紫甘藍矢車菊色素苷的分析及其苷元的制備

蔣曉嵐，石渝鳳，付周平，成 琳，劉亞軍，高麗萍，夏 濤,*

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學茶與食品科技學院，安徽 合肥 230036；2.安徽農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，安徽 合肥 230036）

花青素是一類廣泛存在于植物中的天然色素，如紫甘藍、紫薯、葡萄、玫瑰花、藍莓、茄子等[1]。花青素屬于類黃酮化合物，其基本結構如圖1所示，由于取代基的不同，可形成多種花青素，如天竺葵色素、飛燕草色素、矢車菊色素等。游離態(tài)的花青素單體在自然條件下非常少見，經(jīng)常與各種單糖通過糖苷鍵連接形成花青素糖苷。花青素糖苷中的羥基還可以與一個或多個分子的香豆酸、阿魏酸、咖啡酸等通過酯鍵形成酰基化的花色苷[1-2]。

圖1 花青素基本結構Fig. 1 Basic structure of anthocyanins

花青素類色素具有顯著的抗氧化活性[3-5]，還具有抗菌、抗衰老、降低癌癥和心血管疾病發(fā)病率等重要生理功能[6-10]。基于花青素的這些生理活性，花青素相關研究主要集中在對花青素苷提取純化的研究[1,10-16]、花青素理化性質及穩(wěn)定性的研究[3,5,17]、花青素產(chǎn)品的應用及開發(fā)以及花青素合成代謝的調(diào)控[18-20]等，其中對花青素苷的提取純化是其他花青素研究的基礎。

食用蔬菜紫甘藍來源豐富，色素含量很高，相關研究報道花青素的穩(wěn)定性，以及花青素作為酸堿指示劑的特性[21-22]。同其他花青苷類色素一樣，紫甘藍色素具有很強的抗氧化能力，以及預防心腦血管疾病等功效[3-4,23-24]，具有很高的研究價值。液相色譜-質譜法分析表明，紫甘藍花青素中含有多種花色苷，基本為矢車菊色素的一系列糖苷及其酰化物[1-2,5,25-26]。紫甘藍中花青素苷的提取純化技術已基本成熟，相關研究表明大孔樹脂柱、Sephadex LH-20凝膠層析柱等對紫甘藍花青素具有較好的純化效果[11,27-28]。但有關制備高純度花青素苷元的方法報道較少。花青素苷元作為花青素苷以及兒茶素類合成的前體，在研究黃酮類生物合成代謝調(diào)控中，作為標準物質，必不可少。但是花青素苷元價格昂貴，例如矢車菊色素，現(xiàn)在市售95%純度的矢車菊色素單體為842.4 元/mg，利用低成本制取高純度的矢車菊色素苷元具有很大的市場前景。

本實驗在前人研究的基礎上，首先對紫甘藍花青素苷進行定性分析，鑒定紫甘藍中的矢車菊色素苷；然后對矢車菊色素苷的提取條件進行優(yōu)化，并利用AB-8型大孔樹脂對矢車菊色素苷進行初步純化后，通過高溫酸水解的方法獲得游離態(tài)矢車菊色素粗品；再利用C18柱層析的方法純化得到矢車菊色素單體；最后通過結晶沉淀的方法獲得純度大于99%矢車菊色素單體粉末，從而為后續(xù)的科學研究提供特定的標準物質。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫甘藍購于合肥清溪路大潤發(fā)超市，清洗后去除老葉受損的葉子，置于冰箱中保存。

甲醇、乙腈、乙酸（均為色譜純） 美國Tedia公司；無水乙醇、甲醇（均為分析純），濃鹽酸 國藥集團藥業(yè)股份有限公司；AB-8型大孔樹脂 安徽良臣硅源材料有限公司；C18柱填料 GE醫(yī)療生命科學公司。

1.2 儀器與設備

ANKE TGL-16C臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；ZK高速自控組織搗碎機 江蘇省鹽城縣龍崗醫(yī)療機械廠；AR124CN電子天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；UV-265型分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；20AD高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 日本島津公司；HH-2恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；YCYN-DCY-24Y圓形氮吹儀 上海鄆曹電子科技有限公司；超高壓液相色譜-串聯(lián)質譜（ultra pressure liquid chromatographytandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）、20RBAX RRHD Eclipse Plus C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm） 安捷倫科技（中國）有限公司；Synergi 4u Fusion色譜柱（250 mm×4.6 mm） 美國Phenomenex公司；AVANCE AV 400（400/100 MHz）核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）儀 瑞士Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 紫甘藍花青素苷的分析鑒定

1.3.1.1 紫甘藍花青素苷的提取

稱取0.1 g紫甘藍置于研缽中，加入含50%乙醇-1%鹽酸溶液1 mL作為提取溶液，進行研磨提取，離心取上清液。重復上述步驟2 次，合并上清液，定容至2 mL，備用。

1.3.1.2 紫甘藍花青素苷最大吸收波長的確定

將獲得的紫甘藍花青素苷溶液稀釋后，以蒸餾水作為空白對照，用分光光度計在400～600 nm波長范圍內(nèi)對其進行吸光度測定，從而確定最大吸收波長，并在最大波長處測定各個因素的吸光度，探討各因素對紫甘藍花青素提取純化的影響。

1.3.1.3 紫甘藍花青素苷的鑒定

色譜條件：流速0.2 mL/min，柱溫箱40 ℃。流動相為0.4%乙酸溶液（A相），100%乙腈（B相）；線性洗脫梯度為：0～10 min，10%～30% B，1 0～1 5 m i n，3 0%～3 5% B；1 5～1 8 m i n，35%～10% B，回到起始比例。

質譜條件：正、負離子模式，電子電離源，碎裂電壓175 V，質量掃描范圍m/z 100～2 000，毛細管電壓3 500 V，干燥氣流速6 L/min，干燥氣溫度350 ℃，噴霧器電壓45 psi。

通過UPLC-MS/MS保留時間、最大吸收波長、質子化/去質子化分子（[M+H]+/[M－H]－），以及主要的碎片離子，與標準品及文獻進行比較分析，對化合物進行鑒定。

1.3.2 矢車菊花青素苷提取工藝的優(yōu)化

分別稱取0.1 g紫甘藍葉片放入研缽中，按不同料液比，加入不同體積分數(shù)乙醇溶液和鹽酸搗碎至勻漿。考察提取液中乙醇體積分數(shù)（20%、30%、40%、50%、60%、70%）、鹽酸體積分數(shù)（0.5%、1%、2%）、料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL））因素對矢車菊色素苷提取效果的影響，確定最佳提取工藝。

1.3.3 矢車菊花青素苷的初步純化

在最佳提取條件下，用組織搗碎機提取約1.152 kg紫甘藍中的矢車菊色素苷，抽濾后備用。AB-8型大孔樹脂填料用無水乙醇浸泡過夜，倒入層析柱中，然后用2～3 倍無水乙醇清洗，再用3～5 倍柱體積的純水洗至流出液無醇味。將提取的矢車菊色素苷初提液稀釋至乙醇體積分數(shù)約為10%時上柱，待矢車菊色素苷全部被吸附后，再用3～5 倍柱體積的純水沖洗；用10%、20%、30%、40%、50%乙醇溶液依次洗脫，收集各洗脫液。

1.3.4 矢車菊花青素苷的酸解

由于矢車菊色素苷屬糖苷化合物，而糖苷化合物在含1%～7%鹽酸體積分數(shù)的洗脫液中，高溫下會水解成相應的苷元和糖配體。收集初步純化的矢車菊色素苷，按4∶1比例與濃鹽酸混合配成水解溶液，置于90 ℃恒溫水浴箱中水解1 h，得到矢車菊花青素苷水解后的溶液。

1.3.5 矢車菊色素的C18柱純化

將矢車菊色素純度最高的組分上C18柱，吸附后分別用3 倍柱體積的30%、50%和70%甲醇溶液洗脫，收集不同的洗脫液，HPLC分析其純度。

1.3.6 矢車菊色素結晶

將上述得到的高純度矢車菊色素，用純水稀釋到甲醇體積分數(shù)為10%左右，再用大孔樹脂吸附，然后用100%甲醇洗脫進行濃縮。濃縮液在通風廚中揮發(fā)，除去部分甲醇，按體積比5∶1加入濃鹽酸，－20 ℃冷凍一段時間后即出現(xiàn)大量析出的紫紅色沉淀。得到的沉淀離心后用氮吹儀吹干，得到矢車菊色素純品粉末。

1.3.7 矢車菊色素HPLC分析

HPLC條件：檢測波長為530 nm，流速為1.0 mL/min，進樣量為5 μL。采用梯度洗脫，條件為A相1%乙酸，B相乙腈，洗脫梯度為0～30 min，87%～70% A相；30～33 min，70%～87% A相。

1.3.8 矢車菊色素1H-NMR分析

將得到的矢車菊色素苷元粉末溶于氘代甲醇（CD3OD），然后轉移到5 mm直徑的核磁管中，用H-NMR儀在反轉門控去偶條件下，脈沖角度為45°，收集時間為0.4 s，延遲時間為2.6 s，掃描頻率為25 000～30 000 Hz進行1H-NMR分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和圖像處理

提取條件的優(yōu)化，每個實驗重復3 次，然后取平均值。HPLC及質譜圖分析，經(jīng)Adobe Photoshop CS5軟件進一步處理。最后所得矢車菊色素純品，其得率計算：得率=純品質量/紫甘藍質量。

2 結果與分析

2.1 紫甘藍花青素苷的分析鑒定結果

2.1.1 紫甘藍花青素最大吸收波長的確定

花青素色素類在520～600 nm波長之間有一明顯的最大吸收峰。從圖2可知，紫甘藍花青素的最大吸收峰是在520～530 nm波長處，因此本實驗于波長530 nm處測定各吸光度，探討各種實驗條件對紫甘藍色素提取純化的影響。

圖2 花青素紫外吸收光譜Fig. 2 Ultraviolet absorption spectrum of anthocyanins from purple cabbage

2.1.2 紫甘藍花青素苷的鑒定

利用UPLC-MS/MS對紫甘藍花青素苷提取物進行定性分析，由圖3A和3B可知，530 nm波長處液相色譜圖和總離子流圖相一致，且在正離子模式下，花青素苷類化合物的離子化效果很好。根據(jù)一級質譜離子和二級質譜碎片離子，以及保留時間等信息（圖2C），獲得化合物的分子質量信息，分析每個譜峰，確定可能的分子質量，并與文獻報道的成分進行比較，推測色譜峰的可能組成。

峰1在正離子模式下，一級質譜m/z 773，二級質譜m/z 611、449和287（圖3C和表1）。其中二級質譜中的信號m/z 611、449和287分別是m/z 773失去1、2 個和3 個葡萄糖基（質量數(shù)162）所得，根據(jù)文獻[1,2,5]，峰1預測為矢車菊-3-二葡萄糖苷-5-葡萄糖苷。峰4和峰12，正離子模式下，一級質譜m/z 979，二級質譜m/z 817、449和287（圖3C和表1），其中二級質譜中的信號m/z 817是母離子m/z 979失去1個葡萄糖基（質量數(shù)162）所得，m/z 449是母離子m/z 979失去質量數(shù)530所得，推測為2 個葡萄糖基和1 個芥子酰基，根據(jù)文獻[1,2,5]，峰4和峰12預測為矢車菊-3-(芥子酰基)-二葡萄糖苷-5-葡萄糖苷。峰16在正離子模式下，一級質譜m/z 1 185，二級質譜為m/z 1 023、449和287（圖3C和表1），其中二級質譜中的信號m/z 1 023，是母離子m/z 1 185失去1 個葡萄糖基（質量數(shù)162）所得，m/z 449是母離子m/z 1 185失去質量數(shù)736所得，推測為2 個葡萄糖基和2個芥子酰基，根據(jù)文獻[1,2,5]，峰16預測為矢車菊-3-(芥子酰基)(芥子酰基)-二葡萄糖苷-5-葡萄糖苷。

圖3 紫甘藍中花色苷的鑒定Fig. 3 Identification of anthocyanins of purple cabbage

按照上述方法，從紫甘藍中分析鑒定16 種花色苷類化合物（表1），主要為B環(huán)二羥基的矢車菊類花色苷。紫甘藍中花色苷主要為酰基化形式，更有利于花色苷的穩(wěn)定，酰基化作用的酸有p-香豆酸、阿魏酸、咖啡酸、琥珀酸和芥子酸等。酰化的糖鏈將折疊好的酰基纏繞在2-苯基苯并吡喃骨架的表面，此堆積作用不僅對花色苷具有保護作用，而且對系統(tǒng)的色澤穩(wěn)定性具有積極的作用[29]。

表1 通過UPLC-MS MS鑒定紫甘藍中花青素Table 1 Identifified anthocyanin from purple cabbage via UPLC-MS MS

2.2 紫甘藍花青素苷元的制備與純化結果

2.2.1 矢車菊色素苷提取工藝的優(yōu)化結果

研究結果表明，乙醇體積分數(shù)為20%～60%，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，對矢車菊色素苷提取效果越來越好；乙醇體積分數(shù)過高，不利于紫甘藍矢車菊色素苷的提取。本著經(jīng)濟原則以及后續(xù)純化的方便，選擇體積分數(shù)50%乙醇溶液（圖4A）。根據(jù)文獻[21-22]，酸性溶液環(huán)境有助于提高花青素的穩(wěn)定性，實驗發(fā)現(xiàn)向提取溶液中加入少量鹽酸，能夠顯著提高提取效果。然而過多鹽酸會使溶液酸度過大，在后續(xù)的柱層析純化過程中，影響柱填料的性能，因此結合文獻，最終選擇含1%鹽酸的乙醇溶液作為提取液（圖4B）。由圖4C顯示，隨提取試劑的增加，提取效果無明顯差別，考慮經(jīng)濟成本以及對環(huán)境的影響，選擇1∶10（g/mL）作為提取紫甘藍矢車菊色素苷的料液比。

圖4 不同提取條件對矢車菊色素苷提取效果的影響Fig. 4 Effect of extraction concentrations on the yield of cyanidins

2.2.2 矢車菊色素苷的初步純化結果

矢車菊色素苷粗提液用大孔樹脂吸附后，經(jīng)不同體積分數(shù)乙醇梯度洗脫，結果顯示40%乙醇溶液洗脫后得到的組分顏色最深，呈紫紅色，可知40%乙醇溶液洗脫時得到的矢車菊色素苷的含量最高（圖5A）。用紫外分光光度計檢測表明，5 組吸光度分別為0.133、0.278、0.468、0.524、0.453，可知40%乙醇溶液洗脫時，其吸光度最大（圖5B）。

圖5 AB-8大孔樹脂純化紫甘藍矢車菊色素苷效果Fig. 5 Purification efficiency of cyanidins with macroporous resin AB-8

2.2.3 矢車菊色素的制備與純化

圖6 經(jīng)C18純化后的矢車菊色素HHPPLLCC圖Fig. 6 HPLCprofiles of cyanidins puri fied with C18

收集初步純化后的矢車菊色素苷溶液，水解去除糖配體后，再經(jīng)C18柱純化。用C18柱純化時，分別依次用30%、50%、70%甲醇溶液洗脫，收集各洗脫液并進行HPLC分析。由圖6A可知，矢車菊色素的出峰時間約為12.5 min，其中30%甲醇洗脫液時，矢車菊色素主峰前仍有雜質峰（圖6B），推測是未水解的矢車菊色素苷。70%甲醇洗脫液時，在矢車菊色素主峰后，有雜質峰，可能是水解過程中氧化變性的花青素（圖6D）。而50%甲醇洗脫液顯示除矢車菊色素峰外，幾乎無雜峰，說明經(jīng)C18柱純化后，50%甲醇洗脫液中含有高純度的矢車菊色素單體，其純度可達到98%（圖6C）。

2.2.4 矢車菊色素結晶

根據(jù)上述實驗最后純化得到矢車菊色素純品粉末約100 mg，計算得率為86.806 mg/kg。1H-NMR分析表明，得到的純品粉末為矢車菊色素（圖7A）。HPLC二維以及三維圖譜分析表明，結晶后的矢車菊色素純度大于99%（圖7B、C）。光譜分析表明，矢車菊色素最大吸收波長為524 nm（圖7D），質譜分析表明，正離子模式下矢車菊色素m/z 287（圖7E）。

圖7 結晶沉淀后純化的矢車菊色素特性Fig. 7 Properties of cyanidin monomer powder after crystallization

3 結 論

通過UPLC-MS/MS對紫甘藍中花色苷進行分析，發(fā)現(xiàn)紫甘藍中花色苷主要是B環(huán)二羥基的矢車菊色素的衍生物。在此基礎上，對紫甘藍中花色苷和矢車菊色素進行純化。首先，以提取劑體積分數(shù)、鹽酸體積分數(shù)、料液比為考慮因素，分別對紫甘藍中的色素提取條件進行探索，通過單因素試驗得出紫甘藍矢車菊色素苷的最佳提取條件為：含1%鹽酸的50%乙醇溶液作為提取溶劑、料液比1∶10（g/mL）。經(jīng)過AB-8大孔樹脂以及C18純化后，結晶得到比較純的矢車菊色素。經(jīng)HPLC分析，純度達99%以上。1.152 kg紫甘藍獲得100 mg矢車菊色素純品粉末，得率為86.806 mg/kg。