不同連作方式馬鈴薯土壤中3種酚酸測(cè)定方法研究

熊 湖，鄭順林，，黃 強(qiáng)，龔 靜，梁衍鈴 ，袁繼超

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西南作物生理生態(tài)與耕作重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部薯類作物遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/成都久森農(nóng)業(yè)科技有限公司，四川 成都 610500）

【研究意義】隨著2015年馬鈴薯主食化戰(zhàn)略的提出，馬鈴薯在我國(guó)的種植面積不斷增長(zhǎng)［1］，與其他糧食作物相比，馬鈴薯更加耐寒、耐旱、耐瘠薄、適應(yīng)性廣［2］。然而，受限于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)具有復(fù)種指數(shù)高、作物種類單一的特點(diǎn)，馬鈴薯連作現(xiàn)象普遍，長(zhǎng)期連作導(dǎo)致其即使在正常栽培管理下也會(huì)出現(xiàn)品性退化、品質(zhì)下降、產(chǎn)量降低等情況，即連作障礙［3］。連作障礙的形成是由植物-土壤系統(tǒng)多種因素綜合作用的結(jié)果［4］，其中由于化感物質(zhì)引起的化感現(xiàn)象是引起連作障礙的重要原因，酚酸類物質(zhì)是已經(jīng)被證實(shí)的眾多化感物質(zhì)之一［5］。酚酸常用的測(cè)定方法有酶法、分光光度法、氣相色譜法、離子色譜法、高效液相色譜法及毛細(xì)管電泳法，其中高效液相色譜法是目前較精確、較常用的儀器分析法，而色譜條件直接影響了高效液相色譜法的測(cè)定效果，測(cè)定不同有機(jī)酸其條件也有很大差異［6］?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】江和源等［7］建立了利用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定茶葉中5種酚酸類化合物的方法，并認(rèn)為使用不同提取液制備樣品，測(cè)定結(jié)果差異較大；運(yùn)用反相高效液相色譜法可以同時(shí)測(cè)定馬鈴薯塊莖中的4種酚酸，但流動(dòng)相對(duì)測(cè)定效果有很大影響［8］；吳丹等［9］利用高效液相色譜法測(cè)定了太子參根際土壤中的酚酸，發(fā)現(xiàn)種植太子參后土壤中的酚酸類自毒物質(zhì)含量升高。香草酸、對(duì)羥基苯甲酸、阿魏酸是與馬鈴薯連作障礙的關(guān)系密切的酚酸類化合物［10-11］，分別澆灌這3種酚酸的溶液及其混合液，對(duì)馬鈴薯植株的株高、莖粗、地上分莖數(shù)、匍匐莖數(shù)、根長(zhǎng)和生物量均有顯著抑制作用［12］，因此如何快速修復(fù)連作障礙的最根本條件是降低土壤中自毒物質(zhì)的數(shù)量和活性。目前，輪作換茬是當(dāng)前防治連作障礙最經(jīng)濟(jì)、最有效、應(yīng)用最廣的方法，而在不同栽培方法下土壤理化性質(zhì)會(huì)發(fā)生相應(yīng)改變，酚酸類物質(zhì)的含量與種類也會(huì)有所不同，多年連作的西洋參輪作后發(fā)現(xiàn)總酚含量顯著下降，與未種植過(guò)西洋參的土地接近，并且病害減少［13］；楊樹(shù)人工輪作與連作土壤中酚酸有很大差異，輪作中酚酸降解菌總豐度都有增加［14］。【本研究切入點(diǎn)】對(duì)色譜條件中測(cè)定波長(zhǎng)、流動(dòng)相體系、柱溫等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，考察以上條件對(duì)分離測(cè)定效果的影響，并對(duì)馬鈴薯進(jìn)行3種方式連作（普通連作、玉薯輪作、強(qiáng)化連作）試驗(yàn)，采用優(yōu)化后的色譜條件，通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定土壤的酚酸含量。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】建立一種快速、準(zhǔn)確利用高效液相色譜法測(cè)定土壤中3種酚酸的方法，并分析不同連作方式對(duì)馬鈴薯土壤中3種酚酸的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

儀器：安捷倫-1200高效液相色譜儀、高純水制備儀、臺(tái)式pH計(jì)、超聲波震蕩儀、高速離心機(jī)。

試劑：酚酸標(biāo)準(zhǔn)品為Sigma公司生產(chǎn)的香草酸、對(duì)羥基苯甲酸、阿魏酸。乙腈、甲醇、冰醋酸為色譜級(jí)，液相色譜采用的水為超純水，鹽酸、氫氧化鈉為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)于2014—2017年在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田進(jìn)行，設(shè)馬鈴薯連作、馬鈴薯/玉米輪作、馬鈴薯強(qiáng)化連作3個(gè)處理，以保持土壤未栽培狀態(tài)作對(duì)照（CK），供試馬鈴薯品種為川芋117（表1）。

表1 試驗(yàn)處理Table 1 Experimental treatment

1.2.2 土樣采集 于馬鈴薯連續(xù)種植第4年（2017年）春季的前期、花期、塊莖膨大期、成熟期共4個(gè)時(shí)期分別采集土樣，采用抖土法收集各處理馬鈴薯根際土壤，室內(nèi)風(fēng)干后過(guò)0.425 mm篩，用塑封袋裝后于4℃保存待用。

1.2.3 土壤酚酸提取 土壤酚酸的提取參考田給林等［15］的方法并有所改動(dòng)。分別稱取各處理土樣10 g置于離心管中，加入1 mol/L NaOH溶液各20 mL，超聲震30 min后靜置24 h，于210 r/min搖床上震蕩30 min，8 000 g離心力下離心20 min，分離上清液后用12 mol/L鹽酸調(diào)整溶液pH至2.5沉淀出胡敏酸，超聲震蕩10 min后靜置2 h，8 000 g離心力下離心10 min，分離上清液4℃保存待分析。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 準(zhǔn)確稱取香草酸、對(duì)羥基苯甲酸、阿魏酸各20.0 mg分別置于3個(gè)100 mL容量瓶中，并準(zhǔn)確稱取香草酸、對(duì)羥基苯甲酸、阿魏酸各20.0 mg置于同一容量瓶中，滴加幾滴甲醇溶解后用超純水定容至刻度線，作為單一標(biāo)樣以及混合標(biāo)樣的母液，于4℃中保存，使用時(shí)稀釋100倍作為工作液。所有樣品進(jìn)樣前經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾。

1.3.2 色譜條件 分離柱采用安捷倫XDB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），檢測(cè)波長(zhǎng)為λ=280 nm，柱溫為35℃，進(jìn)樣量為20 μL，采用A、B雙泵系統(tǒng)，其中流動(dòng)相組分A為乙腈，B為用色譜純的冰醋酸調(diào)節(jié)pH 2.60的高純水，體積比為A∶B=25∶75，雙泵體積流量SI=0.8 mL/min，調(diào)整兩泵的流速來(lái)分離3種酚酸。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel、Origin數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 測(cè)定波長(zhǎng) 在確定色譜柱的前提下，液相色譜的條件主要有流速和柱溫、紫外檢測(cè)波長(zhǎng)、流動(dòng)相的選擇，測(cè)定酚酸的最佳波長(zhǎng)有260、280、320 nm［8］，結(jié)合測(cè)定目標(biāo)，為保證測(cè)定的靈敏度，將280 nm設(shè)為本試驗(yàn)紫外檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.1.2 流動(dòng)相 甲醇-醋酸與乙腈-醋酸都是常用的流動(dòng)相體系，而乙腈吸光度小、柱壓低，測(cè)試后選擇乙腈-醋酸水溶液作流動(dòng)相。酚酸為酸性物質(zhì)，因此，醋酸水溶液pH對(duì)峰型和保留時(shí)間影響較大。經(jīng)測(cè)試，當(dāng)醋酸水溶液pH=2.60時(shí)，峰型較好、無(wú)拖尾現(xiàn)象；而隨著乙腈在流動(dòng)相中所占體積比的增大，各酚酸的保留時(shí)間縮短、分離度隨之下降，經(jīng)測(cè)試乙腈∶醋酸水溶液=20∶80、25∶75、30∶70、35∶75、40∶60的效果，同時(shí)綜合分離效果與分離時(shí)間，選擇乙腈∶醋酸水溶液=25∶75。

2.1.3 柱溫 色譜柱溫度能影響其柱效、分離選擇性、檢測(cè)靈敏度和穩(wěn)定性。一般來(lái)說(shuō)，提高柱溫可以縮短各酚酸的保留時(shí)間，因此分離度也會(huì)下降，但柱溫過(guò)高會(huì)影響色譜柱本身。由圖1可知，當(dāng)其他色譜條件確定時(shí)，柱溫分別為25、30、35℃的測(cè)定效果表明，柱溫為35℃時(shí)測(cè)定時(shí)間短且保證了分離度。

圖1 3種酚酸混合標(biāo)準(zhǔn)樣品的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of standard sample of mixture of 3 phenolic acids

2.2 色譜條件的分析考察

2.2.1 線性關(guān)系 將制備的不同濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品按照2.1條件依次進(jìn)樣，計(jì)算回歸方程與相關(guān)系數(shù)，并以3倍信噪比確定檢出限，結(jié)果（表2）表明在該條件下，各酚酸的紫外吸收值與濃度間的線性關(guān)系良好。

2.2.2 重現(xiàn)性 將3種酚酸的混合樣品按照上述建立的液相色譜條件進(jìn)行重復(fù)進(jìn)樣6次，比較色譜峰相對(duì)保留時(shí)間，結(jié)果見(jiàn)表3，表3表明在該條件下5次平行試驗(yàn)中各酚酸保留時(shí)間變化較小，具有良好的穩(wěn)定性，其RSD值在0.05%～0.18%。

表2 3種酚酸組分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和檢出限Table 2 Regression equations, correlation coefficients, linear ranges and detection limits of 3 phenolic acids

表3 3種酚酸的保留時(shí)間和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Retention time and relative standard deviation of 3 phenolic acids

2.2.3 回收率 將混合標(biāo)準(zhǔn)樣品稀釋10倍后，與待測(cè)土壤提取液等體積混合，按照上述條件進(jìn)樣，重復(fù)6次，測(cè)定回收率，結(jié)果見(jiàn)表4，在本試驗(yàn)條件下各酚酸回收率較高，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于2%，能達(dá)到定量分析要求。

表4 3種酚酸的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 4 Recovery rate and relative standard deviation of 3 phenolic acids

2.3 不同連作方式對(duì)土壤酚酸含量的影響

不同連作方式條件下成熟期馬鈴薯土壤酚酸含量的色譜圖見(jiàn)圖2，對(duì)不同連作方式中同類酚酸進(jìn)行多重比較分析結(jié)果見(jiàn)表5。結(jié)果表明，3種酚酸均能在不同連作方式和對(duì)照土壤中檢測(cè)出，但是含量與變化都有所差異。在馬鈴薯整個(gè)生育期，未栽培（CK）、輪作、普通連作土壤中3種酚酸含量整體上均表現(xiàn)為先增后減，而強(qiáng)化連作土壤3種酚酸含量一直呈下降趨勢(shì)，但均在花期達(dá)到最大值；成熟期與前期相較，未栽培（CK）土壤中對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、阿魏酸變化分別為3.28%、-7.83%、-6.27%，3種酚酸前后變化較小且差異不顯著，輪作土壤分別下降19.65%、17.98%、39.88%，普通連作土壤分別下降5.36%、16.85%、16.31%，強(qiáng)化連作土壤分別下降45.13%、59.52%、49.15%。3種種植方法中的3種酚酸整體均呈下降且達(dá)到顯著差異，說(shuō)明馬鈴薯在整個(gè)生育期中對(duì)土壤酚酸含量產(chǎn)生了影響，且不同栽培方式對(duì)不同種類的酚酸影響不同。在前期，強(qiáng)化連作土壤3種酚酸均高于其他處理且差異顯著，這3種酚酸含量分別比其他連作方式高出48.26%～56.17%、71.26%～149.60%、29.64%～58.90%，其中玉薯輪作均為最低；至成熟期時(shí)，玉薯輪作土壤中3種酚酸含量均為最低，未栽培（CK）土壤的3種酚酸含量均為最高。

3 討論

3.1 HPLC同時(shí)測(cè)定馬鈴薯土壤中3種酚酸的方法

圖2 成熟期不同連作方式與對(duì)照土壤提取液中酚酸色譜圖Fig. 2 Chromatogram of phenolic acids in soil extracts from different continuous cropping patterns and CK at mature stage

表5 不同連作方式下各生育期土壤酚酸含量（μg/g）Table 5 Content of soil phenolic acids in different growth stages under different continuous cropping patterns

利用高效液相色譜法測(cè)定酚酸類自毒化感物質(zhì)是目前運(yùn)用最廣泛、最便捷的方法之一［16］。在使用高效液相色譜法測(cè)定時(shí)，色譜條件直接影響測(cè)定結(jié)果，測(cè)定不同化合物所需的溶劑各不相同，主要與目標(biāo)化合物的溶解性與解離度相關(guān)，測(cè)定酚酸常用的有機(jī)溶劑有甲醇、乙腈、石油醚等［17］，流動(dòng)體系對(duì)分離度的影響較大，通過(guò)調(diào)整有機(jī)相與水相的比例可以有效分離多種酚酸，改變柱溫可以影響出峰時(shí)間，對(duì)分離度也有一定影響。本研究在前人基礎(chǔ)上，同時(shí)對(duì)色譜溶劑、流動(dòng)體系、柱溫和波長(zhǎng)進(jìn)行了試驗(yàn)，篩選出能夠快速分離測(cè)定馬鈴薯土壤中3種酚酸（對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、阿魏酸）含量的方法，且該方法重復(fù)性高、精確度較好、檢出限低，各酚酸均有顯著的線性關(guān)系。

3.2 不同種植方式對(duì)馬鈴薯土壤中3種酚酸含量的影響

改變種植制度、合理更換栽培方式被認(rèn)為是有效克服連作障礙的方法之一。符建國(guó)等［18］通過(guò)分離與鑒定煙田根際土壤酸性有機(jī)組分，發(fā)現(xiàn)輪作與連作土壤中的酸性成分發(fā)生了種類與數(shù)量上的變化，說(shuō)明更改種植制度可以有效影響土壤中酚酸成分的組成。本試驗(yàn)中，各個(gè)時(shí)期的土壤中均能檢測(cè)出對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、阿魏酸。馬鈴薯屬于塊莖類作物，在前期主要為地上部分生長(zhǎng)發(fā)育，而后期則相反，這可能是土壤酚酸出現(xiàn)先增后減的原因，整體來(lái)看，各種植方式中3種酚酸含量均逐漸下降，且隨著生育期推進(jìn)與未栽培土壤（CK）差異逐漸不顯著，這與葉發(fā)茂等［19］研究結(jié)果相似。植株殘?bào)w會(huì)產(chǎn)生自毒物質(zhì)［20］，作物殘?bào)w的腐解與降解［21］會(huì)導(dǎo)致土壤中酚酸積累，強(qiáng)化連作距離上一茬較近，導(dǎo)致在前期強(qiáng)化連作3種酚酸含量均為最高；而玉薯輪作豐富了作物與土壤交換模式，改善了土壤理化環(huán)境，使得馬鈴薯不需要分泌自毒物質(zhì)來(lái)抑制其他植物生長(zhǎng)發(fā)育［22］，并且馬鈴薯與玉米對(duì)土壤養(yǎng)分需求有一定差異［23］，這可能導(dǎo)致玉薯輪作中前期與成熟期3種酚酸含量均為最低，證明玉薯輪作可以減少土壤中3種酚酸含量，但土壤中的酚酸并不是單一作用的，不同酚酸之間存在協(xié)同作用和拮抗作用，對(duì)作物的影響程度也有一定差異［24］，不能僅以含量來(lái)評(píng)估其對(duì)連作障礙的影響，因此酚酸對(duì)連作障礙的作用機(jī)理還有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

在安捷倫XDB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），檢測(cè)波長(zhǎng)為λ=280 nm，柱溫為35℃，進(jìn)樣量20 μL，采用等度洗脫，流動(dòng)相為75%A液（以冰醋酸調(diào)節(jié)pH=2.60）∶25%B液（乙腈），雙泵體積流量SI=0.8 mL/min的色譜條件下，能夠準(zhǔn)確、快速地同時(shí)測(cè)定土壤中香草酸、對(duì)羥基苯甲酸、阿魏酸等3種酚酸。測(cè)定結(jié)果顯示，空白對(duì)照土壤中3種酚酸在前后差異較小，3種酚酸在不同連作方式下成熟期均低于前期，其中玉薯輪作土壤中3種酚酸均為最低，表明通過(guò)玉薯輪作可以降低土壤中酚酸含量，緩解連作障礙。