高產γ-谷維素的雜糧基質篩選及工藝優化

楊玉潔，曾海英*，顧其麗，毛佳怡，宋增光

（貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025）

γ-谷維素（γ-oryzanol）是由三萜烯醇類為主體，阿魏酸酯與甾醇類阿魏酸酯組成的混合物，廣泛存在于多種植物油中[1-3]。其最早在米糠油中發現，甾醇部分主要為菜油甾醇（campesterol）、谷甾醇（sitosterol），三萜醇部分主要是環木菠蘿烯醇（cycloartenol）、2,4-亞甲基環木菠蘿烯醇（2,4-methylene cycloartanol）[4]，其被認為是最有效的天然抗氧化劑之一，含量及成分在不同品種之間存在顯著差異[5-6]。國內外大量研究證明，γ-谷維素除了具有清除自由基、抗氧化的作用外[7-9]，還能降血脂[10-11]、調節糖代謝[12-13]、抗炎癥[14]，且具有調節神經系統[15]、消化系統[16]、治療心血管疾病[17-18]等功效。洛伐他汀（lovastatin）是美國食品及藥物管理局（food and drugadministration，FDA）于1987年批準的第一種降低膽固醇的他汀類藥物，能降低心血管和腦血管發病率[19]，目前其生產主要來源于紅曲菌發酵[20]。

目前，γ-谷維素的制備主要采用物理和化學方法[21]，通過生物轉化獲得谷維素的研究甚少。采用微生物合成以提高其功能性成分含量的方法已成為廣泛關注的熱點科學問題[22]，如利用微生物發酵生產單細胞蛋白[23]；從可再生原料直接發酵生產L-絲氨酸[24]等。賀圣凌等[25]利用紅曲霉菌發酵薏米糠，使米糠中γ-谷維素與α-生育酚含量明顯增加；KELLY C M等[26]研究證實，采用米根霉米糠固態培養提高了γ-谷維素的回收率，改善了米糠的功能特性。

貴州地理優勢獨特，小宗糧食豐富，且營養價值較高，但目前深度開發仍較匱乏，因此，如何結合區域特點，變資源優勢為經濟優勢，成為企業與科技工作者們共同關注的問題。本研究擬采用微生物發酵轉化法開發貴州特色雜糧薏米、苦蕎、燕麥米、小米，以篩選最適產γ-谷維素的雜糧基質，并通過單因素及正交試驗優化篩獲高產γ-谷維素的雜糧發酵工藝參數，為貴州特色雜糧精深加工開發，提高雜糧品質及功能活性提供技術支撐及工藝參數。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料和菌株

薏米：貴州仁信農業開發有限公司；苦蕎米：貴州省威寧縣東方神谷有限責任公司；燕麥米、小米、大米：貴陽市花溪區。紫紅曲霉菌（Monascus purpureus）3.462 9：中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 化學試劑

正己烷（色譜純）：天津科密歐化學試劑有限公司；γ-谷維素標品（純度99.9%）、洛伐他汀（純度99.9%）：美國西格瑪公司；其他化學試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potatodextroseagar，PDA）培養基：北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.2 儀器與設備

TCL-16B高速臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；KQ3200E型超聲波清洗器：昆山市超聲波儀器有限公司；101-0AB型電熱鼓風干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司；DK-8D三孔電熱恒溫水槽：上海一恒科學儀器有限公司；LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；HH-B11·600BY電熱恒溫培養箱：上海躍進醫療器械有限公司；800-Y高速多功能粉碎機：永康市鉑歐五金制品有限公司；TU-1810PC紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；1260高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀（配有可變波長紫外檢測器和色譜工作站）：美國安捷倫（Agilent）公司。

1.3 方法

1.3.1 發酵方法

紫紅曲霉孢子懸浮液的制備：紫紅曲霉斜面培養基中加入30 mL無菌水，采用接種環輕刮菌落表面將菌絲及孢子洗下，隨即移入帶玻璃珠的無菌三角瓶中，充分振蕩均勻并過濾。

紫紅曲霉種子液的制備：取大米粉0.9 g、NaNO30.15 g、KH2PO40.045 g、MgSO40.03 g于150 mL三角瓶中，加入蒸餾水30 mL，121℃滅菌20 min，接入紫紅曲霉孢子懸浮液1.5 mL，于30℃、180 r/min搖床培養3 d。

雜糧固態發酵：將薏米、苦蕎、小米、燕麥米與大米浸泡6 h后瀝干，分別稱取30 g于250 mL三角瓶中，雜糧與蒸餾水料液比為3∶1（g∶mL），121 ℃滅菌20 min，接入8%紅曲菌種子液（活菌含量≥108CFU/mL），于30℃靜置培養9 d。

1.3.2 分析檢測

（1）色價測定

參照國標GB 1886.19—2015《食品安全國家標準食品添加劑紅曲米》。

（2）γ-谷維素含量的測定

采用高效液相色譜法測定。

樣品處理：將發酵物置于60℃干燥箱中烘干至恒質量，取出用粉碎機粉碎，過60目篩。稱取雜糧粉1g，加入5mL正己烷，振蕩充分混勻，于60℃水浴鍋中加熱20min，3000r/min離心10 min，吸取上清液，重復提取3次，合并上清液。旋轉蒸發揮干提取液，揮干物中加入1 mL正己烷，超聲完全溶解，3 000 r/min離心10 min，吸取上清液過濾膜入進樣瓶。

HPLC色譜條件：SUPELCOSILTMLC-SI色譜柱（25cm×4.6mm，5μm）；流動相：含0.8%乙酸乙酯與0.8%冰乙酸的正己烷溶液；洗脫方式：等度洗脫；進樣量：80μL；流速：1.5mL/min；柱溫：22℃；檢測波長：290 nm；檢測器：紫外檢測器[25]。得到標準曲線方程為：y=64 957x+150.96，相關系數R2=0.999 8。

（3）洛伐他汀的測定

采用高效液相色譜法測定。

HPLC色譜條件：以甲醇為浸提液超聲提取30 min，8 000 r/min離心15 min，吸取上清液，重復提取3次，合并上清液定容至10 mL，過濾膜入進樣瓶。AgilentTC-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇：0.1%磷酸水=80∶20（V/V）；洗脫方式：等度洗脫；進樣量：10μL；流速：1mL/min；檢測波長237nm；柱溫；30℃；檢測器：紫外檢測器[27]。得到標準曲線方程為：y=37.05001x+12.42066，相關系數R2=0.9997。

1.3.3 發酵條件優化單因素試驗

選取初始pH值、料液比、接種量及發酵溫度進行單因素試驗。設置初始pH值分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0（料液比3∶1（g∶mL），接種量8%，發酵溫度30 ℃）；料液比水平分別為15∶1、6∶1、3∶1、2∶1、3∶2（g∶mL）（初始pH值6.0，接種量8%，發酵溫度30℃）；接種量水平分別為4%、8%、12%、16%、20%（初始pH值6.0，料液比3∶1（g∶mL），發酵溫度30 ℃）；發酵溫度分別為26℃、28℃、30℃、32℃、34℃（初始pH值6.0，料液比3∶1（g∶mL），接種量8%），發酵完成后檢測樣品中γ-谷維素含量。

1.3.4 發酵條件優化正交試驗

在單因素試驗基礎上，選取料液比（A）、接種量（B）及發酵溫度（C）3個因素，每個因素設置3個水平進行正交試驗。正交試驗各因素與水平設計見表1。

表1 發酵條件優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation process optimization

1.3.5 統計分析

每個試驗處理重復3次，采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 紅曲發酵雜糧感官分析

將發酵物置于60℃干燥箱中烘干至恒質量，取出用粉碎機粉碎，得到雜糧粉，過60目篩（見圖1），以未發酵雜糧為空白對照組（CK組），對雜糧粉進行色價測定，結果見圖2。

圖1 各雜糧基質發酵前后外觀對比圖Fig.1 Comparison of the appearance before and after fermentation of each coarse cereals matrix

由圖1可知，經紫紅曲霉發酵后，各雜糧基質均呈現出紅色。小米相比其他雜糧顏色較淺，呈褐色。原因是小米顆粒經高溫高壓滅菌后粘性增加，導致顆粒間空氣不能良好流通，因紫紅曲霉為好氧菌而只能在其表面生長而難以均勻分布在小米顆粒上，不利于紅曲色素的累積。其他雜糧與小米相比滅菌后粘性較小，顆粒松散，有助于紫紅曲霉均勻生長分布在顆粒表面。說明紫紅曲霉可作為適生菌株在薏米、苦蕎、燕麥與大米基質上生長，累積紅曲色素，而小米基質色素累積效果不佳。

不同大寫字母表示差異極顯著（P＜0.01）。圖2 紅曲霉菌發酵后各雜糧基質色價對比Fig.2 Comparison of color value of each coarse cereals matrix after fermented by Monascus purpureus

由圖2可知，各雜糧基質發酵后色價呈顯著性差異（P＜0.01）。小米色價最低，僅為475.05 U/g，曹晉宜等[28]制備的薏米、苦蕎與小米雜糧紅曲中，小米的色價也為最低，與本實驗結果相符。其次為薏米，色價為664.24 U/g，較苦蕎、燕麥和大米色價低。大米色價最高，達1 340.83 U/g，高于苦蕎（1 099.21 U/g）與燕麥（827.59 U/g）。色價由高到低順序依次為：大米＞苦蕎＞燕麥＞薏米＞小米，表明紫紅曲霉發酵雜糧能達到累積紅曲色素的目的，其中以大米與苦蕎作為發酵基質效果較好。

2.2 產γ-谷維素發酵雜糧基質的篩選

圖3 γ-谷維素標品及各雜糧紅曲發酵產物正已烷提取物中γ-谷維素分析HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of γ-oryzanol standard and γ-oryzanol in hexane extract of coarse cereals fermented by Monascus purpureus

測定雜糧紅曲發酵產物正己烷提取物中γ-谷維素的含量，HPLC色譜圖見圖3。結合γ-谷維素標準曲線，以未發酵雜糧為對照組，進一步對雜糧紅曲發酵產物正己烷提取物中的γ-谷維素含量進行定量分析。結果見圖4。

由圖3可知，γ-谷維素標品出峰時間在36.295 min，經紫紅曲霉發酵后，薏米、苦蕎、小米、燕麥、大米紅曲發酵產物正已烷提取物中γ-谷維素的出峰時間分別為36.508 min、36.476 min、36.554 min、36.531 min、36.563 min，其中苦蕎紅曲發酵產物正己烷提取物的峰面積最大。

圖4 各雜糧紅曲發酵產物正已烷提取物中γ-谷維素含量對比Fig.4 Comparison of γ-oryzanol contents in hexane extract of coarse cereals fermented by Monascus purpureus

由圖4可知，苦蕎紅曲發酵產物正己烷提取物中γ-谷維素增量最大，從0.08 mg/mL增加到1.10 mg/mL，與其余3種雜糧和大米差異顯著（P＜0.05）。小米經高壓滅菌后黏性大，紫紅曲霉不能均勻生長，對發酵底物的利用率低，生長不旺盛，阻礙了代謝物的產生，因此，發酵完成后γ-谷維素含量較低。薏米、燕麥和大米紅曲發酵產物正己烷提取物中γ-谷維素含量分別為0.85 mg/mL、0.79mg/mL、0.85 mg/mL，差異不顯著（P＞0.05），但與發酵前相比γ-谷維素含量均呈現顯著性增長（P＜0.05）。苦蕎比其余3種雜糧與大米吸水性都好，經浸泡后能更好地儲存水分，且滅菌后顆粒松散，存在空隙保證了空氣流通，有利于紫紅曲霉的生長和代謝，故苦蕎紅曲發酵產物正己烷提取物中γ-谷維素含量最高。為獲得高產γ-谷維素雜糧發酵體系，選擇苦蕎作為培養基質進行后續發酵工藝優化。

2.3 高產γ-谷維素發酵工藝優化

2.3.1 單因素試驗

初始pH值、料液比、接種量與溫度對苦蕎紅曲發酵產物正己烷提取物中γ-谷維素含量的影響結果見圖5。

由圖5a可知，初始pH值為5.0時，γ-谷維素含量達到峰值1.52 mg/mL，之后顯著降低（P＜0.05），紫紅曲霉是嗜酸菌，偏酸性的環境有利于紅曲菌生長代謝，這與遇靚[29]的試驗結果相符。γ-谷維素含量在初始pH值3.0～5.0范圍內差異不顯著（P＞0.05），說明在酸性環境下，初始pH值對γ-谷維素含量影響不大，因此，在后續發酵過程中，初始pH值設定為5.0。

圖5 發酵條件對苦蕎紅曲發酵產物正已烷提取物中γ-谷維素含量的影響Fig.5 Effect of fermentation conditions on γ-oryzanol contents in hexane extract of tartary buckwheat fermented by Monascus purpureus

由圖5b可知，各雜糧紅曲發酵產物正己烷提取物中γ-谷維素含量隨料液比的升高而增大，在料液比為3∶1（g∶mL）時達到峰值，為0.93 mg/mL，含水量過高會導致苦蕎發酵基質發黏，透氣性不佳，紅曲菌生長受阻，因此，γ-谷維素含量顯著下降。因此，確定最佳料液比為3∶1（g∶mL）。

由圖5c可知，接種量＜8%時，菌體繁殖速度慢，不利于目標產物的生成，因此，γ-谷維素含量低；接種量為8%時，γ-谷維素含量最高，達到1.28 mg/mL；但發酵體系中的營養物質有限，接種量過高，菌體數量達到一定程度時，反而會制約菌體生長及代謝產物的形成，因此接種量＞8%之后，γ-谷維素含量顯著下降。因此，確定最佳接種量為8%。

由圖5d可知，發酵溫度為26～30℃范圍內，γ-谷維素含量與發酵溫度呈正相關，在30℃時達到峰值1.03mg/mL，較高的溫度（30℃）有利于紫紅曲霉菌體的生長[30]；發酵溫度＞30℃后，溫度過高影響紫紅曲霉正常生長代謝，γ-谷維素含量隨溫度的升高而降低。因此，確定最適初始pH值為5.0，料液比為3∶1（g∶mL），接種量為8%，發酵溫度為30 ℃。

2.3.2 正交試驗優化發酵工藝

根據單因素試驗結果，說明在酸性條件下初始pH值對γ-谷維素含量影響不大，初始pH值為5.0時γ-谷維素含量相對較高，因此，在后續發酵過程中，初始pH值設定為5.0。因此以料液比（A）、接種量（B）與發酵溫度（C）為試驗因素，以γ-谷維素含量為評價指標，考察發酵過程中不同因素對其含量的影響。正交試驗設計與結果見表2，其方差分析結果見表3。

表2 發酵工藝優化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation process optimization

由表2可知，在紫紅曲霉發酵苦蕎基質過程中，各因素對γ-谷維素含量的影響依次為：接種量＞發酵溫度＞料液比，即接種量對γ-谷維素含量影響最大，其次為發酵溫度，料液比對γ-谷維素含量影響最小。優化后最佳發酵條件組合為A2B2C2，即料液比為3∶1（g∶mL），接種量8%，發酵溫度30℃。在此優化條件下發酵苦蕎基質9 d后，測得發酵產物正己烷提取物中γ-谷維素含量為1.59 mg/mL，比優化前提高了44.55%。此外，測得色價為1 428.77 U/g，洛伐他汀質量濃度為132 μg/mL。表明紫紅曲霉固態發酵苦蕎基質不僅能夠增加γ-谷維素含量，同時還能獲得較高色價的紅曲色素以及具有降低膽固醇[31]功能的洛伐他汀活性組分。由表3可知，料液比、接種量與發酵溫度3個因素對γ-谷維素含量均有極顯著影響（P＜0.01）。

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

3 結論

經紫紅曲霉發酵后，各雜糧（薏米、苦蕎、小米、燕麥）與大米正己烷提取物中γ-谷維素含量均有顯著提高，其中苦蕎基質最為明顯，γ-谷維素含量從0.08 mg/mL增加到1.10mg/mL。以苦蕎作為培養基質進行后續工藝參數優化，得到最佳發酵參數：料液比為3∶1（g∶mL），紫紅曲霉接種量8%，發酵溫度30℃。在此優化發酵工藝條件下發酵9d，γ-谷維素含量為1.59 mg/mL，比優化前提高了44.55%，同時測得紅曲色價1 428.77 U/g，洛伐他汀質量濃度為132 μg/mL。通過生物轉化實現特征性活性組分γ-谷維素的富集，不僅拓展了紅曲米的研究方向，為開拓多功能性紅曲產品奠定了基礎，也對貴州特色雜糧的精深加工和深度開發提供了理論指導與技術支撐。