基于SIRT3/FXO1信號通路探討大黃素對NASH大鼠肝細胞損傷和肝組織炎癥的影響

寇小妮 解新科 郝明霞 吳維 邊倩 馬文軍

NAD依賴性脫乙酰酶(Sirtuin 3，SIRT3)是一種NAD +依賴性蛋白質脫乙酰基酶，可通過調節多種蛋白質的乙酰化水平來調節氧化代謝和氧化應激。研究表明，長期高脂肪飲食可導致線粒體基質中SIRT3表達減少和高乙酰化蛋白[1]。FOXO1是SIRT3調控下的重要代謝調控因子，研究表明，芳香烴受體的激活可降低SIRT3的活性，導致小鼠對非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的易感性增加[2]。大黃素為蓼科植物虎杖干燥根莖和根的提取物，具有良好的抗炎、抗氧化、調節代謝作用[3]。本研究擬基于SIRT3FXO1信號通路探討大黃素對NASH大鼠細胞損傷和肝組織炎癥的影響。為NASH的治療提供理論及臨床依據。

材料與方法

一、動物分組

Sprague-Dawley大鼠100只，6～8周齡，體質量(200±20)g購自北京維塔爾河實驗動物有限公司(北京)。根據體重隨機分成5組：對照組、模型組、大黃素低、中、高劑量組(10、20、40 mg/kg)，每組20只，雌雄各半。

二、藥物、儀器及試劑

大黃素購自美倫生物科技有限公司。 將大黃素溶解在10% DMSO中，大鼠用藥量為成人的20.13 倍，以10 mL/kg灌胃，將藥液濃度配制成為10 g/mL。SIRT3、FXO1、AST、ALT、TNF-α、IL-6、CASPASE-3、CASPASE-6、CASPASE-9 ELISA試劑盒購于南京森貝伽生物科技有限公司，抗SIRT3(Bioss)、抗FXO1(Santa Cruz;達拉斯，TX)、DAB顯色試劑盒購于博士德生物工程有限公司，HematoxylinEosin Stain試劑盒(南京建城生物工程研究所)，SABC-AP試劑盒(建國生物工程研究所，南京)。

三、各實驗組的制備

對照組大鼠采用普通動物飼料喂養，模型組和大黃素劑量組采用高脂(普通標準飼料82%、豬油 10%、膽固醇2%、3號膽鹽1%、蛋黃粉5%)飲食喂養。第12周每組處死兩只大鼠以驗證模型。從第13周開始，大黃素劑量大鼠每天給予10、20、40 mg/kg的大黃素灌胃，而模型組和對照組給予同等體積的蒸餾水灌胃。12周后，處死大鼠，取出肝臟以計算肝臟指數(肝臟濕重/體重≤100%)。

四、大鼠肝細胞損傷指標的測定及肝組織病理結構觀察

根據Brunt標準評估肝臟脂肪變性，炎癥反應和球狀樣變化及NASH活動度積分(NAS)等病理組織學變化進行診斷。制作常規HE切片，將切片用檸檬酸鉛和乙酸鈾酰染色10 min，并在透射電子顯微鏡下觀察。在相同的放大倍數下，隨機選擇并觀察每組中的三個樣品。

五、大鼠肝組織AST、ALT、TNF-α、IL-6水平的檢測

無菌條件操作制作肝勻漿。ELISA測定組織液中AST、ALT、TNF-α、IL-6的水平。

六、大鼠肝臟中SIRT3、FXO1 mRNA水平的測定

RNATrizol Kit(Sangon Biotech，上海)從 50 mg肝臟組織樣品中分離總RNA。瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA的的完整性。并通過QuantiTect○R反轉錄試劑盒(QIAGEN GmbH; Hilden，Germany)產生cDNA。 cDNA的擴增通過QuaniNovaTMSYBR○RGreenPCR試劑盒(QIAGEN)在ABI 7 500上進行。將SIRT3、FXO1 mRNA的表達水平歸一化為GAPDH mRNA后，通過2-ΔΔCt法計算相對RNA表達。

七、SIRT3、FXO1蛋白水平測定

通過免疫組化法檢測SIRT3、FXO1在肝臟組織中的表達。在400放大倍數下，隨機選擇五個不同的顯微鏡視野。以高放大倍數觀察500個細胞。在至少五個視野中使用半定量方法對染色的組織切片進行評分。

八、大鼠肝臟中CASPASE-3、CASPASE-6、CASPASE-9蛋白水平測定ELISA法測定組織液中CASPASE-3、CASPASE-6、CASPASE-9的水平。

九、統計學方法

結 果

一、大黃素對肝細胞損傷指標的影響

與對照組比較，大黃素各劑量組脂肪變積分、炎癥壞死灶積分、氣球樣變積分、NAS 積分升高(P<0.05)；與模型組比較，大黃素各劑量組脂肪變積分、炎癥壞死灶積分、氣球樣變積分、NAS 積分降低，且隨著大黃素給藥劑量的增加，脂肪變積分、炎癥壞死灶積分、氣球樣變積分、NAS 積分逐漸降低，劑量-效應關系明顯(P<0.05)。見表1。

二、大黃素對大鼠肝組織炎癥指標的影響

與對照組比較，大黃素各劑量組AST、ALT、TNF-α、IL-6水平升高(P<0.05)；與模型組比較，大黃素各劑量組AST、ALT、TNF-α、IL-6水平降低，且隨著大黃素給藥劑量的增加，AST、ALT、TNF-α、IL-6水平逐漸降低，劑量-效應關系明顯(P<0.05)。見表2。

三、 大黃素對各組大鼠肝臟結構的影響

圖1可見，對照組肝臟細胞細胞完整，單層索狀排列圍繞中央靜脈放射狀分布，結構正常，染色清晰，核呈卵圓形位于中央膠，在肝臟細胞間質及血管周圍見少量亮綠色膠原纖維。模型組可見大量脂肪變性及壞死肝臟細胞，排列紊亂，且細胞脫失現象明顯，細胞核固縮，肝臟纖維化明顯，間質內大量炎性細胞浸潤，膠原纖維明顯增加。大黃素高劑量組幾乎無脂肪變性，見少量壞死肝臟細胞，綠色膠原纖維較模型組而言明顯減少；大黃素中、低劑量組較模型組而言，壞死肝臟細胞減少，仍可見脂肪變性，但綠色膠原纖維依然明顯存在，具有明顯的劑量依賴效應。

四、大黃素對大鼠肝臟組織SIRT3、FXO1 mRNA及其蛋白表達水平的影響

與對照組比較，大黃素各劑量肝臟組織SIRT3、FXO1 mRNA表達水平降低(P<0.05)；與模型組比較，大黃素各劑量肝臟組織SIRT3、FXO1 mRNA表達水平升高，且隨著大黃素組給藥劑量的增加，肝臟組織SIRT3、FXO1 mRNA表達水平逐漸升高，劑量-效應關系明顯(P<0.05)。

與對照組比較，大黃素各劑量肝臟組織SIRT3、FXO1 蛋白表達水平降低(P<0.05)；與模型組比較，大黃素各劑量肝臟組織SIRT3、FXO1 蛋白表達水平升高，且隨著大黃素組給藥劑量的增加，肝臟組織SIRT3、FXO1 蛋白表達水平逐漸升高，劑量-效應關系明顯(P<0.05)。免疫組化結果顯示，SIRT3、FXO1陽性表達為棕褐色，各組SIRT3、FXO1陽性表達情況與各蛋白表達水平符合。見表3，圖2、3。

表1 大黃素對肝細胞損傷指標的影響(分，±s)

表2 大黃素對大鼠肝組織炎癥指標的影響(±s)

圖1 大黃素對各組大鼠肝臟細胞結構的影響(HE. 400) A: 對照組;B: 模型組;C-E: 大黃素組低、中、高劑量組

六、大黃素對各組大鼠肝臟組織凋亡因子水平的影響

與對照組比較，大黃素各劑量肝臟組織CASPASE-3、CASPASE-6、CASPASE-9表達水平升高(P<0.05)；與模型組比較，大黃素各劑量肝臟組織CASPASE-3、CASPASE-6、CASPASE-9表達水平降低，且隨著大黃素組給藥劑量的增加，肝臟組織CASPASE-3、CASPASE-6、CASPASE-9表達水平逐漸降低，劑量-效應關系明顯(P<0.05)。見表4。

討 論

大黃是傳統中草藥，廣泛用于治療胰腺炎、膽囊炎、急性腹腔綜合征和其他炎癥性疾病[4]。大黃素是大黃的一種蒽醌元素(樹脂6-甲基-1,3,8-三羥基蒽醌)，具有抗炎、抗氧化作用。研究發現，大黃素可改善大鼠腸系膜微循環障礙，能降低炎癥因子的表達，保護重癥急性胰腺炎的腸功能，其機制可能是通過抑制NF-κB活化和黏附分子的表達[5-6]。本研究結果顯示，與模型組比較，大黃素各劑量組脂肪變積分、炎癥壞死灶積分、氣球樣變積分、NAS 積分、AST、ALT、TNF-α、IL-6水平降低。病理結果顯示，大黃素高劑量組幾乎無脂肪變性，見少量壞死肝臟細胞，綠色膠原纖維較模型組明顯減少；大黃素中、低劑量組與模型組比較，壞死肝臟細胞減少，仍可見脂肪變性，但綠色膠原纖維依然明顯存在，具有明顯的劑量依賴效應。說明大黃素能降低肝臟細胞炎性反應進而減輕NASH大鼠肝細胞損傷程度。

表3 大黃素對各組大鼠肝臟組織SIRT3、FXO1 mRNA及其蛋白表達水平的影響(±s)

圖2 大黃素對各組大鼠肝臟組織SIRT3蛋白表達水平的影響(免疫組化，400) A: 對照組;B: 模型組;C-E: 大黃素組低、中、高劑量組

圖3 大黃素對各組大鼠肝臟組織FXO1蛋白表達水平的影響(免疫組化，400) A: 對照組;B: 模型組;C-E: 大黃素組低、中、高劑量組

組別鼠數CASPASE-3CASPASE-6CASPASE-9對照組20139.46±5.57145.77±6.4647.13±15.95模型組20179.75±7.37267.86±6.98187.66±9.47大黃素組 10 mg/kg20169.35±8.88239.45±6.98134.14±12.74 20 mg/kg20146.31±12.76180.15±10.6963.23±10.73 40 mg/kg20142.81±9.60 119.63±12.7357.45±8.76

SIRT3是哺乳動物sirtuin蛋白家族的成員，是酵母Sir2蛋白的同源物，具有NADP依賴的脫乙酰酶活性，可通過組蛋白和非組蛋白的乙酰化調節各種蛋白質的功能。FOXO1通過胰島素信號傳導調節糖異生和糖原分解，是一種起重要作用的轉錄因子，其決定前脂肪細胞致力于脂肪形成。FOXO1的活性受乙酰化和磷酸化雙轉化后的修飾方式調節。 FOXO1與DNA的結合能力通過乙酰化/去乙酰化調節。研究表明，人二倍體成纖維細胞中FOXO1的乙酰化水平受SIRT3調節，使FOXO1脫乙酰化，增加活性，并刺激抗氧化基因如過氧化氫酶和SOD的表達，進而減少超氧陰離子自由基、ROS水平。SIRT3也可以直接脫去乙酰型SOD并增強其活性。SIRT3/FOXO1/SOD信號通路在增強氧化應激耐受和減少氧化應激損傷中起重要作用。大黃素可以調節sirtuins家族成員的表達[7-8]。此外，大黃素可通過核因子k基因結合、線粒體融合蛋白二、氧化應激、高遷移率族蛋白-等信號通路發揮肝臟保護作用。而氧化應激是NASH發生和發展的關鍵因素[9-10]。本研究結果顯示，與模型組比較，大黃素各劑量組SIRT3、FXO1 mRNA、蛋白表達水平升高，且隨著大黃素劑量的增加，肝臟組織SIRT3、FXO1 mRNA、蛋白表達水平逐漸升高，劑量-效應關系明顯。與上述結論符合，同時也提示，大黃素能促進SIRT3、FXO1mRNA、蛋白的表達降低肝臟細胞炎性反應，進而減輕NASH大鼠肝細胞損傷程度。本研究同時發現，大黃素能降低凋亡因子CASPASE-3、CASPASE-6、CASPASE-9的表達；而CASPASE-3、CASPASE-6、CASPASE-9也是FXO1調控下的細胞因子。說明大黃素可能降低肝細胞凋亡進而減輕NASH對肝細胞的損傷。

綜上所述，大黃素能促進SIRT3、FXO1 mRNA、蛋白的表達降低肝臟細胞炎性反應，減少肝細胞凋亡進而減輕NASH大鼠肝細胞損傷程度。