IL-6對體外培養的牛眼小梁細胞中纖維連接蛋白的影響

劉 攀，孟 杰，劉玉震，王 強

0引言

原發性開角型青光眼(primary open angle glaucoma，POAG)是一類以房角開放、眼壓緩慢升高為特征的青光眼，具體的病理機制還不十分清楚。目前傳統觀點認為，其眼壓的緩慢升高與小梁網組織的結構和功能發生改變導致房水流出阻力升高有關。當前多采用眼壓監測和全自動視野機等輔助檢查診斷POAG。而有研究指出，大于35%的就診者在被發現視野缺損之前可能已經出現了視神經節細胞的丟失[1]，并且有流行病學統計報道，在有診斷意義的POAG視神經損害的受試者中，約50%患者眼壓低于21mmHg[2]。因此僅以視野檢查和眼壓檢查作為POAG早期篩查的方法是非常局限的。白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)是常見的一種促炎性因子，其在多種疾病中發揮作用。有研究發現其通過與T細胞、B細胞和巨噬細胞相互作用可參與氧化應激和炎癥作用的過程[3-4]；還有研究指出，IL-6可以通過增加纖維連接蛋白(fibronectin，FN)表達的方式加速瘢痕增生并誘導肺動脈高壓形成[5-6]，在剝脫綜合征中，IL-6參與和促進了FN蛋白的生成，并誘導了開角型青光眼的產生[7]。目前國內外有多篇文獻報道，在POAG患者的房水和外周血液中，IL-6的含量較非青光眼患者均有所下降[8-11]，而此種改變對患者產生了何種影響尚無報道。因此我們推測IL-6的此種改變在視網膜神經節細胞死亡和青光眼的發病機制中可能對FN存在影響，并以此改變POAG進程。本實驗通過體外培養牛眼小梁細胞并模擬IL-6濃度改變的過程，進一步監測FN的變化，為探討青光眼患者發病時IL-6濃度變化對其病情進展產生的作用，以及POAG的篩查與治療提供新思路。

1材料和方法

1.1材料新鮮摘取的2歲以下公牛眼球；胎牛血清、高糖DMEM培養基、胰酶(美國Hyclone公司)；PBS、BSA(北京Solarbio科技有限公司)；Trizol試劑盒、逆轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒(日本Takara公司)；牛IL-6蛋白凍干粉、牛FN蛋白單克隆抗體(美國Abcam公司)。

1.2方法

1.2.1牛眼小梁細胞的原代培養和鑒定采用組織塊培養法，摘取新鮮的牛眼眼球，去除眼外肌、結膜和筋膜組織，并用75%乙醇浸泡眼球5min，轉移至超凈工作臺中，距角膜緣約4mm處環形剪開眼球。翻轉眼前節組織，去除玻璃體，輕輕地撕除晶狀體和虹膜組織，體視顯微鏡下于白色的鞏膜突和Schwalbe線之間撕取小梁組織，平鋪于預置2mL胎牛血清的培養皿中，待組織貼壁干燥后加入8mL含20%胎牛血清的高糖培養基中，將培養皿放入體積分數5% CO2、37℃的細胞培養箱中。待細胞爬出并融合，采用貼壁細胞傳代的方法，傳代并培養至第3代。

1.2.2 IL-6工作液制備以超速離心機在4℃下3000r/min離心2min，使所有IL-6凍干粉沉積于EP管底。以無菌PBS溶液制備10mL的0.1% BSA溶液，以此PBS-BSA溶液復溶IL-6干粉并吹打，制成濃度為10μg/mL工作母液。取1mL 0.1% PBS-BSA溶液為A組(對照組)；取1μL母液溶于10mL 0.1% BSA溶液制成終濃度為0.1ng/mL的B組工作液；同樣方法制備濃度為0.5、1ng/mL的C組和D組工作液。

1.2.3 IL-6對小梁細胞的干預將生長良好的第3代牛眼小梁細胞接種于6孔細胞培養板，培養24h待細胞鋪滿，以PBS沖洗培養板，分別加入2mL前述A～D組工作液，繼續培養24h。

1.2.4實時熒光定量PCR法檢測各組牛眼小梁細胞中FN mRNA的表達分別提取4組細胞的總mRNA，用分光光度計測定所提mRNA的濃度和純度，含量為1.5～2.0g/L；260nm與280nm處的吸光度比值為1.8～2.0。按照逆轉錄試劑盒說明書的步驟合成cDNA，并進行實時熒光擴增，以β-actin為內參照，內參及目的基因FN引物由上海生工生物技術有限公司合成。β-actin引物序列：上游：5’-CCATCGGCAATGAGCGGTTCC-3’，下游：5’-CGTGTTGGCGTAGAGGTCCTTG-3’；FN引物序列：上游：5’-TGGCGAGTGGAAGTGTGAGAGG-3’，下游：5’-ATACGGAGGCGGCTGAGGATG-3’。反應條件為：95℃預變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環，每次擴增均設置β-actin為內參對照。2-ΔΔCt法計算FN mRNA的相對表達量。實驗重復3次，每組設3個復孔。

1.2.5蛋白質免疫印跡法檢測各組牛眼小梁細胞中FN蛋白的表達取4組細胞使用預冷PBS洗滌3遍，棄去洗滌液。每孔細胞加400μL含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，用移液槍轉移至離心管中，4℃、12 000r/min，離心5min，將上清轉入一預冷的潔凈EP管中，即得所需蛋白；測量蛋白濃度，按4∶1的濃度加5×上樣緩沖液，煮沸15min，聚丙烯酰胺凝膠100V恒壓電泳分離60min后，轉移至PVDF膜上，用稀釋濃度分別為1∶1000和1∶4000的鼠來源的牛FN一抗和HRP標記的山羊抗鼠二抗進行免疫酶聯反應，曝光，得到膠片圖像。利用Image J軟件對所得灰度圖像進行拍照和定量分析，得到目的蛋白FN與內參β-actin灰度的比值作為目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次，每組設3個復孔。

2結果

2.1牛小梁細胞的原代培養和鑒定小梁組織塊培養7～9d后可見大量細胞自組織邊緣爬出，呈長梭形、多角形，邊界清晰，排列緊密，大小不一，生長狀態良好(圖1A)。培養至第3代的牛小梁細胞形態和大小變化情況趨于穩定，細胞中可見圓形細胞核，細胞內色素顆粒增多，符合既往本實驗室所培養的牛眼小梁細胞形態特征[12](圖1B)。

2.2小梁細胞在不同IL-6濃度下FN mRNA的變化實時熒光定量PCR檢測結果顯示，各組分別在0、0.1、0.5、1ng/mL IL-6刺激下FN mRNA的相對表達量分別為1.000±0.000、0.213±0.004、0.056±0.001、0.019±0.002，4組間差異有統計學意義(F=77.13，P=0.001，圖2)。不同濃度IL-6下培養的牛眼小梁細胞產生的FN mRNA量呈下調趨勢(rs=-0.713，P<0.05)。經LSD-t檢驗行兩兩比較：0ng/mL組與0.1、0.5、1ng/mL組間差異均有統計學意義(均P<0.001)；0.1ng/mL組與0.5、1ng/mL組間差異均有統計學意義(P=0.03、0.01)；0.5ng/mL組與1ng/mL組間差異有統計學意義(P=0.049)。

圖1小梁細胞形態學鑒定A：倒置顯微鏡下可見培養9d的牛眼小梁細胞從小梁組織塊周邊游出，貼壁生長，形態多樣(×100)；B：第3代小梁細胞形態趨于穩定，呈梭形，有較多突起，細胞內可見色素顆粒(×200)。

圖2不同濃度IL-6干預下各組小梁細胞中FN mRNA相對表達量。

圖3不同濃度IL-6干預下各組小梁細胞中FN蛋白表達量的比較A：FN蛋白電泳圖；B：FN蛋白相對表達量。

2.3小梁細胞在不同IL-6濃度下FN蛋白的變化蛋白質免疫印跡法顯示，各組分別在0、0.1、0.5、1ng/mL IL-6刺激下FN蛋白相對表達含量分別為1.167±0.012、0.662±0.009、0.238±0.011、0.061±0.011，4組間差異有統計學意義(F=95.01，P=0.01，圖3)。不同濃度IL-6下培養的牛眼小梁細胞產生的FN 蛋白量呈下調趨勢(rs=-0.901,P<0.05)。兩兩比較采用LSD-t檢驗：0ng/mL組與0.1、0.5、1ng/mL組間比較差異有統計學意義(P=0.01、<0.001、<0.001)；0.1ng/mL組與0.5、1ng/mL組間差異有統計學意義(P=0.01、<0.001)；0.5ng/mL組與1ng/mL組間差異有統計學意義(P=0.04)。

3討論

目前POAG的確切病因還未完全證實，有學說認為，小梁網組織是房水流出通道中最重要的一環，原發性開角型青光眼房角開放但眼壓升高是由于小梁組織的局部病變造成小梁途徑房水引流系統發生了病變，房水流出阻力增加所致[13]。同時也有文獻證明氧化應激損傷是導致POAG的病理原因之一[14]，有證據支持氧化應激作為視網膜神經節細胞(retinal ganglial cells，RGCs)的亞細胞區的組成部分，參與了青光眼性的神經退行性變；除了直接的細胞毒性導致RGCs死亡外，ROS還很可能通過酶氧化特定的氨基酸殘基，并且作為第二信使和/或通過氧化還原修飾下游效應物以調節蛋白功能，從而參與RGCs死亡信號的傳遞[15]。多種學說交匯，仍未有統一定論。

關于青光眼引起的組織損傷，目前大部分學者公認是由于眼壓升高對神經元、篩板和血管的機械性壓迫損傷。小梁網作為傳統的房水流出通道中最重要的組織之一，其上有大量的小梁細胞內襯其中，位于近小管區和Schlemm管前部，是房水外流阻力最大的部分，其功能及其形態結構的變化直接影響了眼壓的變化[16-18]。有實驗指出，小梁網的內皮細胞和血管內皮細胞有分泌IL-6的功能[19]。而在POAG的基礎和臨床研究中，有學者發現了POAG患者房水和血液中IL-6表達含量較非青光眼患者有所下降[8-11,20]，且房水引流通道中FN蛋白表達有所升高[21]。還有研究指出，POAG患者經過6mo以上局部降眼壓藥物治療后，眼表的IL-6水平較正常人有所回升[22]。

細胞外基質重塑對小梁網的結構改變起到了不可或缺的影響[23-24]。FN蛋白是已知的細胞外基質之一，其不僅能通過增加小梁網細胞中整合素α5β1和α4β1的表達以促進小梁網細胞增殖、黏附和遷移能力[25-26]，并且FN蛋白的剛度與小梁組織的剛度呈正相關[27]，即FN蛋白數目與質量對小梁組織形態結構起到了影響。當前在多種疾病中都發現有IL-6對FN蛋白影響的報道。例如剝脫綜合征是一類與年齡有關的彈性纖維系統疾病，其特征是細胞外基質中纖維物質的病理性沉積，其在眼部表現為晶狀體皮質在房角的物理堆積導致眼壓升高，激發開角型青光眼。而有實驗證明在剝脫綜合征導致的繼發性開角型青光眼中，IL-6參與誘導了纖維連接蛋白1(FN1)和TGF-β1的表達[7]。在增生性瘢痕(HS)形成的病理機制中，與正常成纖維細胞相比，HS中的細胞因子IL-6受體被激活引起輔助T淋巴細胞在STAT3中表達上升；同時STAT3肽會抑制FN凋亡基因的表達；在HS中，研究人員發現細胞增殖標記物Cyclin D1、Bcl-X1和c-Myc表達均較正常人高[28]。

TGF-β是一組可調控細胞生長、分化和凋亡的細胞因子，其參與的多條細胞信號傳導通路是促進細胞和組織纖維化的重要途徑。曾有實驗指出：在體外培養的人眼小梁細胞中TGF-β2眼內灌流可使房水流出率減少約27%，并且促進Schlemm管內壁多層結構中細胞外基質的聚集[29]，即TGF-β信號通過積累細胞外基質的方式增加房水引流阻力，升高眼壓。Seong等[30]曾指出IL-6參與TGF-β誘導人肌腱成纖維細胞向肌成纖維細胞的分化過程，并以此作為結膜下纖維化的重要過程。有日本學者曾做出實驗表示，可溶性IL-6反式信號(sIL-6)與其受體sIL-6R結合可增強STAT3磷酸化，同時sIL-6與受體結合后表現出以抑制Smad2的方式抑制TGF-β受體的作用，而當TGF-β受體過度表達又將反作用抑制sIL-6反式信號的分泌和生成[10]。綜上所述，sIL-6反式信號以激活HTM中STAT3的方式抑制了TGF-β導致的纖維化。房水中同時存在著IL-6及其受體，以上實驗反而言之，在POAG患者前房中，當IL-6濃度降低，IL-6與受體結合減少，TGF-β含量上升，同時IL-6-STAT3軸由于負反饋而被破壞，FN及其他細胞外基質生成增多后堆積且降解降低，導致了房水引流受阻。而本實驗證實，IL-6通過影響FN轉錄與蛋白表達的方式，呈現出與FN的負相關關系，即IL-6濃度越低，FN mRNA轉錄能力增強，小梁細胞產生的FN蛋白越多，側面證實了上述眾實驗的結論。不僅如此，我們還認為，當眼壓升高破壞血-房水屏障，可以使得房水中IL-6進入血管內壁，IL-6可通過改善細胞內吞與轉運增加血管內皮通透性[31-33]，從而使得血管中液體及其他促炎因子滲出，增加房水含量與前房炎癥反應，能夠進一步加重POAG患者眼部表現。

由于時間有限，本實驗并未加入IL-6抗體測得抗IL-6與FN的關系，是該實驗的局限性。下一步將由本實驗室進一步印證IL-6與POAG之間的關系，以期IL-6的研究能夠為POAG的早期篩查與治療帶來新的治療思路和方法，以更加低廉、有效的途經解決患者病痛。

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摘編自2018版《中國科技期刊引證報告》核心版和擴展版(括號里面為擴展版的統計指標)