白花蛇舌草提取物對卵巢癌模型大鼠的療效及對其血清性激素水平的影響*

常豐葛，張 珂，馬玉瑤，孫靈霞 ，葛倩倩

1.河南省許昌市人民醫(yī)院婦科(許昌 461000)；2.鄭州大學第五附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科(鄭州 450007)

卵巢癌位于婦科惡性腫瘤死亡率第1位，對女性的生命健康有著極大的威脅[1]。目前在卵巢癌的治療中，主要以手術(shù)治療和化療為主，但是隨著治療時間的逐漸延長，更多的毒副作用也會慢慢顯現(xiàn)出來，機體產(chǎn)生耐藥性的問題也日益突出。相關(guān)報道指出，中醫(yī)藥不僅能夠提高卵巢癌患者的免疫力，還能夠使患者放化療過后的毒副作用減輕，在延長患者壽命、提高患者生活質(zhì)量上起著至關(guān)重要的作用[2-3]。白花蛇舌草屬于中藥范疇，具有消癰散結(jié)、清熱解毒和利濕通淋等功效，而且其化學成分中的黃酮類物質(zhì)還能夠?qū)δ[瘤的發(fā)展產(chǎn)生抑制效果[4]。本文采用白花蛇舌草提取物對卵巢癌大鼠進行干預，旨在探究白花蛇舌草提取物對卵巢癌的作用效果。

材料與方法

1 材 料

1.1 研究對象：選取30只由中國科學院動物中心提供的健康SD大鼠，均為雌性，年齡3～6個月，平均(3.8±1.5)個月，體重200～250g，平均(220±7.9)g。所有大鼠均養(yǎng)殖在干凈籠子里，放置在室溫(22.3±1.7)℃，相對濕度30%～35%的環(huán)境中，每天光照12 h，喂飲大鼠純凈水。飼養(yǎng)時間為1周。本文研究所做實驗均獲得我院倫理委員會批準。

1.2 主要藥物與試劑：白花蛇舌草提取物(購于西安明澤生物科技有限公司)；NUTU-19卵巢癌細胞(武漢博士德生物工程有限公司)；兔抗大鼠p38抗體(天根生化科技有限公司)；小鼠抗大鼠NF-kBp65抗體(上海國藥集團化學試劑有限公司)；化學發(fā)光全自動免疫分析儀及其配套試劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；ELISA試劑盒(武漢默沙克生物科技有限公司)染色劑、PBS緩沖液(均購于武漢博士德生物工程有限公司)。

2 研究方法

2.1 模型建造及分組處理：將30只大鼠隨機分為模型組、實驗組和空白組，每組各10只。空白組大鼠建模期間不做任何處理；另外兩組的20只大鼠均向其右腋下注射NUTU-19卵巢癌細胞0.5 ml，規(guī)格為2×102細胞/ml，且注射卵巢癌細胞均處于對數(shù)生長期增殖能力最強的細胞，癌細胞濃度越高，建模成功率就越高。因為癌細胞與大鼠機體癌細胞相互接觸聚集形成細胞團，當細胞團濃度達到1×106細胞/ml時便為造模成功。當模型組和實驗組大鼠體重減輕、毛發(fā)干枯、活動能力下降，并且當右下腋窩處腫瘤大小成長到0.4×0.4 cm2時，建模完成。實驗組大鼠在建模成功后對其注射白花蛇舌草提取物，1次1 ml/kg，1次/d，連續(xù)注射14 d；模型組和空白組大鼠在每天同一時間均給予等體積的生理鹽水，連續(xù)注射14 d，14 d后對三組大鼠情況進行觀察。

2.2 樣本采集：將三組大鼠采用端頭法處死，取其卵巢組織和卵巢癌組織，為了防止細胞自溶，放入濃度為10%的福爾馬林中固定處理24 h，使組織細胞中的蛋白凝固變性。將固定好的卵巢組織和卵巢癌組織用不同梯度的酒精進行脫水處理，去除組織塊中的水分，然后再將組織放入二甲苯中進行透明處理。將透明處理過的組織放入融化的石蠟中浸蠟，然后將已經(jīng)浸透好石蠟的組織塊夾取放入包埋盒中，使其冷卻凝固。將包埋好的組織蠟塊放到切片機上固定，之后進行切片，厚度為5～8 μm，放入40℃的水中展開，然后貼在載玻片上，最后用烘烤箱以60℃的溫度烘烤1 h。

2.3 染色處理：對三組大鼠切片樣本進行HE染色處理，使用二甲苯進行常規(guī)脫蠟處理兩次，每次5 min，然后在梯度酒精下水花處理3 min，自來水沖洗1次；使用蘇木素染色5 min，自來水沖洗1次；使用濃度為1%的鹽酸酒精分化處理30 s，在0.2%氨水中反藍處理2 min，自來水沖洗1次；在濃度0.5%伊紅染色10 min，自來水沖洗1次；使用乙醇梯度進行脫水處理，最后用中性樹膠進行封片，使用光學顯微鏡進行圖像分析。

2.4 腫瘤相關(guān)指標的測定:對大鼠腫瘤重量平均值、腹水量平均值、腫瘤體積以及抑瘤率進行統(tǒng)計。抑瘤率的計算在大鼠腫瘤剝離稱重后，采用抑瘤率計算公式對其進行計算。抑瘤率的計算公式為抑瘤率=(模型組腫瘤重量-實驗組腫瘤重量)/模型組腫瘤重量×100%。

2.5 化學發(fā)光法檢測雌二醇(Estradiol，E2)、孕酮(Progesterone ，P)和促黃體生成素(Luteinizing hormone，LH)：待測標本加入化學發(fā)光物質(zhì)，與催化劑發(fā)生催化反應，與氧化劑發(fā)生氧化反應，形成處于激發(fā)狀態(tài)的之間體，當中間體達到穩(wěn)定時，會發(fā)射出光子，嚴格按照化學發(fā)光分析儀操作步驟，利用發(fā)光信號測量儀測量光子數(shù)值，對比分析E2、P和LH水平。

2.6 Western blot檢測p38、NF-κBp65蛋白相對表達：將采集到的標本，使用PBS緩沖液清洗3遍以上，分離緩沖液，加入IP細胞裂解液，進行裂解35 min，提取總蛋白，BCA測定蛋白濃度。取20 μg/孔蛋白質(zhì)，通過10%的SDS-PAGE凝膠進行電泳，加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白緩沖液15 min；100 V,電泳10 min，結(jié)束之后，將電轉(zhuǎn)膜浸泡在10%的牛奶中，在37℃環(huán)境下的搖床上封閉1.5 h；與一抗結(jié)合，加入TBST稀釋按1:1000稀釋一抗Tubulin(內(nèi)參照)，在4℃的環(huán)境下孵育過夜保存；第2天用TBST緩沖液清洗，與二抗結(jié)合在室溫下孵育1 h，再次用TBST緩沖液反復清洗。最后加入顯影劑將其僅在底物溶液中進行顯色，嚴格按照顯影定影試劑盒操作說明書進行操作，采用目的蛋白條帶分析灰度值，目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值=目的蛋白相對表達量。

2.7 酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF-α)和白介素-2(Interleukin-2，IL-2)水平：將待測的標本和酶標物嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作步驟與和固相載體產(chǎn)生反應作用，將固相載體反應的復合物經(jīng)過洗滌與其他物質(zhì)分離，加入酶反應底物，經(jīng)過酶的催化作用形成有色物質(zhì)，根據(jù)顏色的深淺進行定性或定量分析TNF-α和IL-2的水平。

結(jié) 果

1 三組大鼠病理組織學觀察 如圖1所示，為三組大鼠經(jīng)HE染色后顯微鏡下病理組織圖像。圖像中可見模型組大鼠腫瘤細胞呈實片狀排列，細胞核異型性較大，間質(zhì)可見腫瘤性纖維組織增生，病理核分裂相易見，局部呈現(xiàn)片狀壞死，能夠見到瘤巨細胞，在其周圍可見炎癥細胞浸潤。實驗組大鼠病理圖像中纖維間質(zhì)減少，且纖維間質(zhì)內(nèi)能夠見到出血狀況，局部可見腫瘤細胞核碎屑，片狀腫瘤性壞死，能夠看到巨噬細胞。由此可以看出白花蛇舌草提取物對卵巢癌細胞的生長具有抑制作用。

2 三組大鼠腫瘤常規(guī)指標比較 如表1所示，實驗組大鼠的腫瘤重量平均值、腹水量平均值以及腫瘤體積均顯著低于模型組大鼠(P<0.05)，且實驗組大鼠的抑瘤率明顯高于模型組大鼠，組間比較具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

組 別n腫瘤重量平均值(mg)腹水量平均值(V/ml)腫瘤體積(mm3)抑瘤率(%)空白組10—12.42±0.22——模型組1016.43±0.9282.30±4.1015.36±3.6423.92±2.78實驗組109.32±0.8730.25±2.0810.86±2.5143.27±3.63t/F值26.6453.704.8320.07P值<0.05<0.05<0.05<0.05

3 三組大鼠性激素水平比較 如表2所示，實驗組大鼠性激素E2、P表達水平明顯低于模型組大鼠，LH表達水平明顯高于模型組大鼠，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

4 各指標變化 通過對納入動物的造模、用藥等處理，我們對各組大鼠進行相關(guān)指標的觀察。通過實驗觀察發(fā)現(xiàn)，中藥白花蛇舌草的提取物通過下調(diào)p38、NF-kBp65使炎癥指標TNF-α和IL-2水平下降，從而抑制卵巢癌細胞的增長。正如表3所示，實驗組大鼠p38、NF-kBp65相對蛋白表達量比模型組均顯著降低，組內(nèi)比較具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。同時實驗組大鼠TNF-α和IL-2水平比模型組大鼠也明顯下調(diào)，組間比較具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。上述指標的變化說明白花蛇舌草提取物通過調(diào)控p38/NF-kBp65通路使炎癥指標降低，從而抑制了實驗小鼠腫瘤的發(fā)展，由此可見白花蛇草對腫瘤的作用機理具有一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

表2 三組大鼠性激素E2、P和LH水平比較

表3 三組大鼠p38、NF-kBp65相對表達及TNF-α和IL-2水平比較

討 論

卵巢癌屬于中醫(yī)的“腸蕈”、“癥瘕”、“積聚”等范疇，瘕者，聚散無常，瘕聚成形，推之可移，痛無定處；癥者，固定不移，有形可征，痛有定處。瘕屬氣病，癥屬血病，中醫(yī)藥古籍當中對卵巢癌的發(fā)病機制探究也非常常見[5-6]。相關(guān)古籍指出，卵巢癌的發(fā)生可能是由于風寒濕熱之邪內(nèi)侵、機體正氣不足導致，或者是因為房事、情志因素所傷，導致飲食失宜，最終造成肺腑功能失常[7]。日而久之，病人正氣持續(xù)削弱，氣血痰濕相互影響，至單純的血瘀、氣滯或痰濕。在卵巢癌的臨床治療中，中醫(yī)以攻毒、祛邪、扶正培本為主，明辨虛實也是治療該病最重要的原則，在疾病初發(fā)時期，宜攻宜破；當病人久病不愈或者術(shù)后時期，則以補益氣血為主，使機體正氣得到恢復，如若正氣已復仍有血塊未除，則需反復攻破[8-9]。

白花蛇舌草屬于傳統(tǒng)中藥范疇，是治療癌癥最常用的藥物之一[10]。白花蛇舌草主要生長在我國南方各省潮濕的草地上、田邊以及河溝旁，是茜草科耳草屬1年生草本植物，中醫(yī)認為白花蛇舌草性寒，味微苦、甘，歸大腸、胃、肝經(jīng)，具有消癰散結(jié)、清熱解毒和利濕通淋等功效。已有實驗和研究表明白花蛇舌草能夠在不同組織起源的腫瘤治療中發(fā)揮其有效性[11]。通過對白花蛇舌草的生物活性和化學成分進行研究，發(fā)現(xiàn)白花蛇草中主要包括蒽醌類、黃酮類、有機酸類、香豆精類、多糖類以及生物堿類等[12]。現(xiàn)代藥理學指出白花蛇舌草能夠抗菌抗炎、抗化學誘變、抗氧化和抗腫瘤等，而白花蛇舌草中抗腫瘤的主要有效成分是生物黃酮，能夠?qū)δ[瘤細胞的凋亡和DNA合成起抑制作用[13]。白花蛇舌草提取物是一種由白花蛇舌草中的活性成分制成的滅菌水溶液，每毫升的白花蛇舌草提取物中就會含總黃酮25 mg，已有研究證明，白花蛇舌草注射液能對原發(fā)性肝癌、食道癌以及生殖系統(tǒng)腫瘤產(chǎn)生治療效果[14]。

卵巢所產(chǎn)生的甾體類激素以及之間的協(xié)調(diào)關(guān)系能夠?qū)ε陨诚到y(tǒng)腫瘤發(fā)生及病變產(chǎn)生誘導作用，臨床中一些卵巢癌患者常常伴有內(nèi)分泌失調(diào)的癥狀，所以很多研究認為導致內(nèi)分泌異常的原因是由于卵巢腫瘤對細胞的合成以及激素轉(zhuǎn)換產(chǎn)生較大的抑制作用，間接性地增強了卵巢腫瘤間質(zhì)細胞的內(nèi)分泌功能[15-16]。而且機體卵巢組織在發(fā)生腫瘤病變會使性激素分泌異常，再加上復雜的胚胎組織學結(jié)構(gòu)，導致腫瘤的產(chǎn)生具有多樣性，同時還會分泌出其它的激素[17-18]。在本文研究中，對卵巢癌模型大鼠組織中的性激素指標E2、P和LH進行檢測發(fā)現(xiàn)，卵巢癌模型大鼠在患病后體內(nèi)的E2、P和LH表達水平發(fā)生異常變化，E2、P水平相比正常大鼠明顯升高，LH表達水平明顯下降，說明卵巢發(fā)生病變后使患病機體的內(nèi)分泌功能紊亂，導致性激素水平的異常表達。而在對卵巢癌大鼠使用白花蛇舌草提取物進行干預后，患病大鼠體內(nèi)的性激素水平明顯改善，說明白花蛇舌草提取物能夠改善卵巢癌大鼠因惡性病變導致的內(nèi)分泌功能紊亂狀態(tài)，調(diào)節(jié)體內(nèi)的激素分泌水平，控制腫瘤的繼續(xù)惡化發(fā)展。

癌癥常被認為是慢性炎癥誘導的結(jié)構(gòu)，而且卵巢癌還具有慢性炎癥疾病的相似特征。有相關(guān)研究指出，TNF-α和IL-2在卵巢癌患病機體中均呈高表達，能夠促進腫瘤血管的形成，對腫瘤的轉(zhuǎn)移產(chǎn)生作用。卵巢癌的浸潤及轉(zhuǎn)移是一個復雜的、多步驟的、多個相關(guān)基因共同參與的過程[19]。p38/NF-kBp65信號通路能夠在腫瘤的形成中起到關(guān)鍵作用，p38/NF-kBp65信號通路中具有能夠調(diào)節(jié)腫瘤細胞代謝、增殖、凋亡以及細胞周期進程的p38、NF-kBp65兩種核心蛋白，能夠?qū)毎松L周期進行調(diào)控，從而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和生長[20]。NF-kB還能夠通過調(diào)節(jié)炎性細胞因子、黏附因子以及趨化因子的表達，在炎癥反應中發(fā)揮重要作用[21-23]。我們在設計實驗中，使用Western-blot法對不同干預下卵巢癌大鼠p38、NF-kBp65的表達進行檢測，并采用酶聯(lián)免疫吸附測定法對TNF-α和IL-2水平進行檢測，可以發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草提取物干預后的卵巢癌大鼠p38、NF-kBp65表達下調(diào)，TNF-α和IL-2水平也隨之下降，說明白花蛇舌草提取物能夠調(diào)控p38/NF-kBp65信號通路，降低炎癥指標的水平，從而對大鼠卵巢癌的發(fā)展產(chǎn)生抑制作用。

綜上所述，白花蛇舌草提取物能夠改善卵巢癌大鼠的性激素水平，通過對p38/NF-kBp65信號通路來使機體內(nèi)的炎癥指標下降，從而抑制腫瘤的發(fā)展，為臨床中卵巢癌的治療和預后提供理論依據(jù)。