代謝組學法研究轉錄因子SlNAC4對番茄果實代謝產物的影響

鄭海英，張冬青，趙曉丹*

（北京工商大學食品學院，北京 100048）

番茄作為消費者喜愛且營養豐富的果蔬，是肉質果實研究的模式材料。轉錄因子NAC（NAM、ATAF1/2、CUC2）的變化影響番茄果實色素和硬度等品質指標[1]。運用代謝組學研究轉錄因子NAC對番茄代謝產物的影響，可以豐富番茄相關研究的理論內容，也對改善番茄品質具有重要意義。

在植物中，轉錄因子NAC顯著特點是有一個高度保守的N端NAC結構域，有5 個保守的子域（A～E），還有一個不同的轉錄調節C端能啟動和抑制多種靶基因的轉錄[2-3]。研究結果顯示番茄中一共有104 個NAC基因[4]，分布在12 條染色體上，其中NAC4位于第I條染色體上，編碼蛋白長413 aa，分子質量46.93 kDa[5]。Riahi等[6]測序50 份野生葡萄和73 個葡萄品種發現NAC4轉錄基因編碼區纈氨酸變成異亮氨酸，功能性候選基因在物種進化過程中為適應環境而發生基因變異，說明轉錄因子在植物發育和脅迫調控等生命活動中發揮著關鍵作用。據研究，硬皮豆在不同鹽度、寒冷、干旱和脫水脅迫條件下，NAC4基因表達均有一定的調節，尤其是鹽脅迫導致NAC4轉錄水平增加了6 倍，NAC4基因通過載體克隆表達，在大腸桿菌的細胞轉化后，NAC4蛋白增強了大腸桿菌細胞耐鹽脅迫能力，表明NAC4基因可適合作為提高植物對鹽脅迫和其他非生物脅迫耐受性的遺傳候選基因[7]。落花生中Mu轉錄因子NAC4能調控植株抗旱功能，MuNAC4基因的過表達，在干旱環境下能減少對細胞膜的損害、增強膜的滲透性和抗氧化酶的活性[8]。植株抗脅迫能力的強弱勢必會影響果實成熟過程中的代謝水平，轉錄因子NAC4是影響果實成熟的重要因素。沉默NAC4基因，果實軟化相關基因EXP/LOX/PG/PL的表達下調，顯著抑制果實軟化酶活性，延緩果實軟化進程，導致果實呼吸速率降低，乙烯含量下降，延緩葉綠素降解和類胡蘿卜素積累的速度，果實無法正常變紅[9]。Shan Wei等[10]研究轉錄因子NAC在香蕉成熟過程中的表達情況，發現果皮和果肉中NAC4轉錄水平降低，表明NAC4可能通過與乙烯信號物質的相互作用參與香蕉果實的成熟。有研究顯示NAC4調控植物對氮的運輸功能，氮是蛋白質、葉綠素、核酸、酶、生物激素等重要成分，轉錄因子NAC4主要是通過作用中柱鞘細胞中AFB3基因，影響應答硝酸鹽的側根基因密度[11]，并增強植物的耐鹽能力[12]。植株生理上的變化勢必影響果實的成熟基質，相關研究也表明轉錄因子NAC4確實在植株生長和果實成熟過程中具有影響基體代謝水平的重要作用。

本實驗以正常番茄和SlNAC4沉默的番茄為研究對象，采用代謝組學法全面分析兩組番茄在破色期的代謝產物分布情況。代謝組學法是對植物中的化合物分布進行全面探索的一種有效方法，能夠找出差異代謝產物[13]，進而挖掘可能發生變化的代謝通路[14]，掌握植物生長發育中的多種生理信息[15]，對果實的品質[16]和營養改良提供初步的理論支撐[17]。能闡明生物合成的自然多樣性，有助于對化合物進行注釋和分類，發現新的生物合成分支[18]。番茄含有豐富的抗氧化和酚類物質，比如VC、酚類化合物（蘆丁和綠原酸）和類胡蘿卜素等[19-20]。運用代謝組學闡明基因對番茄成熟過程中代謝體系的調控作用，對番茄營養、品質和風味改良具有重要意義[21-22]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生型和基因沉默番茄（Solanum lycopersicum）由中國農業大學食品生物技術實驗室提供，野生型品種為AC（Ailsa Craig）。

甲醇、乙醇（均為分析純） 北京化工廠；乙腈（色譜純） 美國Fisher Chemical公司；甲酸、氨水（色譜純） 美國ACS公司；所有分離用有機溶劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Triple TOFTM5600高效液相色譜-質譜（high performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometer，HPLC-HRMS）聯用儀（配有DBS和MMDF Trigger IDA數據采集系統及MarkerView、PeakView、MetabolitePilot數據分析軟件） 美國AB Sciex公司；超低溫冷凍儲存箱 青島海爾特種電器有限公司；Hamburg離心機 德國艾本德公司；電子天平德國Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

Waters An ACQUITY UPLC BEH Amide（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱；柱溫35 ℃；流動相：A為25 mmol/L醋酸銨+25 mmol/L氨水，B為異丙醇-乙腈（9∶1，V/V）+0.1%甲酸；進樣量4 μL；流速0.4 mL/min；洗脫梯度：0～0.5 min，95% B；0.5～9.5 min，95%～65% B；9.5～10.5 min，65%～40% B；10.5～12 min，40% B；12～12.2 min，40%～95% B；12.2～15 min，95% B。

1.3.2 質譜條件

采用HPLC-HRMS聯用儀檢測柱上洗脫的代謝產物。正負兩種模式，噴霧電壓為5 000 V和－4 500 V；氣簾氣壓力為30 psi，霧化氣壓力（Gas 1）為60 psi，輔助氣壓力（Gas 2）為60 psi；離子源溫度為650 ℃；質譜數據采集模式為IDA模式，TOF質量數范圍為60～1 200 Da。采集時間為150 ms/spectrum，采集速率為100 counts/s，總循環時間為0.56 s；40 GHz四極桿/質量分析器多通道TDC檢測，脈沖為11 kHz；動態排除設置為4 s；在采集過程中，每20 個樣品對質量精度進行校準。此外，為評價HPLC-HRMS在整個采集過程中的穩定性，在樣品前中后分別插入質量控制（quality control，QC）樣品以作實驗技術重復評估。

1.3.3 樣品制備

野生型（6 個平行樣品）和沉默組番茄（5 個平行樣品）都在破色期后3 d取樣。果實采摘后，取番茄果肉部位，液氮凍存后，－80 ℃保存待用。提取時取出樣品在冰上解凍，用120 μL預冷的50%甲醇溶液提取20 mg研磨成粉的番茄樣品，旋轉1 min，室溫放置10 min，提取液在－20 ℃過夜，4 000×g離心20 min后，上清液轉入96 孔板。樣品在－80 ℃保存，然后進行HPLC-HRMS分析。此外，取等量的11 份樣品提取液混合而成QC樣品，在樣品前中后分別插入以檢驗實驗的重復性。

1.4 數據處理

1.4.1 代謝產物鑒定

利用生物信息分析進行質譜數據解讀，主要利用XCMS軟件進行物質檢測，利用metaX軟件對檢測到的物質進行定量、差異物質篩選。利用代謝物一級m/z和二級碎片離子m/z與數據庫里標準品匹配進行代謝物鑒定。首先利用開源軟件metaX通過物質的一級m/z分別與PlantCyc、KEGG、HMDB數據庫里的代謝物進行匹配，得到一級鑒定結果；同時利用in-house圖譜庫對物質二級質譜圖進行代謝物鑒定。最后利用公共PlantCyc數據庫和KEGG數據庫對物質進行功能注釋。

1.4.2 代謝產物定量分析

代謝物的定量信息來自于物質一級色譜峰面積。本研究利用XCMS軟件對每個物質在每個樣品的強度信息提取，隨后對提取出的數據使用metaX軟件進行質控，首先去低質量峰（將QC樣本中缺失超過50%，或者實際樣本中缺失超過80%的離子去除），隨后利用KNN（K-Nearest Neighbors）方法進行缺失值填充，接著采用PQN（Probabilistic Quotient Normalization）和Q C-RSC（QC-robust spline batch correction）方法校正。對校正后的數據進行過濾，即將所有QC樣品中變異系數（coefficient of variation，CV）大于30%的離子過濾（CV大于30%的離子在實驗過程中波動較大，不進行差異定量分析）。

1.4.3 差異代謝產物的篩選

利用開源軟件metaX對代謝組學結果分析，進行單變量和多變量分析，從而獲得組間差異代謝物。其方法包括參數檢驗和非參數檢驗、差異表達倍數分析、主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘法判別分析等。同時滿足3 個條件即認定為差異化合物：1）物質倍數比值ratio≥2或者ratio≤1/2；2）wicoxon統計檢驗BH校正值q-value≤0.05；3）偏最小二乘法模型的變量投影重要度值VIP≥1。

1.4.4 代謝通路圖的繪制

找出差異代謝產物的KEGG號，進入KEGG首頁（https：//www.kegg.jp/），進入分析工具KEGG Mapper，進入代謝通路圖工具Search Pathway，將搜索選為番茄屬sly，將差異代謝化合物KEGG號輸入，數據庫就會出現與化合物相關的代謝通路圖，結合各條通圖路繪制出代謝網絡。

2 結果與分析

2.1 代謝產物的代謝組學分析結果

在所有檢測到的代謝產物中，既能與數據庫物質的一級m/z匹配到，也能與數據庫的碎片離子（二級）m/z匹配到的物質數目正模式有1 092 個，負模式有510 個。與正常番茄相比，SlNAC4基因沉默番茄中含量增加的差異化合物有640 種，含量減少的化合物有880 種。在這些差異物質中，只有67 種其一級和二級質譜均能夠在數據庫中找到匹配物質，從而得到鑒定，其余大部分尚無法得到最終鑒定，因此后面重點研究的差異代謝產物主要集中在這67 種得到鑒定的物質上。

2.2 SlNAC4沉默組番茄與普通番茄的差異代謝產物分析

基于HPLC-HRMS數據對沉默組番茄和對照組番茄進行PCA，發現兩組番茄呈現顯著差異[23-24]，見圖1。兩主成分分數體現了77.41%總變異，對照圖1中兩組番茄的相對位置發現，兩者在PC1軸上相距甚遠，且PC1對該差異的貢獻率為71.61%，說明兩種番茄的代謝化合物差異很大。

圖1 基于HPLC-HRMS一級峰面積數據破色期的代謝差異PCAFig. 1 PCA plot for metabolite differences of CRC4 compared to wild-type tomato at the breaking stage based on HPLC-HRMS peak area data

對最終鑒定得到的物質進行統計學分析后，兩組番茄中可以鑒定的具有顯著差異的化合物一共有67 種，分布情況如表1所示。

表1 1 SlNAC4lNAC4沉默組番茄與對照組番茄的差異代謝化合物分布Table 1 Differential metabolites in CRC4 compared to wild-type tomato

續表1

差異較大的氨基酸衍生物及二肽類19 種，其中脯氨酰-絡氨酸、異亮氨酰-天冬氨酸相對含量增加極顯著（q-value＜0.001），N-乙酰-L-苯丙氨酸、絡氨酰-亮氨酸、脯氨酰-蘇氨酸、N-乙酰-DL-亮氨酸、L-焦谷氨酸相對含量下降極顯著（q-value＜0.001）。氨基酸和多肽的變化是由于器官特異性活動，將葉子的氨基酸轉移到果實中[25]，相比于對照組，基因沉默組果實的氨基酸發生了變化，說明轉錄因子SlNAC4可能對控制從其他器官轉移氨基酸至果實的生物過程起著重要的調控作用。

差異較大的維生素類7 種，其中VB1、4-吡哆酸、D-泛酸鈣相對含量增加顯著（q-value＜0.01），VL1、VC相對含量降低顯著。

差異較大的糖類及其衍生物4 種，其中D-木酮糖增加極顯著。

差異較大的核酸及其衍生物11 種，其中6-芐氨基嘌呤、1-甲基鳥苷相對含量增加極顯著（q-value＜0.001），胞嘧啶、二磷酸腺苷、3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸酯下降極顯著（q-value＜0.001）。

差異較大的生物堿4 種，其中罌粟堿相對含量增加極顯著（q-value＜0.001），乙酰膽堿、苯甲酰芽子堿相對含量下降極顯著（q-value＜0.001）。

差異較大的香精香料4 種，其中羥基丙酮相對含量增加極顯著（q-value＜0.001），3-甲硫基丙醇相對含量增加顯著（q-value＜0.01），香豆素相對含量降低顯著（q-value＜0.01）。

圖2 2 SlNAC4lNAC4調控破色期番茄初級代謝通路圖Fig. 2 Modulation of primary metabolism by SlNAC4lNAC4 in breaking tomato fruit

差異較大的有機酸9 種，其中3-丁炔酸相對含量增加極顯著（q-value＜0.001），鄰羥基苯乙酸、丙炔酸相對含量增加顯著（q-value＜0.01），間羥基苯甲酸、水楊酸、甘油酸相對含量下降極顯著（q-value＜0.001），2-苯基丁酸相對含量降低顯著（q-value＜0.01）。果實由未成熟到成熟階段有機酸、糖類、氨基酸及多肽等代謝強盛，也是果實從澀到甜的生理過程，期間呈味物質發生變化，沉默組相對于對照組有機酸、糖類、氨基酸及多肽含量的變化差異很大，說明轉錄因子SlNAC4影響番茄的呈味[26-27]。

2.3 差異代謝產物在代謝通路中的分布分析

為闡明SlNAC4沉默番茄受到影響的代謝途徑，使用KEGG進行詳細的代謝途徑查找與分析[28]，在大量的番茄途徑中，25 條重要的代謝途經中只有31 種化合物被識別出來，基于此研究和總結，綜合作出總代謝通路見圖2。

代謝通路網絡圖的繪制，可以更清楚地找到各代謝化合物的合成及分解去向，為解析轉錄因子對番茄化合物的代謝影響提供一條便利途徑。從圖2可以看出，嘌呤代謝途徑中，腺苷5’-二磷酸核糖鈉、L-谷氨酰胺含量減少，甘氨酸含量顯著增加。甘氨酸在代謝途徑中向L-谷氨酰胺的方向分解，L-谷氨酰胺含量減少，有利于甘氨酸積累。甘氨酸一共有4 條分解代謝和3 條合成代謝，從總體來說SlNAC4基因的沉默有利于甘氨酸的積累。3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸含量減少極顯著，它可以從兩條途徑分解成5’-磷酸硫酸腺苷（含量減少顯著），接著沿著一條通路分解為二磷酸腺苷（含量減少極顯著）。苯基苯氨酸的代謝途徑中，N-乙酰-L-苯丙氨酸、反式肉桂酸含量降低，琥珀酸鹽則顯著升高。煙酸鹽和煙酰胺代謝途徑中，煙酰胺和琥珀酸鹽含量增大、煙酰胺腺嘌呤雙核苷酸和馬來酸含量則減少。硫磺代謝途徑中，牛磺酸、琥珀酸鹽含量升高、二磷酸腺苷和3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸含量降低。碳代謝途徑中，甘氨酸含量升高，一條去向L-谷氨酰胺，一條去向甘油酸，L-谷氨酰胺和甘油酸含量都降低，原因嘌呤代謝途徑已經解析過。戊糖和葡糖醛酸互換途徑中，阿東糖醇和D-木酮糖含量升高很大。VB1的代謝途徑中，甘氨酸和VB1含量均增加。VC代謝途徑中，葡醛內酯含量降低，VC含量也降低，葡醛內酯可以向VC轉化。苯丙醇的合成途徑中，香豆素和反式肉桂酸含量都降低。氨基酸的合成途徑中，L-谷氨酰胺和VL1含量都減少。這些代謝產物的互相影響關系，還需要后續結合番茄基因序列數據進行綜合分析[29-30]。

3 結論與討論

番茄是肉質果實相關研究的重要模式作物，在成熟過程中具有典型的生理變化過程。NAC是植物中獨有的轉錄調節因子，因其具有一個高度保守的N端NAC結構域而被賦予極高的研究價值，NAC4屬于NAC基因家族成員之一。至今轉錄因子NAC4對果實營養物質的影響鮮有報道，因此基于代謝組學研究轉錄因子SlNAC4對番茄代謝產物的影響具有巨大的意義。

番茄中很多營養物質含量發生明顯變化，比如氨基酸類甘氨酸含量顯著升高、L-谷氨酰胺含量顯著降低，多種二肽含量發生明顯變化；維生素類中VB1、D-泛酸鈣顯著增加，煙酰胺含量增加，VC、VL1含量顯著降低；糖類物質阿東糖醇和D-木酮糖含量都增大幅增加；核酸類物質含量基本上降低，但腺苷含量顯著增加；另外還有一些呈香呈味物質類，羥基丙酮等含量增加極顯著，反式肉桂酸、香豆素含量降低，馬來酸、甘油酸、水楊酸等有機酸含量發生大幅變化。以上結果均能說明轉錄因子SlNAC4確實影響了番茄的營養物質代謝水平。代謝通路圖的制作概括了其中31 種化合物的代謝關系，對下一步結合基因測序分析提供了重要線索，為解析轉錄因子對番茄的代謝影響提供一條便利的途徑。

綜上所述，轉錄因子SlNAC4對番茄的氨基酸、維生素、糖、有機酸、核酸及核苷酸類代謝有重要影響。其具體的影響機理還有待繼續深入研究。