代謝組學(xué)法研究轉(zhuǎn)錄因子SlNAC4對番茄果實(shí)代謝產(chǎn)物的影響

鄭海英，張冬青，趙曉丹*

（北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京 100048）

番茄作為消費(fèi)者喜愛且營養(yǎng)豐富的果蔬，是肉質(zhì)果實(shí)研究的模式材料。轉(zhuǎn)錄因子NAC（NAM、ATAF1/2、CUC2）的變化影響番茄果實(shí)色素和硬度等品質(zhì)指標(biāo)[1]。運(yùn)用代謝組學(xué)研究轉(zhuǎn)錄因子NAC對番茄代謝產(chǎn)物的影響，可以豐富番茄相關(guān)研究的理論內(nèi)容，也對改善番茄品質(zhì)具有重要意義。

在植物中，轉(zhuǎn)錄因子NAC顯著特點(diǎn)是有一個(gè)高度保守的N端NAC結(jié)構(gòu)域，有5 個(gè)保守的子域（A～E），還有一個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)C端能啟動和抑制多種靶基因的轉(zhuǎn)錄[2-3]。研究結(jié)果顯示番茄中一共有104 個(gè)NAC基因[4]，分布在12 條染色體上，其中NAC4位于第I條染色體上，編碼蛋白長413 aa，分子質(zhì)量46.93 kDa[5]。Riahi等[6]測序50 份野生葡萄和73 個(gè)葡萄品種發(fā)現(xiàn)NAC4轉(zhuǎn)錄基因編碼區(qū)纈氨酸變成異亮氨酸，功能性候選基因在物種進(jìn)化過程中為適應(yīng)環(huán)境而發(fā)生基因變異，說明轉(zhuǎn)錄因子在植物發(fā)育和脅迫調(diào)控等生命活動中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。據(jù)研究，硬皮豆在不同鹽度、寒冷、干旱和脫水脅迫條件下，NAC4基因表達(dá)均有一定的調(diào)節(jié)，尤其是鹽脅迫導(dǎo)致NAC4轉(zhuǎn)錄水平增加了6 倍，NAC4基因通過載體克隆表達(dá)，在大腸桿菌的細(xì)胞轉(zhuǎn)化后，NAC4蛋白增強(qiáng)了大腸桿菌細(xì)胞耐鹽脅迫能力，表明NAC4基因可適合作為提高植物對鹽脅迫和其他非生物脅迫耐受性的遺傳候選基因[7]。落花生中Mu轉(zhuǎn)錄因子NAC4能調(diào)控植株抗旱功能，MuNAC4基因的過表達(dá)，在干旱環(huán)境下能減少對細(xì)胞膜的損害、增強(qiáng)膜的滲透性和抗氧化酶的活性[8]。植株抗脅迫能力的強(qiáng)弱勢必會影響果實(shí)成熟過程中的代謝水平，轉(zhuǎn)錄因子NAC4是影響果實(shí)成熟的重要因素。沉默NAC4基因，果實(shí)軟化相關(guān)基因EXP/LOX/PG/PL的表達(dá)下調(diào)，顯著抑制果實(shí)軟化酶活性，延緩果實(shí)軟化進(jìn)程，導(dǎo)致果實(shí)呼吸速率降低，乙烯含量下降，延緩葉綠素降解和類胡蘿卜素積累的速度，果實(shí)無法正常變紅[9]。Shan Wei等[10]研究轉(zhuǎn)錄因子NAC在香蕉成熟過程中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)果皮和果肉中NAC4轉(zhuǎn)錄水平降低，表明NAC4可能通過與乙烯信號物質(zhì)的相互作用參與香蕉果實(shí)的成熟。有研究顯示NAC4調(diào)控植物對氮的運(yùn)輸功能，氮是蛋白質(zhì)、葉綠素、核酸、酶、生物激素等重要成分，轉(zhuǎn)錄因子NAC4主要是通過作用中柱鞘細(xì)胞中AFB3基因，影響應(yīng)答硝酸鹽的側(cè)根基因密度[11]，并增強(qiáng)植物的耐鹽能力[12]。植株生理上的變化勢必影響果實(shí)的成熟基質(zhì)，相關(guān)研究也表明轉(zhuǎn)錄因子NAC4確實(shí)在植株生長和果實(shí)成熟過程中具有影響基體代謝水平的重要作用。

本實(shí)驗(yàn)以正常番茄和SlNAC4沉默的番茄為研究對象，采用代謝組學(xué)法全面分析兩組番茄在破色期的代謝產(chǎn)物分布情況。代謝組學(xué)法是對植物中的化合物分布進(jìn)行全面探索的一種有效方法，能夠找出差異代謝產(chǎn)物[13]，進(jìn)而挖掘可能發(fā)生變化的代謝通路[14]，掌握植物生長發(fā)育中的多種生理信息[15]，對果實(shí)的品質(zhì)[16]和營養(yǎng)改良提供初步的理論支撐[17]。能闡明生物合成的自然多樣性，有助于對化合物進(jìn)行注釋和分類，發(fā)現(xiàn)新的生物合成分支[18]。番茄含有豐富的抗氧化和酚類物質(zhì)，比如VC、酚類化合物（蘆丁和綠原酸）和類胡蘿卜素等[19-20]。運(yùn)用代謝組學(xué)闡明基因?qū)Ψ殉墒爝^程中代謝體系的調(diào)控作用，對番茄營養(yǎng)、品質(zhì)和風(fēng)味改良具有重要意義[21-22]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生型和基因沉默番茄（Solanum lycopersicum）由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室提供，野生型品種為AC（Ailsa Craig）。

甲醇、乙醇（均為分析純） 北京化工廠；乙腈（色譜純） 美國Fisher Chemical公司；甲酸、氨水（色譜純） 美國ACS公司；所有分離用有機(jī)溶劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Triple TOFTM5600高效液相色譜-質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometer，HPLC-HRMS）聯(lián)用儀（配有DBS和MMDF Trigger IDA數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)及MarkerView、PeakView、MetabolitePilot數(shù)據(jù)分析軟件） 美國AB Sciex公司；超低溫冷凍儲存箱 青島海爾特種電器有限公司；Hamburg離心機(jī) 德國艾本德公司；電子天平德國Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

Waters An ACQUITY UPLC BEH Amide（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱；柱溫35 ℃；流動相：A為25 mmol/L醋酸銨+25 mmol/L氨水，B為異丙醇-乙腈（9∶1，V/V）+0.1%甲酸；進(jìn)樣量4 μL；流速0.4 mL/min；洗脫梯度：0～0.5 min，95% B；0.5～9.5 min，95%～65% B；9.5～10.5 min，65%～40% B；10.5～12 min，40% B；12～12.2 min，40%～95% B；12.2～15 min，95% B。

1.3.2 質(zhì)譜條件

采用HPLC-HRMS聯(lián)用儀檢測柱上洗脫的代謝產(chǎn)物。正負(fù)兩種模式，噴霧電壓為5 000 V和－4 500 V；氣簾氣壓力為30 psi，霧化氣壓力（Gas 1）為60 psi，輔助氣壓力（Gas 2）為60 psi；離子源溫度為650 ℃；質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集模式為IDA模式，TOF質(zhì)量數(shù)范圍為60～1 200 Da。采集時(shí)間為150 ms/spectrum，采集速率為100 counts/s，總循環(huán)時(shí)間為0.56 s；40 GHz四極桿/質(zhì)量分析器多通道TDC檢測，脈沖為11 kHz；動態(tài)排除設(shè)置為4 s；在采集過程中，每20 個(gè)樣品對質(zhì)量精度進(jìn)行校準(zhǔn)。此外，為評價(jià)HPLC-HRMS在整個(gè)采集過程中的穩(wěn)定性，在樣品前中后分別插入質(zhì)量控制（quality control，QC）樣品以作實(shí)驗(yàn)技術(shù)重復(fù)評估。

1.3.3 樣品制備

野生型（6 個(gè)平行樣品）和沉默組番茄（5 個(gè)平行樣品）都在破色期后3 d取樣。果實(shí)采摘后，取番茄果肉部位，液氮凍存后，－80 ℃保存待用。提取時(shí)取出樣品在冰上解凍，用120 μL預(yù)冷的50%甲醇溶液提取20 mg研磨成粉的番茄樣品，旋轉(zhuǎn)1 min，室溫放置10 min，提取液在－20 ℃過夜，4 000×g離心20 min后，上清液轉(zhuǎn)入96 孔板。樣品在－80 ℃保存，然后進(jìn)行HPLC-HRMS分析。此外，取等量的11 份樣品提取液混合而成QC樣品，在樣品前中后分別插入以檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

1.4.1 代謝產(chǎn)物鑒定

利用生物信息分析進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)解讀，主要利用XCMS軟件進(jìn)行物質(zhì)檢測，利用metaX軟件對檢測到的物質(zhì)進(jìn)行定量、差異物質(zhì)篩選。利用代謝物一級m/z和二級碎片離子m/z與數(shù)據(jù)庫里標(biāo)準(zhǔn)品匹配進(jìn)行代謝物鑒定。首先利用開源軟件metaX通過物質(zhì)的一級m/z分別與PlantCyc、KEGG、HMDB數(shù)據(jù)庫里的代謝物進(jìn)行匹配，得到一級鑒定結(jié)果；同時(shí)利用in-house圖譜庫對物質(zhì)二級質(zhì)譜圖進(jìn)行代謝物鑒定。最后利用公共PlantCyc數(shù)據(jù)庫和KEGG數(shù)據(jù)庫對物質(zhì)進(jìn)行功能注釋。

1.4.2 代謝產(chǎn)物定量分析

代謝物的定量信息來自于物質(zhì)一級色譜峰面積。本研究利用XCMS軟件對每個(gè)物質(zhì)在每個(gè)樣品的強(qiáng)度信息提取，隨后對提取出的數(shù)據(jù)使用metaX軟件進(jìn)行質(zhì)控，首先去低質(zhì)量峰（將QC樣本中缺失超過50%，或者實(shí)際樣本中缺失超過80%的離子去除），隨后利用KNN（K-Nearest Neighbors）方法進(jìn)行缺失值填充，接著采用PQN（Probabilistic Quotient Normalization）和Q C-RSC（QC-robust spline batch correction）方法校正。對校正后的數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，即將所有QC樣品中變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）大于30%的離子過濾（CV大于30%的離子在實(shí)驗(yàn)過程中波動較大，不進(jìn)行差異定量分析）。

1.4.3 差異代謝產(chǎn)物的篩選

利用開源軟件metaX對代謝組學(xué)結(jié)果分析，進(jìn)行單變量和多變量分析，從而獲得組間差異代謝物。其方法包括參數(shù)檢驗(yàn)和非參數(shù)檢驗(yàn)、差異表達(dá)倍數(shù)分析、主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘法判別分析等。同時(shí)滿足3 個(gè)條件即認(rèn)定為差異化合物：1）物質(zhì)倍數(shù)比值ratio≥2或者ratio≤1/2；2）wicoxon統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)BH校正值q-value≤0.05；3）偏最小二乘法模型的變量投影重要度值VIP≥1。

1.4.4 代謝通路圖的繪制

找出差異代謝產(chǎn)物的KEGG號，進(jìn)入KEGG首頁（https：//www.kegg.jp/），進(jìn)入分析工具KEGG Mapper，進(jìn)入代謝通路圖工具Search Pathway，將搜索選為番茄屬sly，將差異代謝化合物KEGG號輸入，數(shù)據(jù)庫就會出現(xiàn)與化合物相關(guān)的代謝通路圖，結(jié)合各條通圖路繪制出代謝網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果與分析

2.1 代謝產(chǎn)物的代謝組學(xué)分析結(jié)果

在所有檢測到的代謝產(chǎn)物中，既能與數(shù)據(jù)庫物質(zhì)的一級m/z匹配到，也能與數(shù)據(jù)庫的碎片離子（二級）m/z匹配到的物質(zhì)數(shù)目正模式有1 092 個(gè)，負(fù)模式有510 個(gè)。與正常番茄相比，SlNAC4基因沉默番茄中含量增加的差異化合物有640 種，含量減少的化合物有880 種。在這些差異物質(zhì)中，只有67 種其一級和二級質(zhì)譜均能夠在數(shù)據(jù)庫中找到匹配物質(zhì)，從而得到鑒定，其余大部分尚無法得到最終鑒定，因此后面重點(diǎn)研究的差異代謝產(chǎn)物主要集中在這67 種得到鑒定的物質(zhì)上。

2.2 SlNAC4沉默組番茄與普通番茄的差異代謝產(chǎn)物分析

基于HPLC-HRMS數(shù)據(jù)對沉默組番茄和對照組番茄進(jìn)行PCA，發(fā)現(xiàn)兩組番茄呈現(xiàn)顯著差異[23-24]，見圖1。兩主成分分?jǐn)?shù)體現(xiàn)了77.41%總變異，對照圖1中兩組番茄的相對位置發(fā)現(xiàn)，兩者在PC1軸上相距甚遠(yuǎn)，且PC1對該差異的貢獻(xiàn)率為71.61%，說明兩種番茄的代謝化合物差異很大。

圖1 基于HPLC-HRMS一級峰面積數(shù)據(jù)破色期的代謝差異PCAFig. 1 PCA plot for metabolite differences of CRC4 compared to wild-type tomato at the breaking stage based on HPLC-HRMS peak area data

對最終鑒定得到的物質(zhì)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后，兩組番茄中可以鑒定的具有顯著差異的化合物一共有67 種，分布情況如表1所示。

表1 1 SlNAC4lNAC4沉默組番茄與對照組番茄的差異代謝化合物分布Table 1 Differential metabolites in CRC4 compared to wild-type tomato

續(xù)表1

差異較大的氨基酸衍生物及二肽類19 種，其中脯氨酰-絡(luò)氨酸、異亮氨酰-天冬氨酸相對含量增加極顯著（q-value＜0.001），N-乙酰-L-苯丙氨酸、絡(luò)氨酰-亮氨酸、脯氨酰-蘇氨酸、N-乙酰-DL-亮氨酸、L-焦谷氨酸相對含量下降極顯著（q-value＜0.001）。氨基酸和多肽的變化是由于器官特異性活動，將葉子的氨基酸轉(zhuǎn)移到果實(shí)中[25]，相比于對照組，基因沉默組果實(shí)的氨基酸發(fā)生了變化，說明轉(zhuǎn)錄因子SlNAC4可能對控制從其他器官轉(zhuǎn)移氨基酸至果實(shí)的生物過程起著重要的調(diào)控作用。

差異較大的維生素類7 種，其中VB1、4-吡哆酸、D-泛酸鈣相對含量增加顯著（q-value＜0.01），VL1、VC相對含量降低顯著。

差異較大的糖類及其衍生物4 種，其中D-木酮糖增加極顯著。

差異較大的核酸及其衍生物11 種，其中6-芐氨基嘌呤、1-甲基鳥苷相對含量增加極顯著（q-value＜0.001），胞嘧啶、二磷酸腺苷、3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸酯下降極顯著（q-value＜0.001）。

差異較大的生物堿4 種，其中罌粟堿相對含量增加極顯著（q-value＜0.001），乙酰膽堿、苯甲酰芽子堿相對含量下降極顯著（q-value＜0.001）。

差異較大的香精香料4 種，其中羥基丙酮相對含量增加極顯著（q-value＜0.001），3-甲硫基丙醇相對含量增加顯著（q-value＜0.01），香豆素相對含量降低顯著（q-value＜0.01）。

圖2 2 SlNAC4lNAC4調(diào)控破色期番茄初級代謝通路圖Fig. 2 Modulation of primary metabolism by SlNAC4lNAC4 in breaking tomato fruit

差異較大的有機(jī)酸9 種，其中3-丁炔酸相對含量增加極顯著（q-value＜0.001），鄰羥基苯乙酸、丙炔酸相對含量增加顯著（q-value＜0.01），間羥基苯甲酸、水楊酸、甘油酸相對含量下降極顯著（q-value＜0.001），2-苯基丁酸相對含量降低顯著（q-value＜0.01）。果實(shí)由未成熟到成熟階段有機(jī)酸、糖類、氨基酸及多肽等代謝強(qiáng)盛，也是果實(shí)從澀到甜的生理過程，期間呈味物質(zhì)發(fā)生變化，沉默組相對于對照組有機(jī)酸、糖類、氨基酸及多肽含量的變化差異很大，說明轉(zhuǎn)錄因子SlNAC4影響番茄的呈味[26-27]。

2.3 差異代謝產(chǎn)物在代謝通路中的分布分析

為闡明SlNAC4沉默番茄受到影響的代謝途徑，使用KEGG進(jìn)行詳細(xì)的代謝途徑查找與分析[28]，在大量的番茄途徑中，25 條重要的代謝途經(jīng)中只有31 種化合物被識別出來，基于此研究和總結(jié)，綜合作出總代謝通路見圖2。

代謝通路網(wǎng)絡(luò)圖的繪制，可以更清楚地找到各代謝化合物的合成及分解去向，為解析轉(zhuǎn)錄因子對番茄化合物的代謝影響提供一條便利途徑。從圖2可以看出，嘌呤代謝途徑中，腺苷5’-二磷酸核糖鈉、L-谷氨酰胺含量減少，甘氨酸含量顯著增加。甘氨酸在代謝途徑中向L-谷氨酰胺的方向分解，L-谷氨酰胺含量減少，有利于甘氨酸積累。甘氨酸一共有4 條分解代謝和3 條合成代謝，從總體來說SlNAC4基因的沉默有利于甘氨酸的積累。3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸含量減少極顯著，它可以從兩條途徑分解成5’-磷酸硫酸腺苷（含量減少顯著），接著沿著一條通路分解為二磷酸腺苷（含量減少極顯著）。苯基苯氨酸的代謝途徑中，N-乙酰-L-苯丙氨酸、反式肉桂酸含量降低，琥珀酸鹽則顯著升高。煙酸鹽和煙酰胺代謝途徑中，煙酰胺和琥珀酸鹽含量增大、煙酰胺腺嘌呤雙核苷酸和馬來酸含量則減少。硫磺代謝途徑中，牛磺酸、琥珀酸鹽含量升高、二磷酸腺苷和3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸含量降低。碳代謝途徑中，甘氨酸含量升高，一條去向L-谷氨酰胺，一條去向甘油酸，L-谷氨酰胺和甘油酸含量都降低，原因嘌呤代謝途徑已經(jīng)解析過。戊糖和葡糖醛酸互換途徑中，阿東糖醇和D-木酮糖含量升高很大。VB1的代謝途徑中，甘氨酸和VB1含量均增加。VC代謝途徑中，葡醛內(nèi)酯含量降低，VC含量也降低，葡醛內(nèi)酯可以向VC轉(zhuǎn)化。苯丙醇的合成途徑中，香豆素和反式肉桂酸含量都降低。氨基酸的合成途徑中，L-谷氨酰胺和VL1含量都減少。這些代謝產(chǎn)物的互相影響關(guān)系，還需要后續(xù)結(jié)合番茄基因序列數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析[29-30]。

3 結(jié)論與討論

番茄是肉質(zhì)果實(shí)相關(guān)研究的重要模式作物，在成熟過程中具有典型的生理變化過程。NAC是植物中獨(dú)有的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，因其具有一個(gè)高度保守的N端NAC結(jié)構(gòu)域而被賦予極高的研究價(jià)值，NAC4屬于NAC基因家族成員之一。至今轉(zhuǎn)錄因子NAC4對果實(shí)營養(yǎng)物質(zhì)的影響鮮有報(bào)道，因此基于代謝組學(xué)研究轉(zhuǎn)錄因子SlNAC4對番茄代謝產(chǎn)物的影響具有巨大的意義。

番茄中很多營養(yǎng)物質(zhì)含量發(fā)生明顯變化，比如氨基酸類甘氨酸含量顯著升高、L-谷氨酰胺含量顯著降低，多種二肽含量發(fā)生明顯變化；維生素類中VB1、D-泛酸鈣顯著增加，煙酰胺含量增加，VC、VL1含量顯著降低；糖類物質(zhì)阿東糖醇和D-木酮糖含量都增大幅增加；核酸類物質(zhì)含量基本上降低，但腺苷含量顯著增加；另外還有一些呈香呈味物質(zhì)類，羥基丙酮等含量增加極顯著，反式肉桂酸、香豆素含量降低，馬來酸、甘油酸、水楊酸等有機(jī)酸含量發(fā)生大幅變化。以上結(jié)果均能說明轉(zhuǎn)錄因子SlNAC4確實(shí)影響了番茄的營養(yǎng)物質(zhì)代謝水平。代謝通路圖的制作概括了其中31 種化合物的代謝關(guān)系，對下一步結(jié)合基因測序分析提供了重要線索，為解析轉(zhuǎn)錄因子對番茄的代謝影響提供一條便利的途徑。

綜上所述，轉(zhuǎn)錄因子SlNAC4對番茄的氨基酸、維生素、糖、有機(jī)酸、核酸及核苷酸類代謝有重要影響。其具體的影響機(jī)理還有待繼續(xù)深入研究。