HBV相關(guān)慢加急性肝衰竭前期外周血中Toll樣受體3、4的表達(dá)

蘇金良 陳慧 朱莉 陸敏嘉 李明

乙型肝炎病毒相關(guān)慢加急性肝衰竭(HBV-related acute-on-chronic liver failure，HBV-ACLF)是在慢性乙肝基礎(chǔ)上短時(shí)間內(nèi)發(fā)生的一種嚴(yán)重急性肝功能失代償，疾病進(jìn)展迅速，救治十分困難。根據(jù)HBV-ACLF發(fā)病機(jī)制及疾病進(jìn)程，慢性乙肝從開始急性加重至肝衰竭常有一段時(shí)間，這一段短暫時(shí)間為乙肝重癥化或稱為肝衰竭前期(acute-on-chronic-pre-liver failure，pre-ACLF)。目前國內(nèi)臨床診斷pre-ACLF是根據(jù)我國2012年《肝衰竭診治指南》[1]中肝衰竭前期概念進(jìn)行診斷，包括消化道癥狀、黃疸及凝血酶原活動(dòng)度等。然而，肝衰竭前期疾病進(jìn)程與臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，依據(jù)這些指標(biāo)存在一定的局限性，預(yù)測(cè)肝衰竭的發(fā)生率低于25%[2-3]。特異性或非特異性免疫反應(yīng)在HBV所致肝衰竭的發(fā)病機(jī)制中起著十分關(guān)鍵的作用，其中Toll樣受體(Toll like receptor，TLR)既參與非特異性免疫，又可以激活特異性免疫應(yīng)答，導(dǎo)致大量炎性因子的瀑鏈?zhǔn)结尫?，引發(fā)肝臟局部和全身炎性反應(yīng)。Toll樣受體3(TLR3)能識(shí)別HBV復(fù)制的中間產(chǎn)物雙鏈RNA(dsRNA)，在抗HBV免疫過程中具有重要作用；Toll樣受體4(TLR4)可識(shí)別脂多糖內(nèi)毒素(lipopolysaccharide，LPS)，在肝衰竭發(fā)生時(shí)腸道來源的LPS進(jìn)入血中，是促發(fā)肝衰竭的重要因素之一[4-5]。因此，本文通過檢測(cè)pre-ACLF患者TLR3和TLR4的變化，分析其對(duì)pre-ACLF的診斷價(jià)值。

資料與方法

一、病例來源

選擇2016年12月至2018年6月蘇州市第五人民醫(yī)院住院患者60例，男性46例，女性14 例，年齡26～71歲。其中HBV-ACLF前期患者30例、慢性乙肝患者30例。另選健康對(duì)照者15名，男8名，女7名，年齡27～50歲，均系健康獻(xiàn)血員。所有患者均為慢性HBV感染者，排除HCV、HDV感染，病史超過3 年。慢加急性肝衰竭(ACLF)前期診斷參照2012年中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)、感染病學(xué)分會(huì)制定《肝衰竭診治指南》[1]的標(biāo)準(zhǔn)；慢性乙型肝炎診斷參照2005年中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)、感染病學(xué)分會(huì)制定《慢性乙型肝炎防治指南》[6]的標(biāo)準(zhǔn)。

二、主要試劑和儀器

使用美國BD公司的流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞中TLR3和TLR4表達(dá)水平。單個(gè)核細(xì)胞TLR3和TLR4表達(dá)檢測(cè)分別采用FITC-anti-TLR3單克隆抗體和PE-anti-TLR4單克隆抗體，同型對(duì)照抗體分別為FITC-mouse IG 2a和PE-mouse IG 2a，上述試劑均為美國BD公司產(chǎn)品。

三、 流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞表面的TLR3、TLR4

取EDTA抗凝血細(xì)胞懸液100 μL，分別依次加入APC-anti-CD14抗體10 μL，F(xiàn)ITC-anti-TLR3抗體10 μL，PE-anti-TLR4抗體10 μL，EDTA抗凝全血100 L，震蕩充分混勻，避光溫育30 min；然后加溶血素2 mL，溶血20 min，離心，棄液體成分；以PBS洗滌2次后，再以PBS配成約106/mL液，然后用BD FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)。以APC-CD14陽性設(shè)門，壞死細(xì)胞和碎片等根據(jù)側(cè)向散射特征予以排除，門內(nèi)細(xì)胞即為CD14+單個(gè)核細(xì)胞，共獲取門內(nèi)10 000個(gè)單個(gè)核細(xì)胞。對(duì)上述10 000個(gè)單核細(xì)胞的數(shù)據(jù)，經(jīng)Cellquest統(tǒng)計(jì)軟件分析，獲取直方圖，以平均免疫熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity，MFI)分別表示TLR3和TLR4的表達(dá)強(qiáng)度。FITC-mouse IG 2a，kappa 10 μL代替FITC-anti-TLR3，PE-mouse IG 2a，kappa 10 μL代替PE-anti-TLR4抗體作為同型對(duì)照。實(shí)驗(yàn)所用抗體均為美國Ebioscience公司產(chǎn)品。

四、生化指標(biāo)檢測(cè)

血清TBil、ALT、AST、PTA、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein, CRP)等采用常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查方法檢測(cè)。HBV DNA采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定，儀器用美國GeneAmp PE9600型PCR儀。嚴(yán)格按產(chǎn)品說明書操作，檢測(cè)靈敏度為102cps/mL。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、一般臨床資料及生化指標(biāo)

各組患者的一般情況以及臨床生化指標(biāo)見表1。ACLF前期組患者TBil、ALT、PTA和CRP均明顯升高，與慢性乙肝組和健康對(duì)照組比較，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。健康對(duì)照組與慢性乙肝組比較TBil、ALT、PTA和CRP均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。

二、外周血中TLR3和TLR4表達(dá)水平

各組患者外周血中TLR3和TLR4表達(dá)水平見表2。ACLF前期組患者外周血中TLR3的MFR明顯升高，分別與慢性乙肝組、健康對(duì)照組比較，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。同時(shí)，ACLF前期組患者外周血中TLR4的MFR也明顯上升，分別與慢性乙肝組、健康對(duì)照組比較，也均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而慢性乙肝組患者與健康對(duì)照組比較，外周血中TLR4表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。

表1 各組一般臨床資料及生化指標(biāo)的比較(±s)

注： BMI為體質(zhì)指數(shù)；TBil為總膽紅素；ALT為丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶；AST為天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶；PTA為凝血酶原活動(dòng)度；CRP為C反應(yīng)蛋白. MELD評(píng)分為終末期肝病模型

表2 各組外周血中TLR3和TLR4表達(dá)水平的

注：a同組內(nèi)與健康對(duì)照組比較，P<0.05；b同組內(nèi)與慢性乙肝組比較，P<0.05

三、TLR3和TLR4診斷預(yù)警價(jià)值

外周血TLR3診斷ACLF前期ROC曲線下的面積(AUC)為 0.830(95%CI為0.728～0.932 ) ,標(biāo)準(zhǔn)誤為0.052;外周血TLR4診斷ACLF前期的ROC曲線曲線下面積為0.977(95%CI為0.948～1.000)，標(biāo)準(zhǔn)誤為0.014。見圖1。

圖1 TLR3和TLR4診斷HCC的ROC 曲線

四、ACLF前期患者4周內(nèi)發(fā)生ACLF的情況

30例ACLF前期患者中4周內(nèi)發(fā)生ACLF有7例，未發(fā)生ACLF有23例。發(fā)生ACLF患者外周血中TLR3的MFR為32.37±3.55，而未發(fā)生ACLF患者組外周血中TLR3的MFR為24.56±7.09，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)；同時(shí)，與未發(fā)生ACLF患者外周血中TLR4的MFR(13.94±4.95)比較，發(fā)生ACLF患者外周血中TLR4的MFR (22.17±3.51)也有顯著升高 (P<0.05)。

討 論

肝衰竭的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后取決于肝細(xì)胞的壞死和(或)凋亡程度、殘存肝細(xì)胞的數(shù)量和功能、肝細(xì)胞的再生能力、肝臟的基礎(chǔ)情況(包括纖維化程度) 、并發(fā)癥以及綜合治療是否恰當(dāng)?shù)龋鳷LR參與了肝衰竭各個(gè)主要環(huán)節(jié)，與肝衰竭發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[7-8]。TLR3可識(shí)別各種形式的雙鏈(ds)RNA，包括病毒dsRNA和dsRNA的合成模擬物多聚肌苷酸-多聚胞苷酸 (polyinosinicacid：Polycytidylic acid，polyI:C)。poly I:C作為TLR3的激動(dòng)劑可以激活TLR3，促進(jìn)核因子-κB(NF-κB)和干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF3)入細(xì)胞核，分泌大量干擾素 (interferon，IFN )-γ、IFN-β和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF )-α，導(dǎo)致肝臟炎癥發(fā)生、肝細(xì)胞出現(xiàn)大量壞死或凋亡[5,9]。也有研究發(fā)現(xiàn)，TLR3激活在對(duì)乙酰氨基酚(aceta-minophen，APAP )所致小鼠肝損傷中起關(guān)鍵作用，是APAP誘導(dǎo)所致肝衰竭的必要條件。TLR3激活導(dǎo)致TNFα等明顯增加、顯著促進(jìn)APAP引起肝臟細(xì)胞壞死和炎癥，而TLR3基因缺陷小鼠對(duì)APAP的肝組織損傷顯著減輕、TNFα明顯減少[10]。另一方面，肝衰竭發(fā)生時(shí)，腸道內(nèi)革蘭陰性細(xì)菌易位，其LPS大量進(jìn)入血中。LPS 是TLR4的識(shí)別受體，TLR4激活后通過髓樣分化因子88(MyD88)依賴途徑啟動(dòng)NF-κB信號(hào)通路及其相關(guān)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致TNF-α等大量炎癥因子的瀑鏈?zhǔn)结尫?，促進(jìn)肝衰竭發(fā)生和發(fā)展[11]。研究發(fā)現(xiàn)，二型組蛋白去乙酰酶抑制劑CAY10683通過保護(hù)急性肝衰竭大鼠模型中的腸黏膜屏障，控制LPS入血液從而減少對(duì)TLR4激活，并下調(diào)或抑制LPS/TLR4/MyD88通路，從而減輕肝細(xì)胞進(jìn)一步壞死和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)ALT、AST 和TBil水平均有顯著下降[12]。TLR4在APAP誘導(dǎo)的急性肝功能衰竭(ALF)發(fā)生中有重要作用,TLR4基因缺陷的小鼠或經(jīng)TLR4拮抗劑：e5564處理的小鼠對(duì)APAP給藥后72 h的促炎基因表達(dá)較少、肝組織炎癥和肝細(xì)胞壞死程度較輕，存活率也更高[13]。因此,TLR3和TLR4參與了早期肝衰竭發(fā)生發(fā)展的多個(gè)重要環(huán)節(jié)，TLR3和TLR4的表達(dá)低下或障礙可能使HBV慢性感染者不能有效地啟動(dòng)機(jī)體免疫反應(yīng)和肝臟炎癥損害。本文通過檢測(cè)HBV-ACLF前期外周血單個(gè)核細(xì)胞表面的TLR3、TLR4表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，ACLF前期患者外周血中TLR3和TLR4明顯升高；根據(jù)TLR3和TLR4檢測(cè)結(jié)果分別繪制ROC曲線, TLR3和TLR4診斷ACLF前期ROC曲線下的面積(AUC)分別為 0.830和0.977。提示ACLF前期患者TLR3和TLR4的變化有助于對(duì)ACLF前期的診斷。

綜上所述，臨床上僅僅依靠TBil、PTA等指標(biāo)對(duì)ACLF前期進(jìn)行早期精準(zhǔn)診斷尚不令人滿意，而從HBV所致肝衰竭的發(fā)病機(jī)制中進(jìn)行探索研究、尋找新的可靠的臨床指標(biāo)很有價(jià)值。通過監(jiān)測(cè)HBV-ACLF前期患者TLR3和TLR4等變化可了解疾病的進(jìn)展，有助于對(duì)ACLF前期進(jìn)行早期診斷。本研究臨床病例數(shù)偏少，今后可繼續(xù)擴(kuò)大樣本量，開展大規(guī)模前瞻性探索性研究和驗(yàn)證，包括其動(dòng)態(tài)變化的數(shù)學(xué)預(yù)測(cè)模型或評(píng)分系統(tǒng)等，為臨床診療提供更多的理論依據(jù)。