環狀RNA PTENP1、HIPK3聯合高爾基體蛋白73對AFP陰性肝癌的診斷價值

吳光輝 李偉

肝細胞癌(HCC)是肝癌最主要的類型，病死率高[1]。目前，HCC的診斷主要依賴影像技術與甲胎蛋白(AFP)[2-5]。但30%～40%患者血清AFP 仍處于正常水平(<25 μg/L)，這類HCC也被稱為AFP陰性肝細胞癌(AFP-NHCC)[6]。AFP-NHCC的臨床診斷主要依賴于影像學檢查。然而，由于AFP-NHCC的瘤體通常較小，影像學檢查易漏診。近年研究發現，環狀RNA (circRNA)與高爾基體蛋白73(GP73)可通過多種途徑參與HCC發生、發展。本研究對300例AFP-NHCC患者、300例肝良性病變患者和300例健康對照血清circRNA PTENP1、circRNA HIPK3和GP73表達水平進行檢測，旨在為AFP-NHCC的鑒別診斷提供新思路。

資料與方法

一、研究對象

選取2013年1月至2018年1月在我院經穿刺活檢或術中病理切片確診的AFP-NHCC患者300例為病例組，與同期我院經影像學聯合病理確診的肝良性病變患者300例為良性病變組(肝硬化100例，肝血管瘤100例，肝囊腫100例)，300例于我院行常規體檢的健康人群為健康對照組。排除已接受放、化療治療及有其他惡性腫瘤病史者。對研究對象的年齡、性別、BMI、吸煙史、飲酒史等進行采集。所有納入對象均簽署知情同意書。

二、血清circRNAs和GP73水平檢測

抽取研究對象外周血并分離血清。采用RT-PCR法檢測血清circRNAs表達水平，引物序列見表1。血清總RNA的提取按照血液RNA提取試劑盒(中國Bioteke公司)說明書步驟進行。使用去除基因組逆轉錄試劑盒(中國Takara公司)逆轉錄RNA為cDNA。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。血清GP73檢測采用酶聯免疫吸附法，檢測試劑盒由武漢默沙克生物科技有限公司提供。

三、統計學分析

結 果

一、三組研究對象的基本臨床信息

如表2所示，三組研究對象在年齡、性別組成、BMI、吸煙史、飲酒史等方面的差異均無統計學意義(P>0.05)。

二、三組間血清circRNA PTENP1、circRNA HIPK3和GP73水平

如表3所示，相比于良性病變組與健康對照組，AFP-NHCC患者血清circRNA PTENP1水平降低，而circRNA HIPK3、GP73水平均顯著增高，差異具有統計學意義(P<0.05)，而肝良性病變組與健康對照組三者差異均無統計學意義(P>0.05)。

表1 引物序列

表2 三組研究對象的基本信息

表3 三組研究對象的血清circRNA PTENP1、circRNA HIPK3和GP73水平

與良性病變組比較，aP<0.05；與健康對照組比較，bP<0.05

三、ROC分析

血清circRNA PTENP1、circRNA HIPK3和GP73區分AFP-NHCC和非AFP-NHCC(包括健康人群和肝良性病變人群)的AUC分別為：0.916(95%CI：0.842～0.991，P<0.001)、0.781(95%CI：0.704～0.893，P<0.001)和0.827(95%CI：0.761～0.913，P<0.001)，對應的靈敏度/特異度分別為：78.9%/96.6%、69.3%/80.5%和70.3%/91.5%。聯合血清circRNA PTENP1、circRNA HIPK3、GP73區分AFP-NHCC和非AFP-NHCC(包括健康人群和肝良性病變人群)的AUC為0.947(95%CI：0.853 ～ 0.997，P<0.001)，靈敏度為91.7%，特異度為92.8%。聯合檢測時，鑒別AFP-NHCC的靈敏度顯著提高。

四、風險評估

單因素和多因素(校正年齡、性別、BMI、吸煙史、飲酒史等因素后)分析顯示，血清低circRNA PTENP1與高circRNA HIPK3、GP73水平是AFP-NHCC發病的獨立危險因素(P<0.05)，見表4。

討 論

circRNA是長鏈非編碼RNAs的一種，與線性RNAs不同，它是共價閉合環路。circRNA具有種類豐富、進化保守、在細胞質中相對穩定的特性。近年來研究發現，circRNAs突變或異常表達與腫瘤的發生、發展密切相關，具有作為腫瘤分子標志物的潛能。前期研究發現，circRNA HIPK3參與腫瘤化療耐藥、T細胞白血病和胃癌等的生物調控[7]；而circRNA PTENP1則是有望成為肝癌臨床診療的生物學標志物[8]，但目前鮮有關于該兩項指標與AFP-NHCC的報道。在本次研究中，我們檢測了AFP-NHCC患者與肝臟良性疾病和健康對照血清circRNA PTENP1與circRNA HIPK3水平，發現二者在AFP-NHCC患者與非AFP-NHCC人群中均存在差異性表達，且在鑒別診斷AFP-NHCC中具有較高價值。進一步的分析發現，二者在AFP-NHCC的發病風險評估中也具有潛在意義。GP73主要在膽管上皮細胞表達，正常人肝細胞中表達量極微。在發生肝細胞癌變時，GP73表達會明顯上調，且GP73 水平與肝癌組織分化程度相關[9]。前期研究發現，GP73在肝癌患者體內水平顯著高于健康人群，具有作為肝癌早期標志物的潛能[10]，但目前尚無相關研究對GP73與AFP-NHCC進行探究。本研究中發現，GP73在AFP-NHCC患者體內水平顯著增高，進一步分析證實，GP73對AFP-NHCC具有較高的診斷和發病風險評估價值。隨后，我們分析了血清circRNA PTENP1、circRNA HIPK3、GP73三項指標對AFP-NHCC的聯合診斷價值，發現聯合三項指標可顯著提高診斷靈敏度，優于單項指標的檢測價值。本研究結果與前期研究一致[7-10]，提示血清circRNA PTENP1、circRNA HIPK3、GP73三項指標不僅在肝癌中具有應用價值，對AFP-NHCC的診斷亦具有重要意義。

本研究有以下幾點不足：(1)納入的全部對象均源于我院，難免會造成選擇偏倚并在一定程度上影響結果準確性；(2)納入的研究對象例數有限，今后需要更大人群的隊列研究證實；(3)未對circRNA PTENP1、circRNA HIPK3、GP73參與AFP-NHCC發生、發展的機制進行探討，未來可設計相應的細胞與動物實驗進行深入研究。

表4 血清circRNA PTENP1、circRNA HIPK3、GP73對AFP-NHCC的發病風險預測