東北酸菜中乳酸菌的分離鑒定與耐酸性菌株的篩選

王 惋，盧佳音，焦月華，王毅超，姜瞻梅，田 波，王玉堂，侯俊財,*

（1.東北農業大學 乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030；2.東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；3.黑龍江中醫藥大學藥物安全性評價中心，黑龍江 哈爾濱 150040）

自然發酵酸菜的制作是利用微生物附著在蔬菜表面，從而進行自然發酵。蔬菜發酵的過程、酸菜制品的風味及品質直接受微生物活性的影響[1]。方心芳[2]指出雖然蔬菜的發酵由多種微生物參與，但是主要產酸的是乳酸菌。Fan Sicun等[3]研究了泡菜腌制中菌系的生長規律。乳酸菌的數量在新鮮蔬菜上比較少，但當條件適宜時，乳酸菌則會處于優勢[4-5]。因為生成的乳酸不僅能使發酵環境的酸性變強從而抑制雜菌，而且對產品品質、風味具有重要的影響[6]。乳酸菌具有促進營養成分的分解、調節腸道菌群、抗菌、降低血清膽固醇、增強免疫力的益生作用[7-9]，在食品、醫藥和飼料等領域，乳酸菌也得到廣泛應用。在食品工業中，乳酸菌具有抑制有害菌的生長、增強抗氧化劑的效果[10]；在醫藥行業中，乳酸菌可以調節腸道內的免疫反應，通過行使免疫功能抑制腸道發生炎癥[11]；在飼料方面，含有乳酸菌的益生性飼料可以提高動物產量[12]。但是，外源乳酸菌要想在腸道中定植發揮作用，必須要能夠耐受胃中的酸性環境[13]，因此，篩選具耐酸的乳酸菌具很大的研究和應用價值。與傳統的生理生化鑒定方法相比，16S rDNA序列同源性分析技術作為一種分子水平鑒定技術，由于其簡單易行、準確高效，近幾年被廣泛應用于乳酸菌種屬鑒定[14]。

結合上述內容可以看出，在全面發展的背景下，鄉村規劃建設要充分滿足當前農民發展的基本需求，同時還要保護好鄉村地區固有的生態環境，提高鄉村規劃的科學性與合理性，并且還需在發展中充分結合鄉村實際，有針對性地開展鄉村規劃工作，進而不斷完善鄉村規劃的整體水平。

本研究擬從質量優良的酸菜汁樣品中分離出乳酸菌菌株，利用形態學分析和隨機擴增多態性DNA標記（random amplifiled polymorphism DNA，RAPD）分析技術，初步鑒定所分離的菌株類型，隨后利用16S rDNA序列同源性分析，以確定分離菌株的分類學地位，并篩選耐酸性菌株，最后對未確定分類學地位的高耐酸性菌株的管家基因rpoA的同源性進行分析，為其進一步深入開發應用研究提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

自然發酵酸菜汁樣品采集自黑龍江省齊齊哈爾市周邊地區的10 家農戶。向MRS固體培養基[15]中加入2% CaCO3制成選擇培養基，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

TGL-16B型高速離心機 上海市離心機械研究所有限公司；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋上海申安醫療器械廠；L2型紫外-可見分光光度計上海菁華科技儀器有限公司；MiniCyclerTM型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀 美國MJ Reserarch公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

將農戶自然發酵的酸菜在其發酵容器中充分攪樣混勻后，用滅菌移液器吸取酸菜汁轉移至滅菌采樣瓶中，隨后將采樣瓶置于冰盒內，快速轉放到實驗室冰箱內低溫凍藏。10 份樣品均用傳統方法自然發酵、風味良好、處于發酵后期的酸菜汁。

1.3.2 乳酸菌的分離純化

根據張魯冀等[16]的方法取適量樣品，將樣品用質量分數為0.9%的生理鹽水，按照10 倍逐漸遞增的方法進行稀釋。依次選擇稀釋度為10－4～10－7的3 個樣品各200 μL，涂布于選擇培養基，每個稀釋度做3 個平行實驗，37 ℃的環境下，經36～48 h培養后觀察。將產生溶鈣圈的菌落單獨選取出來進行鏡檢，細菌細胞形態以及排列方式基本相同的菌落確定為純菌株。若菌落不純，則將菌落重新劃線、接種、培養，到菌落分純為止。然后將進行過氧化氫酶實驗的純菌株的形態記錄并編號，隨后進行革蘭氏染色和鏡檢，采用體積分數20%的甘油進行保護，于－20 ℃進行保藏[17]。

基于RAPD的結果，采用PCR擴增同一樣本中基因型不同菌株的16S rRNA基因序列，擴增體系和反應條件參照李欣等[20]的方法。PCR擴增產物在1.0%的瓊脂糖凝膠上進行電泳后在紫外燈下觀察擴增條帶。隨后將PCR擴增產物送至華大公司進行測序。在NCBI網站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中，通過BLAST，將分離菌株的16S rDNA序列與GenBank進行同源性比較，將與目的基因序列同源性最高的序列篩選出來，采用MEGA 6.0軟件構建系統發育樹，完成菌種鑒定。

RAPD技術是利用隨機引物通過PCR，非定點擴增DNA片段，然后通過觀察擴增片段的多態性來對分離菌株進行基因分型[18]。提取分離菌株的基因組DNA，按照Antara等[19]的方法對72 株分離菌株進行基因分型，RAPD的引物和擴增條件如下，擴增體系見表1。

引物4：5’-GAGGGTGGCGGTTCT-3’。PCR擴增條件：第1步：94 ℃預變性5 min；第2步：94 ℃變性1 min，45 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，進行40 個循環；第3步：72 ℃、5 min的PCR擴增條件。

2.1.1 樣品中乳酸菌的分離

引物1：5’-GAGCGGCCAAAGGGAGCAGAC-3’；引物2：5’-NNNAACAGCTATGACCATG-3’。PCR擴增條件：第1步：94 ℃變性5 min，42 ℃退火5 min，72 ℃延伸5 min，進行4 個循環；第2步：94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，進行30 個循環；第3步：72 ℃、5 min。

大理市是大理白族自治州州府所在地，位于滇西中部，地處東經99°58′～100°27′，北緯25°25′～25°58′，東連賓川和祥云2縣，南鄰彌渡和巍山兩縣，西接漾濞縣，北臨洱源縣，距省會昆明市約338 km。大理市境東西橫距46.3 km，南北縱距59.3 km，國土面積1 815.00 km2，總體位于洱海流域范圍以內。現轄下關鎮、大理鎮、鳳儀鎮、喜洲鎮、挖色鎮、海東鎮、銀橋鎮、灣橋鎮、雙廊鎮、上關鎮和太邑鄉10鎮1鄉，以及大理省級旅游度假區和大理國家級經濟開發區(圖1)。

表1 PCR擴增體系Table 1 PCR amplification system

在配制的1%的瓊脂糖凝膠中，分別加入4 種引物的PCR擴增產物，電壓100 V，電泳1 h，在紫外燈下進行觀察分析，并記錄結果。然后將DNA指紋圖譜的變化情況進行比對分析。

社區獲得性肺炎是呼吸系統常見的一種疾病，主要是由病原菌感染引起，常見的病原菌主要有結核桿菌、肺炎鏈球菌、肺炎支原體、金黃色葡萄球菌等［6］。研究發現，社區獲得性肺炎發病機制主要是因為:病原體大量聚集，造成了局部的感染，病原體也可以為呼吸道的正常菌毒性加強轉變而來，其聚集的途徑主要是通過空氣、血液以及呼吸道相關菌的誤吸等，患者呼吸道和自身免疫系統功能降低，對病原菌和病毒的抵抗能力減退而發病［7－8］。劉婧［9］指出社區獲得性肺炎患者發病后，抗凝血酶-Ⅲ和纖維蛋白原出現了紊亂，說明社區獲得性肺炎患者病情發展可能和凝血功能指標有關。。

1.3.4 菌株的16S rRNA基因同源性分析和系統發育樹構建

1.3.3 RAPD分析

1.3.5 酸耐受性菌株的篩選

將PCR產物送交生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。序列與GenBank中已知菌株的rpoA基因序列進行同源性分析，隨后用MEGA 6.0軟件構建系統發育樹。

(1) 由于電機有較大幅度增容要求，冷卻器結構體積需有較大增加，已不適應原有的坑道面積，所以適合改為背包式安裝型式；

參照劉宏宇等[21]的方法，將供試菌株傳代2 次，將其接種至MRS培養基中，接種量為2%，37 ℃條件下培養14～16 h，離心去上清液，加入pH值為3.0的生理鹽水制成適宜濃度的菌懸液。迅速挑取少量的菌懸液，進行稀釋，選取兩個最合適的稀釋度，分別在MRS瓊脂平板上涂布，在37 ℃條件下培養48 h，進行活菌計數，此時得到的活菌數就是0 h的起始數據。將剩余菌懸液放置于37 ℃恒溫培養箱孵育2 h，用相同的方法進行菌落計數，計算存活率。

綜上所述，MCN-IC總體發病率較低，年齡≥60歲、腹痛、CA19-9≥37 U/ml、病灶邊界不清、壁結節和無分隔預示MCN-IC的可能，宜盡快手術治療。如無以上危險因素，則MCN-nIC的可能性更大，進行隨訪或非手術治療是可行的。

模板為各菌株的基因組DNA，將其管家基因RNA聚合酶α-亞基基因進行擴增，引物序列和退火溫度見表2。

表2 管家基因的引物序列及PCR的退火溫度Table 2 Primer sequences for house-keeping genes and PCR annealing temperatures

1 μL模板DNA，1 μL引物，25 μL 2×TaqMaster Mix，22 μL無菌蒸餾水的50 μL PCR體系。第1步：95 ℃預熱5 min；第2步：95 ℃變性1 min，55 ℃退火75 s，72 ℃延伸65 s，進行3 個循環；第3步：95 ℃變性35 s。退火75 s，72 ℃延伸65 s，進行30 個循環；第4步：72 ℃延伸7 min[22-23]。

待汪隊長的怒氣發泄完了，他才使出三寸不爛之舌，從以人為本的高度講到人的本能，講到戰場紀律的嚴肅性和靈活性，從戰前的渴求講到犧牲后的不留遺憾，一直講得汪隊長無話可說。

1.4 統計分析

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的分離與菌株形態

引物3：5’-CCGCAGCCAA-3’。PCR擴增條件：第1步：94 ℃變性5 min，36 ℃退火5 min，72 ℃延伸5 min，進行4 個循環；第2步：94 ℃變性1 min，36 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，進行30 個循環；第3步：72 ℃、5 min。

將采集的10 份樣品分別稀釋涂布，再經反復劃線純化，分離出在含2% CaCO3的MRS培養基上有溶鈣圈的菌株，其中有72 株革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性菌，初步確定其為乳酸菌。

澆水時掌握五澆五不澆，即晴天澆水，陰天不澆水；上午澆水，下午不澆水；澆溫水，不澆冷水；膜下澆暗水，不澆明水；要澆輕水，不澆大水，并注意澆水后放風排濕。

2.1.2 乳酸菌菌株的形態學特性

1.3.6 篩選菌株管家基因rpoA的序列同源性分析和系統發育樹構建

從10 份農家酸菜汁樣品中分離得到72 株乳酸菌。瓊脂培養基上的菌落形態、革蘭氏染色后顯微鏡下的菌體形態描述詳見表3。

表3 乳酸菌分離株菌落形態及顯微鏡下的菌體形態Table 3 Colonial morphology and microscopic morphology of LAB isolates

由表3可知，在10 份農家酸菜汁樣品中分離得到乳酸菌菌株中，62 株分離菌株為乳酸菌桿菌，占所分離菌株的86%以上，為優勢菌，叢敏等[24]也發現，在發酵第40天的東北傳統發酵酸菜中含有豐富的乳酸菌，主要優勢菌群為乳桿菌屬的菌株。這是由于所采集樣品為發酵后期的酸菜汁，pH值幾乎已經達到發酵最低點，一般來說，乳桿菌的酸耐受性要好于乳酸球菌，所以，在發酵后期的酸菜汁中乳桿菌為優勢菌群。其余10 株分離到的乳酸菌菌株可能為腸球菌，因為總的來說，在乳酸菌中腸球菌屬菌株的酸耐受性也很強，仍需要進一步的鑒定，武俊瑞[25]也在采用傳統方法自然發酵成熟的酸菜發酵液中分離到少量腸球菌，約占所分離菌株的12%。

在偵查決策過程中，為了實現偵查目的，人們往往追求最優決策，進而根據最優決策來實施偵查行為。所謂最優決策，是指從全部可行方案中選出的能實現目標的最優方案。但是偵查所面對的是復雜多變的刑事案件，且在偵查過程中存在著偵查人員與犯罪分子之間的活力對抗，因而偵查最優決策往往很難實現，因而偵查決策大多數屬于一種滿意原則下的決策。

2.2 乳酸菌的初步鑒定

2.2.1 RAPD分析

根據菌株的菌落表型及細胞形態，選取34 株菌落表型及細胞形態差異較大的菌株進行RAPD分析。4 種引物的擴增產物電泳后，在紫外燈下觀察，供試菌株的DNA指紋圖譜如圖1所示。

圖1 不同乳酸菌的RAPD-PCR指紋圖譜Fig. 1 RAPD-PCR fingerprinting patterns for LAB strains

由圖1A引物1擴增得到的指紋圖譜可見，菌株26#和36#為同型，菌株49#和59#為同型，菌株66#和54#為同型。由圖1B引物2擴增得到的指紋圖譜可見，菌株11#和17#為同型，菌株34#、26#、55#、68#和36#為同型，菌株52#、59#、66#、49#和54#為同型，菌株35#、22#和30#為同型。由圖1C引物3擴增得到的指紋圖譜可見，菌株11#和17#為同型，菌株49#、52#和59#為同型，菌株66#和54#為同型，菌株22#和47#為同型。由圖1D引物4擴增得到的指紋圖譜可見，菌株11#和17#為同型，菌株43#和67#為同型，菌株26#和36#為同型。

行政事業單位的內部控制體制應該以《行政事業單位內部控制規范 (試行)》為核心依據，結合各單位的實際發展和員工構成情況，從每個細節入手，全面落實內部控制的各項內容。首先，單位應該建立內部控制標準，通過這個標準的約束力實施檢測員工的工作情況和部門的運行情況，在整個行政事業單位實行體制化的管理模式。科學的內部控制管理體系應該遵循我國當前經濟發展的狀況，把握國家政策方針，以培養員工積極性和內控意識為出發點，按照當今環境的需求進行改革工作。

綜上所述，通過4 種引物的擴增產物的電泳圖分析比較并結合菌株分離時的生長活力，挑選出21 株指紋圖譜不相同的菌株進行16s rRNA鑒定，21 株乳酸菌分別為：菌株8#、11#、16#、19#、20#、22#、32#、34#、41#、43#、44#、46#、48#、53#、56#、59#、60#、62#、63#、71#、72#。

截至17日上午，青海省水利廳派出的2批13支供水工程應急搶險救災小分隊共220余人，全部到達抗震救災第一線，并有針對性地開展工作，累計提供的救災物資折合人民幣達到500萬元。4月17日，青海省水利廳訂購的生命吸管有400套運往災區。

2.2.2 分離菌株的16S rRNA基因同源性分析及系統發育樹構建

21 株疑似乳酸菌基因組PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳結果見圖2。可以看出，21 條目的片段都在1 500 bp左右，且條帶清晰。

將擴增產物測定所得序列通過BLAST與GenBank數據庫中已知菌株序列進行比對，用MEGA 6.0軟件進行序列分析，構建系統發育樹（圖3）。

懷孕后準媽媽要做很多種檢查，這些檢查分為常規檢查和特殊檢查，各種預防出生缺陷的高危篩查就屬于特殊檢查。出生缺陷是指嬰兒出生前在母體子宮里發生的發育異常以及身體某些部位存在的畸形，例如無腦兒、腦脊膜膨出、呆小癥、兔唇、先天性心臟病、先天愚型等，其中最主要的是預防先天性疾病和遺傳性疾病，唐氏綜合征就是其中最重要的一種。

已有研究表明，植物乳桿菌、干酪乳桿菌、彎曲乳桿菌、短乳桿菌等是泡菜中發揮優良作用的乳酸菌種類[26]。本研究中，根據同源性檢索分析并結合系統發育樹中21 株乳酸菌的分類學位置，確定在分離得到的21 株乳酸菌中，15 株菌為乳桿菌，6 株為腸球菌。其中菌株8#為乳腸球菌（Enterococcus lactis），菌株11#、16#、19#和60#為彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus），菌株20#為米曲霉乳桿菌（L. oryzae），菌株22#、34#和62#為短乳桿菌（L. brevis），菌株32#、53#和63#為副干酪乳桿菌（L. paracasei），菌株41#和72#為棒狀乳桿菌（L. coryniformis）。由于植物乳桿菌（L. plantarum）JCM 1149和戊糖乳桿菌（L. pentosus）ATCC8041的16S rDNA序列同源性大于99%，通過16S rDNA序列分析無法確定菌株43#、56#和59#的分類學地位，僅能確定菌株43#、56#和59#都屬于乳桿菌。而E. gilvus ATCC BAA-350、E. avium ATCC 14025、E. raffinosus NCIMB 12901和E. malodoratus LMG 10747之間的16S rDNA序列同源性也大于99%，因此菌株44#、46#、48#和71#僅能確定都屬于腸球菌，需進一步的鑒定實驗才能確定其具體的分類學地位。但是，劉曉輝等[27]研究發現，泡菜中不僅能分離出乳桿菌，還分離出了腸膜明串珠菌。這是因為在泡菜發酵過程中，每個時間段的微生物比例有所不同，由于酸菜樣品采集的時間不同，該時間段的優勢菌種也不同[28]。

圖2 乳酸菌16S rRNA基因擴增電泳圖Fig. 2 Electrophoresis pattern of PCR amplified 16S rRNA gene from lactic acid bacteria

圖3 乳酸菌16S rRNA基因序列的遺傳進化樹分析Fig. 3 Phylogenetic tree of Lactobacillus based on 16S rRNA gene sequences

2.3 乳酸菌酸耐受性結果

從表4可以看出，21 株受試乳酸菌在pH 3.0的環境中孵育2 h后，其存活率差異較大，從25.3%～99.1%不等。其中存活率在75%以上的乳酸菌有8 株，分別是菌株8#、11#、16#、53#、56#、59#、60#、62#。菌株53#、59#、62#三株菌的存活率在90%以上，其中59#的存活率達到了99%以上，耐酸性最好。這與Huang[29]和Millette[30]等的研究結果一致，不但不同乳酸菌菌種的酸耐受性之間有差異，而且相同菌種的不同菌株之間的酸耐受性差異也非常大。

表4 pH 3.0對乳酸菌存活率的影響Table 4 Survival rate of LAB strain at pH 3.0%

2.4 篩選菌株的rpoA基因同源性分析

由于僅憑16S rDNA序列分析無法確定篩選的耐酸性菌株中56#和59#的分類學地位，因此為了將來菌株56#和59#在食品工業中的應用，還需要進一步的實驗來確定它們的分類學地位，本研究進行了管家基因rpoA的同源性分析。篩選菌株56#和59#的管家基因rpoA系統發育樹見圖4。

圖4 乳酸菌rpoA序列的系統發育樹Fig. 4 Phylogenetic tree of L. curvatus based on rpoA sequences

菌株56#與L. paraplantarumLMG 16673T的rpoA基因序列同源性為99.6%，結合圖4系統發育樹中它們相應的系統發育位置，確定菌株56#為L. paraplantarum，菌株59#和菌株L. plantarumsubsp.plantarumLMG 6907和L. arizonensisLMG 19807的rpoA基因序列同源性分別為100%和99.3%，因此，結合圖4系統發育樹中其相應的系統發育位置，確定菌株59#是植物乳桿菌植物亞種（L. plantarumsubsp.plantarum）。與李欣等[20]的研究結果相比，本研究的結果更加準確完善。因為一般利用傳統的16S rDNA分子生物學鑒定方法和生理生化特征可以將乳酸菌菌株鑒定到種的水平，但無法準確鑒定L. plantarum和L. pentosus。隨著微生物分類學技術的不斷進步，新的乳酸菌菌種不斷被發現，近年來管家基因被用來在種的水平上鑒別乳酸菌菌株，是用于鑒定爭議菌株的有力工具，具有快速簡便、重復性好、高區分力的特點，是檢測物種最有效的方法[23]。本研究進一步利用管家基因rpoA的同源性分析和構建系統發育樹的方法來準確的確定篩選菌株56#和59#的分類學地位。

3 結 論

從傳統酸菜汁中分離得到的72 株乳酸菌中包括62 株乳桿菌和10 株乳球菌，其中21 株乳酸菌的指紋圖譜不相同。16S rDNA序列同源性分析和系統發育樹可以鑒定出有1 株乳腸球菌，4 株彎曲乳桿菌，1 株米曲霉乳桿菌，3 株短乳桿菌，3 株副干酪乳桿菌，2 株棒狀乳桿菌，剩余3 株為乳桿菌，4 株為腸球菌。21 株乳酸菌菌株中有8 株菌的耐酸性較好，在pH 3.0條件下存活率在75%以上，其中3 株的耐酸性最好，存活率達到90%以上；進一步的管家基因rpoA序列同源性分析，確定篩選出的兩株強耐酸性菌株分別為L. paraplantarum和L. plantarumsubsp.plantarum。本研究篩選出的耐酸性乳酸菌菌株均來自傳統自然發酵的酸菜，通過16S rDNA序列和管家基因同源性分析及構建系統發育樹精確地確定了它們的分類學地位，為其進一步開發應用提供理論基礎。