神經(jīng)營養(yǎng)因子-3促進神經(jīng)干細胞定向分化的實驗研究

李 凱 李會會 徐婉茹 朱 彤 吳曉燕 韓 凌 陳 剛

1)菏澤市立醫(yī)院,山東 菏澤274000 2)蘇州大學第二附屬醫(yī)院,江蘇 蘇州215000

新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxie-ischemiceneephalopathy,HIE)在臨床工作中十分常見,發(fā)病率呈逐年升高趨勢,其發(fā)生、發(fā)展與圍產(chǎn)期窒息有密切關系,是新生兒神經(jīng)系統(tǒng)疾病的主要病因[1-2]。病理改變主要是腦水腫、腦細胞壞死,以及神經(jīng)膠質細胞增生,常伴有繼發(fā)性癲癇、智力遲鈍等各種嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥,重度HIE 是導致新生兒死亡的一個重要原因。特別需要關注的是HIE搶救成功后,是否存在后遺癥可能在短期內(nèi)不會有所表現(xiàn),而是在其成長的過程中逐漸表現(xiàn)出來(如運動和智力發(fā)育不能達到同齡兒應該達到的標準),導致患兒后期生活質量低下,嚴重損害患兒的生命健康,也給患兒家庭帶來極大的經(jīng)濟負擔及社會壓力[3-6]。臨床除了一些后期的營養(yǎng)神經(jīng)、康復治療無其他更好的治療方法。

目前,神經(jīng)干細胞(neural stem cells,NSCs)是研究的熱點。神經(jīng)干細胞是可多向分化呈各種類型的細胞的一類原始細胞[7-9],在一定環(huán)境下具有多向定向分化功能,如分化為神經(jīng)元細胞、少突膠質細胞(oligodendrocytes,OLs)、星形膠質細胞(astrocyte,AS)等,在一定程度上可以幫助修復損傷的神經(jīng)細胞,從而為NSCs移植治療相關疾病提供了科學依據(jù)[10]。研究發(fā)現(xiàn),NSCs的增殖分化很大程度上在生長的微環(huán)境上,即有刺激神經(jīng)干細胞分化所需要的物質,如神經(jīng)因子,而且在移植的最早期分化比例較低,難以對移植本體局部的病理改變產(chǎn)生作用；神經(jīng)營養(yǎng)因子是神經(jīng)營養(yǎng)蛋白家族的重要成員,起到很關鍵的作用,為一種小的堿性蛋白質,是一類對神經(jīng)元的發(fā)育、存活和凋亡起重要作用的蛋白質,其成員包括神經(jīng)生長因子(NGF)、腦源性生長因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子3(NT-3)、神經(jīng)營養(yǎng)因子4(NT-4)等,這些蛋白質是治療神經(jīng)損傷等疾病的潛在藥物標靶。其中神經(jīng)營養(yǎng)因子-3(NT-3)是比較特殊的一種,在特定環(huán)境下,可以促進NSCs存活并起到早期分化的信號,是神經(jīng)元分化及生長所必需的物質,NT-3聯(lián)合NSCs移植似乎可以解決[11-15]。本實驗主要方法是將神經(jīng)干細胞聯(lián)合神經(jīng)營養(yǎng)因子3一起注入到鼠損傷側大腦的側腦室內(nèi),比較有無變化,嘗試為臨床上神經(jīng)干細胞移植治療新生兒缺血缺氧性腦病及后續(xù)治療偏癱、脊髓截癱等神經(jīng)損傷性疾病找到依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及動物分組60只出生后7 d健康WISTAR 乳鼠隨機分為4 組:正常組:(n=15)；缺血缺氧模型組(n=15):結扎左側頸總動脈,缺氧2 h；NSCs移植組(n=15):NSCs移植；Nt-3聯(lián)合NSCs移植組(n=15):NT-3聯(lián)合NSCs移植。

1.2 NSCs的制備及其鑒定將出生24 h內(nèi)的乳鼠,75%酒精浸泡消毒,在顯微鏡下取出腦組織充分剪碎、吹打、離心；加入條件培養(yǎng)基DMEM/F12(Gibco,美國),bFGF(Protech,美國)20 ng/m L,EGF(Protech,美國)20 ng/m L約5 m L,置于37 ℃二氧化碳溫箱內(nèi)培養(yǎng),待獲得繁殖能力強的神經(jīng)干細胞球,選取并種植于24孔培養(yǎng)板,加入有10%胎牛血清貼壁2 h后固定,nestin免疫熒光染色。

1.3 模型制備缺血缺氧模型[4]的建立,異氟醚麻醉,仰臥并固定,消毒,顯微鏡下解剖,頸部正中切開,左側頸總動脈雙結扎,離斷,縫合切口。術后復蘇2 h后,將小鼠置于37℃恒溫密閉缺氧室。低氧室連續(xù)充入8%氧和92%氮的混合氣體2 h,然后將小鼠置于籠中保溫觀察1 h,返回母鼠籠繼續(xù)飼養(yǎng)。

1.4 平衡木試驗將大鼠置于橫桿開始處,測量其通過橫桿進入暗箱所需要的時間,即潛伏期并記錄后足滑脫次數(shù)。

1.5 NSCs及NT-3聯(lián)合移植異氟醚麻醉成功后,在顱骨矢狀縫左側1 mm、冠狀縫后方1 mm 處鉆孔,放置立體定向頭架,穿刺左側側腦室,使用微注射泵以0.5μL/min的速度將2μL 移植液(NSCs及NSC 與NT-3混合液)緩慢注入左側側側腦室。注射后,保留針頭2 min,然后取出。骨蠟封住骨膜,將頭皮縫合后送回母鼠籠喂養(yǎng)。

1.6 腦標本制備移植后出生1個月時,用水合氯醛注射到鼠腹膜內(nèi)麻醉,獲得滿意麻醉后,用剪刀剪開胸腔,見心臟搏動,一管從左心室進入主動脈弓,灌注,先用肝素化生理鹽水灌注,后以福爾馬林溶液灌注,至鼠四肢僵硬,眼球變白,灌注完畢。將鼠頭剝除顱骨取出腦組織,在穿刺點前0.5 mm、后2.5 mm取出腦組織,用福爾馬林液固定腦組織。

1.7 病理形態(tài)學免疫組化免疫組化GFAP膠質纖維酸性蛋白抗體(美國)、MBP髓磷脂堿性蛋白抗體(美國):切片,脫蠟至水；用蒸餾水沖洗,PBS 浸泡→高壓抗原修復,切片滴加H2O2,室溫30 ℃下甲醇封閉內(nèi)源性過氧化物酶；PBS液洗后滴加一抗,4 ℃過夜；滴加二抗,滴入辣根酶標記的鏈霉素,DAB顯色劑進行顯色,蘇木精復染,之后蒸餾水緩洗,使蘇木精“藍化”胞核呈藍色；酒精脫水,晾干,滴加中性樹膠加蓋玻片封片,待晾干備用。觀察切片腦室周圍腦組織病理變化情況,在相同亮度、計數(shù)高倍鏡下,每個觀察點各連續(xù)3個不重疊視野的GFAP、MBP陽性細胞數(shù),記錄數(shù)據(jù),并取平均值。

1.8 統(tǒng)計學處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計,計量資料采用均數(shù)±標準差表示,在符合方差齊性的條件下多組之間均數(shù)比較用單因素方差分析,P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 胎鼠大腦源性神經(jīng)干細胞的體外培養(yǎng)及鑒定在無菌環(huán)境中培養(yǎng)皮層組織,5～6 d后在培養(yǎng)基中觀察,可見球形細胞團,形成單細胞懸液后進行nestin免疫組化染色,結果表明,神經(jīng)球呈紅色熒光,陽性,證實為NSCs,消化成神經(jīng)干細胞單細胞懸液,繼續(xù)培養(yǎng)等待移植。

2.2 平衡木行為學評價8只小鼠造模未成功,其中6只死于麻醉,2只未出神經(jīng)損傷的跡象,造模未成功由多余模型成功鼠替代。正常組大鼠后肢活動自如,協(xié)調性好,能輕松通過橫桿。模型組大鼠通過橫桿時具有更多的探索性行為,猶豫不敢前進,后肢關節(jié)運動僵硬,協(xié)調能力差,后肢橫桿經(jīng)常脫落。與模型組相比,NSCs組和NT-3組后肢脫離次數(shù)減少,其中NT-3組恢復更加明顯。

2.3 病理學、免疫組化

2.3.1 GFAP 染色:腦組織GFAP 染色:正常組可見組織結構整齊,可見少量GFAP 陽性細胞。模型對照組GFAP陽性細胞較正常組增多,腦組織結構紊亂,囊腔部分被包圍,局部形成膠質結節(jié)。NSCs 移植組中大量GFAP 陽性細胞由腦室周圍向白質遷移,結構較模型組略有改善。NT-3聯(lián)合組仍可見相當數(shù)目的陽性細胞,并且細胞排列結構明顯改善。高倍鏡下更加明顯觀察細胞(紅色箭頭所指的為GFAP 陽性細胞,染色在胞漿呈棕黃色,核為藍色)。見表1、圖1。

2.3.2 MBP 染 色:腦 組 織MBP 染 色(4 周齡):正常組老鼠可見組織結構整齊,可見少量MBP陽性細胞。模型對照組,MBP 陽性細胞少見,細胞數(shù)目減少,并有空囊泡現(xiàn)象存在。NSCs組可見MBP 陽性細胞有所增多,結構較模型組稍改觀。NT-3組可見MBP陽性細胞明顯增多,細胞排列結構明顯改善。高倍鏡下更加明顯觀察細胞(紅色箭頭所指的為MBP陽性細胞,染色在胞漿呈棕黃或棕褐色,核為藍色)。見表1、圖2。

圖1 免疫組化GFAP(×400) A：正常組；B：模型組；C：NSCs移植組；D：NT-3移植組Figure 1 Immunohistochemical GFAP(×400) A：Normal group，B：Model group，C：NSCs transplantation group，D：NT-3 transplantation group

圖2 免疫組化MBP(×400) A：正常組；B：模型組；C：NSCs移植組；D：NT-3移植組Figure 2 Immunohistochemical MBP(×400) A：Normal group，B：Model group，C：NSCs transplantation group，D：NT-3 transplantation group

表1 GFAP、MBP染色各組陽性細胞數(shù)對比Table 1 Comparison of the number of positive cells in each GFAP,MBP staining group

表1 GFAP、MBP染色各組陽性細胞數(shù)對比Table 1 Comparison of the number of positive cells in each GFAP,MBP staining group

注:其他3組與正常組比較,a P＜0.05；NSCs組與HIBD 組比較,b P＞0.05；NT-3組與NSCs組比較,c P＜0.05；NSCs組與正常組比較,e P＜0.05；NSCs組與NT-3組比較,f P＜0.05；NT-3組與正常組比較,g P＞0.05

組別 n GFAP染色陽性細胞數(shù) MBP染色陽性細胞數(shù)正常組 15 4.42±0.75 14.83±2.44 HIBD 模型組 15 22.25±6.01 3.13±0.39 NSCs移植組 15 25.46±3.96 7.04±0.93 NT-3聯(lián)合組 1512.50±1.6612.87±1.19 P 1 ＜0.05a ＜0.05e P 2 0.794b ＜0.05 f P 3 0.013c 0.345g

3 討論

新生兒缺氧缺血性腦病(HIE)的病理學已證實其主要病變是OLs以及髓鞘的病變而引起的腦白質損傷[16-18]。大量少突神經(jīng)膠質細胞缺失的直接后果是腦室周圍白質軟化(periventricular leukomalacia,PVL),其特征分布的白質壞死,是腦室周圍白質彌漫性或局灶性軟化,提示PVL 是HIE 的重要病因[19-20],發(fā)病機制還不完全了解,因此很多實驗研究圍繞著腦白質損傷后改變,及相應的補充外來神經(jīng)干細胞來進行。本課題組在3 a來的研究中發(fā)現(xiàn),將神經(jīng)干細胞移植到7日齡鼠HIBD 模型側腦室內(nèi),神經(jīng)干細胞可以存活且可以觀察到遷移,移植后評估神經(jīng)行為恢復情況也有改變[21-24]；但針對HIE 病理改變是OLs減少,單純NSCs移植后不能定向分化,這是移植后結果并不理想的根本。本研究主要探討了神經(jīng)營養(yǎng)因子3對神經(jīng)干細胞在定向分化方面上起的作用[25-26],并對大鼠的神經(jīng)功能和形態(tài)學進行評價,為NSCs聯(lián)合移植治療HIE提供理論依據(jù)。

神經(jīng)元是神經(jīng)系統(tǒng)功能和結構的基本單位,是不可再生細胞,且是不可逆的,一般的神經(jīng)細胞壞死,就會有相應的癥狀,并且無法重新生長,故一旦神經(jīng)系統(tǒng)受損的話,尤其是重要神經(jīng)元壞死,機體就會出現(xiàn)嚴重的后果。通過標記OLs及星型膠質細胞后,可以看到小鼠遭受缺血缺氧環(huán)境后,少突膠質細胞前體是最容易受到損傷,繼而引起成熟OLs數(shù)量減少,髓鞘減少或合成延遲,膠質細胞反應性增生。缺氧缺血等多環(huán)境多機制(氧自由基、興奮性氨基酸)等最終導致腦室周圍白質的缺血缺氧損傷,形成PVL[27]。病理結果進一步證實了HIE的病理改變?yōu)镻VL,進一步說明神經(jīng)干細胞是缺血缺氧修復的靶細胞[28-30],與既往文獻描述一致。本研究結果中MBP免疫組化方面,MBP 陽性細胞數(shù)分別為(3.13±0.39)個、(7.04±0.93)個、(12.87±1.19)個,統(tǒng)計學分析顯示,NT-3組、NSCs組與模型組比較均有顯著性差異(P＜0.05),這也進一步說明NSCs側腦室移植能分化為OLs,NT-3能誘導神經(jīng)干細胞向OLs分化。

AS是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)多種膠質細胞中的一種[31],并且膠質細胞數(shù)目最多,是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最主要的大膠質細胞,具有復雜而又精細的結構和功能,具體對缺氧高度敏感,易出現(xiàn)細胞死亡,也可再生,但這種再生是細胞修復,是應激反應,形成疤痕組織,無法恢復到原來的狀態(tài)[32-33]。腦缺血缺氧后,產(chǎn)生氧化應激反應,興奮性毒性,線粒體損傷導致膠質細胞異常活躍,AS 反應性活化,所以對神經(jīng)元具有“雙刃劍”的作用[34-35]。一方面,神經(jīng)細胞損傷早期,AS 反應性增多,有利于瘢痕組織形成,為了保護機體應激性反應,大量AS促進NSCs及神經(jīng)前體的分化[36]。另一方面瘢痕組織形成后,神經(jīng)正常組織被瘢痕組織代替,永遠失去其功能,周圍細胞替代功能也不能實現(xiàn)。本課題中模型組GFAP陽性細胞明顯增多,而隨著神經(jīng)干細胞植入后,GFAP 陽性細胞與模型組相比稍增多,分別為(22.25±6.01)個、(25.46±3.96)個；考慮為NSCs分化為AS所致,但無顯著性差異。但NT-3組陽性細胞明顯減少,差異有統(tǒng)計學意義。考慮到NT-3促進了NSCs向OLs的分化,但畢竟移植入腦的神經(jīng)干細胞數(shù)量十分有限,因此轉化為星新膠質細胞的數(shù)量減少。NT-3聯(lián)合移植組在病理HE 染色后顯示的瘢痕減少、病灶軟化是一致的。本研究中行為能力項目中顯示,移植后的小鼠可有較好行為能力,也說明損傷細胞有部分功能代償,促進肢體恢復。

神經(jīng)營養(yǎng)因子聯(lián)合神經(jīng)干細胞移植帶來希望,改變NSCs的因子微環(huán)境對NSC 的激活有積極作用,給我們指明一個新的方向[37-43]。但目前只停留在動物實驗階段,臨床報道很少,希望有一天能作為腦移植的供體、載體用于臨床,將對小兒缺氧缺血性腦損傷這類疾病的治療具有重大意義。