照組小鼠的MPO活性為（0.28±0.54），I/R組小鼠的為（1.45±0.31），顯著升高（t=3.875，P＜0.05），DMOG+I/R組的為（0.88±0.23），相比I/R組發(fā)生了顯著降低（t=3.224，P＜0.05）；而YC-1+I/R組的為（1.98±0.39），相比I/R組發(fā)生了顯著回升（t=3.015，P＜0.05），證明HIF-1α的存在可以抑制中性粒細(xì)胞的活性。

討 論

對(duì)于心肌細(xì)胞而言，缺血，缺氧，氧化應(yīng)激等容易引起心肌細(xì)胞損傷和凋亡，與其他種類的心血管疾病相比，I/R所導(dǎo)致的心肌梗死是造成心衰的主要原因，并具有較高的致死率，這是由于I/R發(fā)生時(shí)缺血的心肌細(xì)胞釋放炎癥性因子激活炎癥反應(yīng)，誘發(fā)成纖維細(xì)胞增殖和胞外基質(zhì)沉積［14-16］，造成心肌炎性應(yīng)激，纖維化以及凋亡。急性缺血性心臟病的治療目的是使得血流及時(shí)迅速地回流到心肌缺血區(qū)，即再灌注，使原本造成的死亡率減半，但同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞不可逆的損傷甚至壞死或者凋亡。最近發(fā)現(xiàn)［17］，心臟具有適應(yīng)缺血/再灌注的能力，是一種較好的適應(yīng)性反應(yīng)，短時(shí)間內(nèi)缺血有利于增強(qiáng)心臟抵抗后續(xù)缺血性損傷能力。使用七氟烷進(jìn)行缺血/再灌注后處理可有效減輕再灌注的損傷，其機(jī)制在于七氟烷是在臨床手術(shù)中應(yīng)用廣泛的吸入性麻藥，可通過(guò)將線粒體KATP通道打開后對(duì)谷氨酸等一些興奮性氨基酸的釋放抑制，降低細(xì)胞內(nèi)鈣連受體作用的發(fā)揮。而七氟烷的后處理，有研究顯示七氟烷的后處理可激活更多PI3K/Akt通路，另外通過(guò)抑制自噬極大地降低了腦缺血再灌注中發(fā)生的損傷，對(duì)大腦起到保護(hù)作用，因而將七氟烷后處理作為小鼠缺血再灌注損傷挽救的模型進(jìn)行研究，探究其中起到直接影響的分子機(jī)制。當(dāng)心肌細(xì)胞缺血時(shí)，PI3K被激活而進(jìn)一步激活PKB，進(jìn)一步磷酸化下游底物，從而減輕損傷。或者是ERK1/2通路被活化從而增強(qiáng)對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)，分化的調(diào)節(jié)。而研究發(fā)現(xiàn)［18］，線粒體膜上的非特異性通道轉(zhuǎn)換孔mPTP在再灌注時(shí)受到ROS影響而開放，使細(xì)胞受到損傷。

表1 四組小鼠相關(guān)蛋白表達(dá)情況（）

表1 四組小鼠相關(guān)蛋白表達(dá)情況（）

注:與對(duì)照組對(duì)比，*P＜0.05；與I/R組對(duì)比，#P＜0.05

組別 對(duì)照組（n=10） I/R組（n=10） DMOG+I/R組（n=10） YC-1+I/R組（n=10） F值 P值HIF-1α 4.43±0.58 0.76±0.03* 7.18±0.03# 0.87±0.04# 3.272 0.0003 NF-κB 5.72±0.48 17.44±2.35* 6.67±1.22# 19.73±2.38# 3.113 0.000 1 TLR4 3.16±0.89 13.11±1.27* 4.45±0.23# 15.56±1.39# 3.074 0.000 1 SOD 15.23±1.85 4.28±0.75* 10.77±1.01# 5.29±1.33# 4.256 0.000 1 Bax 2.08±0.07 15.48±2.65* 4.82±0.84# 19.66±3.48# 2.835 0.000 1 BCL2 32.33±0.12 4.67±3.33* 29.88±1.52# 8.66±1.25# 4.117 0.000 1

表2 四組小鼠相關(guān)基因mRNA水平（）

HIF-1α在低氧條件下存在，高氧環(huán)境中被降解，被認(rèn)為參與生物體低氧環(huán)境中適應(yīng)性調(diào)控。而當(dāng)發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)，HIF-1α被認(rèn)為與NF-κB的激活密切相關(guān)。已經(jīng)有超過(guò)100種基因被發(fā)現(xiàn)可以作為HIF-1α的靶基因進(jìn)行細(xì)胞調(diào)控，例如細(xì)胞凋亡。而HIF-1α除了在缺氧條件下表達(dá)，非缺氧狀態(tài)下也有穩(wěn)定表達(dá)，而其功能會(huì)受到NF-κB的調(diào)控，有研究顯示若體內(nèi)NF-κB表達(dá)缺失，即使創(chuàng)造缺氧環(huán)境并延長(zhǎng)時(shí)間，HIF-1α也不會(huì)被激活。Toll樣受體TLR4是NF-κB的上游，當(dāng)發(fā)生缺血損傷時(shí)，心肌組織會(huì)釋放損傷相關(guān)蛋白將TLR4激活，進(jìn)而激活NF-κB，使得心肌損傷增強(qiáng)，由此可見，TLR4也可指示細(xì)胞的炎性應(yīng)激以及受損傷水平［19］。

超氧化物歧化酶SOD是細(xì)胞內(nèi)一種主要的抗氧化酶，用于清除細(xì)胞內(nèi)氧化自由基，因而避免了自由基帶給機(jī)體的危害。SOD水平高低可以反映細(xì)胞內(nèi)氧化水平的高低。若SOD水平上升，說(shuō)明活性氧水平升高，使細(xì)胞容易激發(fā)炎性應(yīng)激過(guò)程。

而當(dāng)?shù)蛲鲂盘?hào)出現(xiàn)時(shí)，抗凋亡蛋白BCL2表達(dá)會(huì)降低，則不能結(jié)合抑制促凋亡蛋白Bax，則Bax可結(jié)合到線粒體外膜改變其通透性［20］，最終使細(xì)胞色素c釋放到胞漿中引起內(nèi)源途徑的凋亡。

本次研究發(fā)現(xiàn)，在進(jìn)行處理之前，四組小鼠的AAR/LV以及An/AAR差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；經(jīng)過(guò)處理后，I/R組小鼠的AAR/LV以及An/AAR均顯著高于對(duì)照組（P＜0.001），DMOG+I/R組相比I/R組，AAR/LV以及An/AAR均發(fā)生了顯著降低（P＜0.001），YC-1+I/R組相比I/R組，AAR/LV以及An/AAR又均發(fā)生了顯著升高（P＜0.01），說(shuō)明心肌缺血再灌注過(guò)程中心肌組織的缺血以及梗死面積增多，而當(dāng)加強(qiáng)HIF-1α的作用時(shí)可以顯著減少心肌組織缺血面積或者梗死面積的比例，當(dāng)減弱HIF-1α的作用時(shí)心肌組織缺血面積或者梗死面積比例又顯著上調(diào)；當(dāng)小鼠發(fā)生心肌缺血/再灌注時(shí)，小鼠體內(nèi)的HIF-1α蛋白水平顯著下調(diào)，炎癥因子NF-κB和TLR4顯著上升，抗氧化蛋白SOD顯著下降，促凋亡蛋白Bax顯著升高，抗凋亡蛋白BCL2水平顯著下降，表明心肌細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激發(fā)生炎癥反應(yīng)，并誘發(fā)凋亡；而當(dāng)在此基礎(chǔ)上加入HIF-1α增強(qiáng)劑DMOG時(shí)，可以使炎癥因子NF-κB和TLR4顯著下調(diào)，抗氧化蛋白SOD顯著上升，促凋亡蛋白Bax顯著下降，抗凋亡蛋白BCL2水平顯著升高，加入HIF-1α抑制劑YC-1現(xiàn)象相反，表明HIF-1α有利于保護(hù)心肌細(xì)胞；I/R組小鼠的NF-κB和TLR4水平顯著升高（t=4.687，5.124，P＜0.05），DMOG+I/R組相比I/R組，其NF-κB和TLR4水平發(fā)生顯著下降（t=4.112，4.197，P＜0.05），YC-1+I/R組相比I/R組，其NF-κB和TLR4水平發(fā)生顯著回升（t=2.335，2.138，P＜0.05）；經(jīng)過(guò)處理之后，對(duì)照組小鼠的MPO活性為（0.28±0.54），I/R組小鼠的為（1.45±0.31），顯著升高（t=3.875，P＜0.05），DMOG+I/R組的為（0.88±0.23），相比I/R組發(fā)生了顯著降低（t=3.224，P＜0.05）；而YC-1+I/R組的為（1.98±0.39），相比I/R組發(fā)生了顯著回升（t=3.015，P＜0.05），證明HIF-1α的存在可以抑制中性粒細(xì)胞的活性。由此顯示，HIF-1α可有效減輕大鼠在心肌損傷/再灌注所致的炎性損傷并避免心肌細(xì)胞凋亡，對(duì)心肌細(xì)胞起到良好的保護(hù)作用。DMOG有利于穩(wěn)定HIF-1α的表達(dá)及水平，從而更好地保護(hù)心肌細(xì)胞，為臨床上治療心肌缺血藥物研發(fā)提供理論以及和實(shí)踐基礎(chǔ)。