慢性間歇性低氧對頦舌肌超微結(jié)構(gòu)及ROS的影響

劉文敏 宋揚(yáng) 尹國平

【摘 要】 目的：觀察慢性間歇性低氧（CIH）過程對頦舌肌超微結(jié)構(gòu)及ROS的影響。方法：選用20只健康成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為對照組和CIH組（n=10）。將CIH組大鼠置于低氧箱中，每天8小時，持續(xù)4周間歇性低氧。低氧結(jié)束，取出頦舌肌組織，電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變;冰凍切片免疫熒光方法檢測頦舌肌中活性氧（ROS）的水平。結(jié)果：電鏡觀察結(jié)果顯示，與對照組相比，CIH組肌原纖維結(jié)構(gòu)雜亂，部分肌絲溶解，肌原纖維間線粒體集中、大小不一、水腫，嵴斷裂、空泡變;冰凍切片免疫熒光染色顯示CIH組ROS數(shù)量較對照組顯著增多。結(jié)論：慢性間歇性低氧過程可破壞頦舌肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，并引起頦舌肌產(chǎn)生顯著的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

【關(guān)鍵詞】 慢性間歇性低氧;頦舌肌;細(xì)胞結(jié)構(gòu);氧化應(yīng)激

【中圖分類號】R821.4+2 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A【文章編號】1005-0019（2019）12-019-02

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（OSAHS）在全世界成人中發(fā)病率為2%-7%，其特征為反復(fù)發(fā)作呼吸暫停，嚴(yán)重打鼾和白天嗜睡[1]，導(dǎo)致慢性間歇性低氧（CIH）。研究表明，CIH可引起血中氧化應(yīng)激水平顯著升高[2]。間歇性低氧可使體內(nèi)產(chǎn)生過多的自由基和ROS，從而激活人體的氧化應(yīng)激狀態(tài)。ROS能抑制軟骨蛋白聚糖的合成，妨礙ATP的合成，進(jìn)而影響線粒體功能，造成細(xì)胞損傷，用于評估氧化應(yīng)激的發(fā)生[3]。

上呼吸道擴(kuò)張肌（主要是頦舌肌）的損害是OSAHS病因之一，可能與這種氧化應(yīng)激狀態(tài)有關(guān)。本研究探討了一種CIH模型對頦舌肌中ROS活性的影響及其超微結(jié)構(gòu)的改變。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組 20只健康雄性SD大鼠，8周齡，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0006。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分成對照組和CIH組（n=10）。CIH組每天行8h（9：00-17：00）間歇性低氧，連續(xù)4周，飼養(yǎng)同對照組。實(shí)驗(yàn)結(jié)束，麻醉大鼠并解剖頦舌肌組織用于檢驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)通過北京大學(xué)第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心倫理批準(zhǔn)。

1.2 動物模型制備 將CIH組大鼠放入低氧箱（MS-01，北京大學(xué)前沿交叉學(xué)科研究院）內(nèi)，循環(huán)充入氮?dú)夂脱鯕猓?0s充入氮?dú)猓?0s充入氧氣，每循環(huán)周期120s，確保每一循環(huán)箱內(nèi)氧濃度在10%-21%之間波動，低氧箱傳感器可自動檢測氧濃度。低氧箱內(nèi)每日實(shí)驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行紫外線照射30分鐘殺菌。

1.3 電鏡觀察頦舌肌超微結(jié)構(gòu) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，5%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，解剖游離頦舌肌組織，并切下1小塊（約1mm3），放入2.5%戊二醛磷酸緩沖液中固定，送北京大學(xué)第一醫(yī)院電鏡室常規(guī)制作標(biāo)本，電鏡觀察頦舌肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

1.4 頦舌肌組織標(biāo)本檢測 冰凍切片免疫熒光檢測ROS;檢測均按照試劑盒說明操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件建立數(shù)據(jù)文件并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，均數(shù)以（x±s）表示，計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，P<0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體重改變情況 對照組與CIH組低氧前：（315.6±3.6）g、（316.2±5.6）g，P>0.05;低氧后：（501.8±9.3）g、（498.6±14.1）g，P>0.05;低氧前后兩組大鼠體重?zé)o顯著差異。

2.2 頦舌肌組織的超微結(jié)構(gòu)變化 對照組肌原纖維結(jié)構(gòu)整齊排列，明暗帶清晰，線粒體形態(tài)規(guī)則，內(nèi)膜和外膜完整，嵴豐富。在CIH組中，肌原纖維結(jié)構(gòu)雜亂無序，部分肌絲可見溶解，明暗帶排列不清，肌束間的結(jié)締組織增生，肌原纖維間線粒體集中、大小不一，膜模糊不清，嵴斷裂、空泡變，數(shù)量明顯減少，見圖1。

2.3 頦舌肌組織免疫熒光結(jié)果顯示 DAPI染出來的細(xì)胞核在紫外的激發(fā)下為藍(lán)色，ROS陽性表達(dá)為相應(yīng)光素標(biāo)記的紅光，CIH組ROS數(shù)量明顯較對照組為多，見圖2。

3 討論

OSAHS患者在睡眠過程中存在反復(fù)的呼吸暫停和/或低通氣現(xiàn)象，這種類似于缺血-再灌注損傷的周期性低氧-復(fù)氧循環(huán)模式促使白細(xì)胞活化，導(dǎo)致超氧化物自由基生成增多[4]，氧化-抗氧化系統(tǒng)失衡，產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。而ROS的產(chǎn)生超過局部抗氧化能力時，又會加重氧化應(yīng)激，進(jìn)一步導(dǎo)致組織細(xì)胞受損。頦舌肌是引起上氣道開放的最大擴(kuò)張肌之一，它收縮時引起舌肌向前移動，使咽氣道開放，從而確保了肺部的有效通氣。電鏡結(jié)果顯示，CIH組頦舌肌肌原纖維結(jié)構(gòu)雜亂無序，線粒體水腫，嵴斷裂、空泡變。線粒體是細(xì)胞中最關(guān)鍵的細(xì)胞器，在維系正常細(xì)胞功能過程中發(fā)揮著重要作用。氧化應(yīng)激可致線粒體受損，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而影響頦舌肌收縮功能，致使睡眠過程中收縮力減弱，咽部氣道無法完全或不能打開，進(jìn)而引起低通氣甚至呼吸暫停，周而復(fù)始，逐漸加重OSAHS的嚴(yán)重程度。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)CIH組頦舌肌中ROS含量升高，且線粒體結(jié)構(gòu)不同程度受損，提示CIH后頦舌肌組織內(nèi)存在脂質(zhì)過氧化物損傷，進(jìn)一步證實(shí)了CIH可激活氧化應(yīng)激狀態(tài)。從臨床角度來看，OSAHS疾病可能破壞患者頦舌肌的肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并引起頦舌肌組織內(nèi)部產(chǎn)生顯著的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

參考文獻(xiàn)

[1] Punjabi NM.The Epidemiology of Adult Obstructive Sleep Apnea. Proceedings of the American Thoracic Society，2008，5（2）：136-143.

[2] Zhao YN，Wang HY，Li JM，etal.Hippocampal mitogen-activated protein kinase activation is associated with intermittent hypoxia in a rat model of obstructive sleep apnea syndrome[J].Molecular Medicine Reports，2016，13（1）：137-145.

[3] Helen G，Griffiths R，Lennart，et al. Biomarkers. Molecular Aspects of Medicine， 2002.23（1-3）：101-208.

[4] 何權(quán)瀛，陳寶元，張希龍.解讀“睡眠呼吸暫停與心血管疾病專家共識”[J].中國實(shí)用內(nèi)科雜志，2010，30（02）：116-121.