血管內皮生長因子、基質金屬蛋白酶在骨肉瘤中的表達及臨床意義

黃世超，王丙武，陳向陽

1徐州醫科大學附屬醫院骨科，江蘇 徐州221000

2徐州醫科大學臨床醫學系，江蘇 徐州2210000

骨肉瘤是一種常見的骨原發惡性腫瘤，有侵襲力強、轉移率高等特點，治療難度較大[1]。化療是目前治療該病的常見方法，該方法雖然大大提高了患者的生活質量，但仍有約一半的患者因化療后轉移死亡[2]。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一種促血管生成因子，是影響惡性腫瘤新生血管形成的重要因素之一。基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）是一類內肽酶，在腫瘤的發展以及血管的生成過程中發揮了重要作用[3-4]。VEGF和MMP[主要是基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）和基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）]是抗血管生成治療的兩個重要靶因子，廣泛參與腫瘤的惡性侵襲和轉移。VEGF和MMP多集中表達于上皮源性腫瘤，有關VEGF和MMP與骨肉瘤關系的報道較少。為此，本研究探討VEGF和MMP在骨肉瘤中的表達及臨床意義，以指導骨肉瘤抗血管生成治療，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2014年5月至2017年7月徐州醫科大學附屬醫院接診的骨肉瘤患者的病歷資料。納入標準：符合世界衛生組織（WHO）關于骨肉瘤的診斷標準[5]，且經病理學檢查確診。排除標準：合并其他器官惡性腫瘤者。根據納入、排除標準共納入80例骨肉瘤患者，其中男43例，女37例；年齡18～50歲，平均（23.9±8.2）歲；腫瘤部位：四肢54例，軀干26例；腫瘤大小：≤4 cm 47例，＞4 cm 33例；Enneking分期[6]：Ⅱ期44例，Ⅲ期36例；有軟組織浸潤52例，無軟組織浸潤28例。所有患者均取手術切除骨肉瘤標本。選取同期在徐州醫科大學附屬醫院治療的50例非瘤性骨折患者作為對照，用活檢夾取黏膜下層組織，其中男28例，女22例；年齡16～51歲，平均（22.3±7.7）歲。骨肉瘤與非瘤性骨折患者的性別和年齡比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 檢測方法

二氨基聯苯胺顯色劑購自上海嶸崴達實業有限公司。所有的待檢測組織標本均經中性福爾馬林固定，石蠟包埋，5 μm連續切片。根據免疫組織化學鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結（streptavidin-perosidase，SP）試劑盒（購自上海天呈醫流科技股份有限公司）說明書，檢測骨肉瘤和非瘤性骨組織中VEGF、MMP2和MMP9蛋白表達情況，以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）代替一抗作為陰性對照，以已知的VEGF、MMP2、MMP9陽性切片作為陽性對照。

結果判定：以細胞膜黃染和（或）細胞質內出現棕黃色顆粒為陽性細胞，計數5個高倍鏡視野，避開出血、壞死和腫瘤細胞變性區域。MMP2和MMP9僅作定性分析，陽性細胞所占百分比＞5%為陽性；VEGF作半定量分析，陽性細胞所占百分比＜10%為陰性（-），≥10%且＜50%為弱陽性（+），≥50%且＜80%為中等陽性（++），≥80%為強陽性（+++），除陰性（-）外，均為陽性。

1.3 觀察指標

①比較骨肉瘤組織與非瘤性骨組織中VEGF、MMP2和MMP9的陽性表達率；②分析骨肉瘤組織中VEGF、MMP2和MMP9的表達情況與腫瘤大小、腫瘤部位、Enneking分期和有無軟組織浸潤的關系；③分析骨肉瘤組織中MMP2、MMP9與VEGF表達的相關性。

1.4 統計學分析

采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，計數資料以例數及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，相關性分析采用Spearman相關分析法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 VEGF、MMP 2和MMP 9陽性表達情況的比較

骨肉瘤組織中VEGF、MMP2和MMP9的陽性表達率均明顯高于非瘤性骨組織，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（表1）

表1 骨肉瘤組織與非瘤性骨組織中VEGF、MMP 2和MMP 9陽性表達情況的比較[ n（%）]

2.2 VEGF、MMP 2和MMP 9的表達與臨床特征的關系

不同腫瘤大小、腫瘤部位的骨肉瘤患者的骨肉瘤組織中VEGF、MMP2和MMP9陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。Enneking分期為Ⅲ期、有軟組織浸潤的骨肉瘤患者的骨肉瘤組織中VEGF、MMP2和MMP9陽性表達率均高于Enneking分期為Ⅱ期、無軟組織浸潤的患者，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征骨肉瘤患者的骨肉瘤組織中VEGF、MMP 2和MMP 9的陽性表達情況（ n=80）

2.3 MMP 2、MMP 9與VEGF表達的相關性

骨肉瘤組織中MMP2、MMP9與VEGF表達均呈顯著正相關（r=0.657、0.510，P＜0.01）。

3 討論

骨肉瘤是一種好發于青少年的惡性骨腫瘤，會導致患者骨骼畸形，進而造成肢體殘疾，嚴重者會危及生命。骨肉瘤的生長、浸潤以及轉移的過程受到諸多因素的影響，多種基因和蛋白參與其中[7]。近年來，影像學和病理學技術取得了較快的發展，骨肉瘤的診斷和治療方法也有了顯著的進展和突破。目前，骨肉瘤的診斷一般通過病理學檢查，治療方法通常是手術切除輔以化療和靶向治療等，但其確診的難度和復發問題仍未完全解決。骨肉瘤發展和轉移的過程與腫瘤新生血管的形成和細胞外基質的降解密切相關[8-9]。

VEGF是一種促血管生成因子，在多種實體瘤的進展中發揮著關鍵作用。在各種多肽類血管生長因子中，VEGF針對血管內皮的特異度最高[10]。VEGF能夠促進血管內皮細胞的增殖和血管的新生，增強其通透性。實體瘤的血管新生與腫瘤細胞分泌的多種血管生長因子有關[11-12]。MMP是一類蛋白水解酶，能夠降解所有的細胞外基質，在骨肉瘤的發生與發展過程中的各個環節起關鍵作用。健康人的MMP表達水平通常較低，而惡性腫瘤患者的MMP表達水平明顯高于健康人。MMP2通常存在于多種惡性腫瘤中，以酶原的形式分泌至細胞外基質中，促進腫瘤細胞進入血管或淋巴管[13-14]。MMP2還可誘導血管生成，進而促進腫瘤細胞的增殖和轉移[15]。MMP9可以調節腫瘤細胞的生長環境和血管生長，促進腫瘤細胞的侵襲和轉移以及血管內皮細胞的遷移，生成新的血管[16]。

本研究結果顯示，骨肉瘤組織中VEGF、MMP2和MMP9的陽性表達率分別為62.5%、70.0%和65.0%，均明顯高于非瘤性骨組織的10.0%、14.0%和14.0%，表明三者在骨肉瘤組織中高表達，在骨肉瘤的進展過程中發揮了重要作用，此結果也符合上述結論。本研究分析了骨肉瘤組織中VEGF、MMP2和MMP9的表達與臨床特征的關系，結果顯示，不同腫瘤大小、腫瘤部位的骨肉瘤患者的骨肉瘤組織中VEGF、MMP2和MMP9陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。Enneking分期為Ⅲ期、有軟組織浸潤的骨肉瘤患者的骨肉瘤組織中VEGF、MMP2和MMP9陽性表達率均高于Enneking分期為Ⅱ期、無軟組織浸潤的患者，差異均有統計學意義（P＜0.05）。表明VEGF、MMP2和MMP9的表達與軟組織浸潤和Enneking分期有關。有研究報道，細胞外基質和基底膜的降解為腫瘤周圍浸潤的生物學基礎，MMP在細胞外基質和基底膜的降解中承擔著重要作用[17]，因而MMP廣泛參與腫瘤組織的浸潤及轉移，這與本研究結果吻合。軟組織浸潤和Enneking分期均與骨肉瘤的預后有關，因此，可以認為VEGF、MMP2和MMP9的高表達會給患者帶來較差的預后。本研究分析了骨肉瘤組織中VEGF與MMP2、MMP9表達的相關性，結果顯示MMP2、MMP9與VEGF的表達均呈顯著正相關。提示VEGF與MMP2、MMP9在骨肉瘤的侵襲生長和轉移過程中有正向調節作用，協同參與骨肉瘤的發生和發展，而且三者的表達情況可以作為判斷腫瘤侵襲能力的標志。有研究認為在此過程中MMP9作為重要調節因子，在信號轉導通路中處于VEGF上游位置[18]。綜上所述，VEGF、MMP2和MMP9在骨肉瘤組織中高表達，且其表達均與患者的軟組織浸潤和Enneking分期有關，三者協同參與了骨肉瘤的發生和發展。