青白通痹方藥半仿生提取工藝條件優選研究*

李 凡，王衛鋒，張小麗，張軍茹 ，任得志 ，李 芳△

1.陜西省中醫藥研究院(西安 710003)；2.陜西省中醫醫院(西安 710003)

青白通痹方由青風藤、白芍和炙甘草組成，為陜西省中醫醫院米烈漢名老中醫和學科帶頭人胡筱娟主任醫師的臨床經驗方，具有消腫通痹止痛，舒筋活絡之功效。臨床上主治風濕、類風濕、痛風、骨關節病等所致的關節腫脹、僵硬、疼痛、屈伸不利。目前該方已被開發成院內制劑，效果顯著。為了進一步發揮青白通痹方的臨床功效，對其進行深入研究，我們擬采用半仿生提取(Semi-bionic extraction,SBE)、半仿生-生物酶法提取(Semi-bionic-enzyme extractio,SBEE)、醇提取(Alcohol extraction,AE)三種提取法對其藥效物質進行提取研究，并與原水提取工藝進行對比實驗，從而確定青白通痹方藥效物質的最佳提取工藝及參數。半仿生提取法通過模擬藥物在胃腸道中的作用過程，充分發揮混合物成分的綜合作用特點，并且有利于以單體成分來控制提取物質量，同時也符合藥物在體內代謝、發揮藥效的過程。尤其是對于作用物質基礎不明確而又療效確切的藥物，半仿生提取法更能確切反應藥物真正的藥效物質基礎。本文參考相關文獻[1-7]，對青白通痹方藥用SBE的工藝條件進行優選，為進一步的研究奠定基礎。

材料與方法

1 材 料

1.1 儀器：Waters Acquity H-CLASS型超高效液相色譜儀(UPLC)(EmpowerTM3色譜工作站、PDA檢測器)；ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7μm)；電子分析天平(型號：BT25S，d=0.01 mg；BS210S，d=0.1 mg，北京賽多利斯天平有限公司)、DELIS超聲波清洗機(深圳市潔盟清洗設備有限公司)、四孔水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)、WS70-1型紅外快速干燥箱(上海市吳淞五金廠制造)、101型電熱鼓風干燥箱(北京市永光明醫療儀器廠)、HCTP11B10托盤藥物天平(北京市宣武區天平廠)。SartoriusPB-10型精密pH計(賽多利斯科學儀器北京有限公司)、TGL18型臺式高速冷凍離心機(長沙英泰儀器有限公司)、U-2910 型紫外可見分光光度計(HITACHI)、血清超濾器(上海德宏生物醫學科技發展有限公司)。

1.2 試藥：青風藤為防己科植物和毛青藤 Sinomenium acutum(Thunb.)Rehd.et Wils.var.cinereum Rehd.et Wils .的干燥藤莖；白芍為毛莨科植物芍藥Paeonia lactiflora PalL.的干燥根；炙甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的根及根莖的炮制加工品，以上藥材經陜西省中醫藥研究院王衛鋒主任藥師鑒定后應用于本實驗。青藤堿對照品(批號：110774-200507)，芍藥苷對照品(批號：110736-201539)，甘草次酸對照品(批號：110723-201514)，以上對照品均購自中國藥品生物制品檢定院。液相用甲醇、乙腈試劑均為HPLC級(瑞典歐普森)；其它試劑均為AR級(天津市富宇精細化工有限公司)。

2 研究方法

2.1 實驗設計 本次實驗是在飲片規格、煎煮溫度、用水量、濾過、濃縮等基本提取條件相同的情況下進行，對第一煎水pH(A)、第二煎水pH(B)、第三煎水pH(C)和煎煮時間h(D)4個主要因素各3個水平進行考察，因素及水平見表1。按表2 L9(34)表安排實驗。

表1 因素與水平

表2 L9(34)實驗設計表

注：D因素括號內數字依次為第1,2,3次的提取時間。

2.2 樣品溶液的制備 將清風藤、白芍和炙甘草分別粉碎，過篩(10～20目之間)，按處方比例稱取三者粗粉80 g并混合均勻，按表2中所列的實驗參數，常壓下加熱回流提取3次(第1次加水量為10倍、第2次加水量8倍、第3次加水量8倍)，用4層紗布加100目藥篩過濾實驗的提取液，合并3次提取的濾液，分別定容至2000 ml，即得青白痛痹方藥半仿生提取的正交實驗樣品液。

2.3 供試溶液的制備

2.3.1 供試液A的制備：分別精密吸取2.2項下青白痛痹方藥半仿生提取的正交實驗樣品液各100 ml，離心(3500 r/min，20 min)，取上清液各10 ml，加甲醇定容至25 ml，用0.22 μm微孔濾膜濾過，即得供試液A1-9，用于測定青藤堿和芍藥苷的含量。

2.3.2 供試液B的制備：分別精密吸取2.2項下青白痛痹方藥半仿生提取的正交實驗樣品溶液各100 ml，參考文獻甘草次酸供試液制備方法[8]，最后用甲醇轉移至10 ml量瓶中并定容，再用0.22 μm的微孔濾膜濾過，得到的溶液為正交實驗供試液B1-9。用于測定甘草次酸的含量。

2.3.3 供試液C的制備：精密吸取2.2項下青白痛痹方藥半仿生提取的正交實驗樣品溶液各15 ml，蒸至近干，加入硅藻土1 g拌勻，烘干，研勻后轉移至錐形瓶中，加甲醇25 ml，稱重，超聲提取(250W，40K Hz) 30 min，放冷，補足減失的重量，濾除硅藻土，即得供試液C1-9。用于測定總生物堿含量。

2.3.4 供試液D的制備：取2.2項下青白痛痹方藥半仿生提取的正交實驗樣品溶液各500 ml，離心，先經過0.45 μm微孔濾膜過濾，再經由中空纖維膜(截留量為1000Da)濾過，過濾至500 ml容量瓶并用蒸餾水定容至刻度，得到供試液D1-9。用于測定分子量≤1000Da的提取物。

2.4 青藤堿的含量測定[9-11]

2.4.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7μm)；流動相：乙腈-0.1%磷酸(10：90)；檢測波長：262 nm；柱溫室溫；流速：0.3 ml/min；進樣量4.0μl。

2.4.2 對照品溶液的制備：取青藤堿對照品，精密稱定(5.21 mg)，置10 ml容量瓶中，用70%的乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得青藤堿對照品溶液(0.521 mg/ml)，置于4℃冰箱中保存。

2.4.3 青藤堿線性關系考察：取2.4.2項下青藤堿對照品溶液 (0.521 mg/ml)，分別自動進樣0.4 μl、0.8 μl、1.0 μl、2.0 μl、4.0 μl及8.0 μl，測定色譜峰面積。以青藤堿對照品溶液的進樣量為橫坐標，以色譜峰面積為縱坐標，即得到標準曲線。其回歸方程為：Y=1719463.26x-52291.966，R=0.9999。結果表明，在進樣量為0.2084～4.1680 μg范圍內，青藤堿線性關系良好。

2.4.4 精密度試驗：取2.4.2項下青藤堿對照品溶液 (0.521 mg/ml)，色譜條件同2.4.1項下，分別連續進樣6次，記錄色譜峰面積及計算RSD。結果表明，儀器精密度良好(RSD=0.99%)。

2.4.5 穩定性試驗：精密吸取2.3.1項下的供試品溶液A1，按2.4.1項下色譜條件分別于0、2、4、6、8、10 h重復進樣6次，青藤堿色譜峰面積的RSD=1.05%，表明供試品溶液在10 h內穩定性良好。

2.4.6 重復性試驗：按2.3.1項下方法平行制備正交1號樣品的供試液，共6份，按2.4.1項下色譜條件進樣，記錄色譜峰面積及計算RSD。結果表明，青藤堿平均含量=9.33 mg/g，RSD=0.99%，表明重復性良好。

2.4.7 加樣回收試驗：精密吸2.3.1項下正交1號樣品上清液5 ml(含青藤堿9.33 mg/g)6份，分別加入青藤堿對照品溶液 (0.8360 mg/ml)2.2 ml、2.2 ml、2.2 ml、2.2 ml、2.2 ml、2.2 ml，按照2.3.1項下的方法制備供試品液，按照2.4.1項下的條件進行含量測定，計算加樣回收率。青藤堿平均加樣回收率為97.89%，RSD=1.52%。

2.4.8 青藤堿的含量測定：取2.3.1項下供試品溶液A1-9，進行進樣分析，色譜條件同2.4.1項下，測定供試品溶液中青藤堿的含量，結果見表3。

2.5 芍藥苷的含量測定[12-14]

2.5.1 色譜條件：色譜柱：ACQUITY C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7μm)；流動相：乙腈-0.1%磷酸(12：88)；檢測波長：230 nm；柱溫為室溫；流速：0.3 ml/min；進樣量2.0μl。

2.5.2 對照品溶液的制備：取芍藥苷對照品，精密稱取1.55 mg，加甲醇溶解于25 ml量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.062 mg/ml芍藥苷對照品溶液。

2.5.3 芍藥苷線性關系考察：按2.5.1項的色譜條件，取2.5.2項下濃度為0.062 mg/ml的芍藥苷對照品溶液分別進樣0.5 μl、1.0 μl、2.0 μl、4.0 μl、6.0 μl、8.0 μl。以芍藥苷的進樣量為橫坐標，以色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。芍藥苷的回歸方程為：Y=3343254.57x+7878.94，R=1.0。結果表明，芍藥苷在0.0310～0.4960μg范圍內線性關系良好。

2.5.4 精密度試驗：取2.5.2項下濃度為0.062 mg/ml的芍藥苷對照品溶液，按2.5.1項下色譜條件連續進樣6次，記錄色譜峰面積及計算RSD。結果表明，RSD=0.89%，表明所用實驗儀器精密度良好。

2.5.5 穩定性試驗：精密吸取2.3.1項下供試品溶液A1，按2.5.1項下色譜條件分別于0、2、4、6、8、10 h進樣，記錄色譜峰面積及計算RSD。結果表明，RSD=1.48%，供試品溶液在10 h內穩定性良好。

2.5.6 重復性試驗：按2.3.1項下供試液A的制備方法制備正交1號樣品的供試液，平行6份，按2.5.1項下色譜條件，記錄色譜峰面積及計算RSD。結果表明，芍藥苷平均含量=7.25 mg/g，RSD=1.03%，表明重復性良好。

2.5.7 加樣回收試驗：精密吸取已知含量(含芍藥苷7.25 mg/g)的正交1號樣品上清液5 ml，共6份，分別加入濃度為1.4520 mg/ml的芍藥對照品溶液1 ml、1 ml、1 ml、1 ml、1 ml、1 ml，按2.3.1項下方法制備供試液，按2.5.1項下液相色譜條件依法測定含量并計算加樣回收率。芍藥苷平均加樣回收率為97.35%，RSD=1.06%。

2.5.8 芍藥苷的含量測定：取2.3.1項下供試品溶液A1-9，按2.5.1項色譜條件進樣分析，測定并計算芍藥苷的含量，見表3。

2.6 甘草次酸的含量測定

2.6.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7μm)；流動相：乙腈-0.05%磷酸(80：20)；檢測波長：250 nm；柱溫設為室溫；流速：0.3 ml/min；進樣量2.0μl。

2.6.2 對照品溶液的制備：取甘草次酸對照品，精密稱取10.28 mg，加甲醇使溶解于50 ml量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.2056 mg/ml的甘草次酸對照品溶液，置于4℃冰箱中保存。

2.6.3 甘草次酸線性關系考察：在2.6.1項的色譜條件下，取2.6.2項下濃度為0.2056 mg/ml的甘草酸對照品溶液，分別進樣0.4 μl、0.8 μl、1.0 μl、2.0 μl、4.0 μl、8.0 μl，測定色譜峰面積。以甘草次酸的進樣量為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。甘草次酸回歸方程為：Y=7332322.3x-108956.6，R=0.9999。結果表明，甘草次酸在0.0822～1.6448μg范圍內線性關系良好。

2.6.4 精密度試驗：取2.6.2項下濃度為0.2056 mg/ml的甘草次酸對照品溶液，連續進樣6次，色譜條件同2.6.1項下。記錄色譜峰面積及計算RSD。結果表明，RSD=0.83%，儀器精密度良好。

2.6.5 穩定性試驗：精密吸取2.3.2項下甘草次酸供試品溶液B1，按2.6.1項下色譜條件分別于0、2、4、6、8、10 h進樣，記錄色譜峰面積及計算RSD。結果表明，RSD=1.40%，表明用于甘草次酸含量測定的供試品溶液在10 h內穩定性良好。

2.6.6 重復性試驗：按2.3.2項下甘草次酸供試液的制備方法，制備正交1號樣品供試液，平行6份，進樣并記錄色譜峰面積及計算RSD，色譜條件同2.6.1項下，結果表明，甘草次酸平均含量=0.7047 mg/g，RSD=1.18%，表明重復性良好。

2.6.7 加樣回收試驗：精密吸2.2項下正交1號樣品液50 ml(含甘草次酸0.7047 mg/g)6份，分別加入甘草次酸對照品溶液 (1.4220 mg/ml)1 ml、1 ml、1 ml、1 ml、1 ml、1 ml，按2.3.2項下方法制備供試液，按2.6.1項下液相色譜條件依法測定含量并計算加樣回收率。結果為甘草次酸平均加樣回收率96.17%，RSD=1.45%。

2.6.8 甘草次酸的含量測定：取2.3.2項下供試品溶液B1-9，在2.4.1項色譜條件下進樣分析，測定甘草次酸的含量，結果見表3。

2.7 分子量≤1000Da提取物的測定 取2.3.4項下供試液D1-9各100 ml，置蒸發皿中，水浴蒸至近干，于烘箱中105℃烘至恒重，計算分子量≤1000Da提取物的得率。結果見表3。

2.8 總生物堿的含量測定

2.8.1 青藤堿對照品溶液的制備：精密稱取青藤堿對照品5.25 mg，置10 ml量瓶中，加PH7.0的緩沖溶液溶解稀釋至刻度，搖勻，得青藤堿對照液 (0.5250 mg/ml)。

2.8.2 標準曲線的繪制：精密量取青藤堿對照品溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5 ml，分別置干燥具塞試管中，加PH7.0的緩沖液稀釋至2.0 ml。加入0.007%溴麝香草酚藍8.0 ml，搖勻，加入三氯甲烷10.0 ml，振搖，靜置2 min至分層。分取三氯甲烷層，用干燥濾紙濾過，相應試劑為空白，在413 nm波長處測定，以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，回歸方程：Y=0.083X+0.1577，r=0.9991，線性范圍為：2.10～7.875 μg/ml。

2.8.3 總生物堿的含量測定：精密量取2.3.3項下供試液C1-9各0.5 ml，按2.8.2 標準曲線的繪制項下方法，測定吸光度，計算總生物堿的量，結果見表3。

2.9 干浸膏量的測定 量取2.2項下樣品液各50 ml，置蒸發皿中，水浴蒸至近干，置于105℃烘干至恒重，稱量并計算干浸膏量。見表3。

2.10 多指標綜合評判優選SBE法工藝條件 青白痛痹方藥的半仿生提取工藝條件優選的評價指標選取青藤堿、芍藥苷、甘草次酸、分子量≤1000Da提取物、總生物堿和干浸膏量。這6個指標的原始數據參考文獻[15]進行標準化處理，并根據6個指標在工藝優選方法中的主次地位，給予加權后求和確定綜合評價指標Y值。本次實驗的Y=(芍藥苷+青藤堿+甘草次酸)/3×7+(總生物堿+干浸膏+分子量≤1000Da提取物)/3×3，結果見表3。

表3 各指標成分含量及標準化處理結果

注：表中各成分量單位中的“g”是已經折算到方中中藥的質量；括號內的數值已經經過了標準化處理

根據上述實驗中收集到的實驗數據，進行正交實驗分析。從表4的試驗結果直觀分析來看，實驗設計中的影響因素主次為D>A>C>B。進一步對收據到的數據進行方差分析，由表5的方差分析結果來看，影響因素A、C、D均有統計學的差異，根據上述情況來確定提取工藝條件為A1B2C3D3。即青白痛痹方藥用SBE法提取的工藝條件為：3煎用水的pH依次為2.0、7.0、9.0；本試驗對藥物的提取時間依次為2.0 h、1.5 h、1.5 h。

2.11 工藝驗證實驗:嚴格按照實驗操作方法取中藥飲片粗粉，并按照上述處方比例對藥物進行稱取，稱量80 g，平行3份，依照優選出的工藝條件進行提取并制備出樣品溶液以及對各評價指標進行測定，平行3份。從實驗得到的數據結果來看，工藝驗證實驗提取液的綜合評價值是接近于其預測值的，具體的數據情況見表6。

表4 正交實驗結果

表5 方差分析

討 論

青白痛痹方臨床上主治風濕、類風濕、痛風、骨關節病等所致的關節腫脹、僵硬、疼痛、屈伸不利。青風藤中青藤堿具有抗炎、鎮痛、免疫抑制的藥理活性；白芍中含有的活性成分芍藥苷，具有抗自由基損傷，抑制細胞內鈣超載和抗神經毒性等活性，體內實驗證明其有降低血液黏度、抗血小板聚集、擴張血管、改善微循環、抗氧化等多種生物學效應；甘草中甘草次酸具有抗炎及增強免疫、抗氧化、抑菌、腎上腺皮質激素樣作用等藥理作用，這些與該方的功能與主治相一致，故選擇這三個單體成分為提取工藝的評價指標。

表6 3批驗證性試驗結果

注:括號內為標準化處理后數值。

中藥中，已知單體活性化合物絕大多數為小分子物質，故本次提取工藝評價引入分子量≤1000Da的提取物這個評價指標，能體現中藥整體、綜合、客觀、模糊的特點。本實驗的工藝評價采用了多指標綜合評判，為了消除各指標的單位和量綱的不同，以及各指標變量范圍相差懸殊所造成的影響，對原始實驗數據進行了標準化處理，并根據各指標在工藝選擇中的主次地位，給予不同的加權系數，這樣，優選出的SBE法工藝條件更科學、合理。本次實驗優選出的青白通痹方藥的半仿生提取的工藝條件為3次提取用水的pH值依次為2.0、7.0、9.0；提取時間依次為2.0 h、1.50 h、1.50 h。后續我們在此基礎上再優選青白通痹方藥半仿生-生物酶法提取(SBEE)、青白通痹方藥醇提取(AE)的工藝條件，以期對青白通痹方藥藥效物質的提取進行系統研究。