農家凍菜亞硝酸鹽含量變化規律的研究

賈慶超，游新俠

（鄭州科技學院食品科學與工程學院，河南 鄭州 450064）

蔬菜可提供人類生命所需的多種維生素、纖維素和微量礦物質[1]等。同時蔬菜又是容易富集硝酸鹽的植物，人體攝入的硝酸鹽81.2%以上來自蔬菜[2]。雖然硝酸鹽本身對人體危害不大，但在微生物（硝酸還原酶）的作用下可還原為亞硝酸鹽[3]。亞硝酸鹽是氧化性毒物[4]，過多的亞硝酸鹽被吸進人體后，將正常的血紅蛋白氧化成高鐵血紅蛋白，血紅蛋白內的鐵由Fe2+變成Fe3+，失去攜氧能力，還會阻止正常氧合血紅蛋白放出氧，導致組織缺氧[5]，另一方面亞硝酸鹽對人體的危害還在于它在特定條件下（環境酸堿度、微生物菌群和適宜的溫度）可能轉化為亞硝胺。亞硝胺是一種強致癌物質[6]，從而誘發消化系統癌癥的發生[7]。但我國目前對肉類制品中亞硝酸鹽含量問題較為重視，而蔬菜中存在的亞硝酸鹽則常被人們所忽視[7]。一般來說，日常情況下蔬菜中硝酸鹽不會引起中毒。但蔬菜存放過程中，硝酸鹽在微生物的作用下會被還原成亞硝酸鹽，當亞硝酸鹽富集到較高濃度時，食用后可引起中毒[8]，蔬菜在新鮮狀態下，硝酸鹽無顯著變化，亞硝酸鹽含量極低，如果存放條件差、時間長，細菌就會大量繁衍，這時亞硝酸鹽含量會明顯激增[9]，并且亞硝酸鹽含量隨放置時間而變化[10]。選擇具有代表性的葉菜類、根菜類、莖菜類蔬菜，經過預處理，加鹽提高環境密度，使得不利于細菌增長，在低溫條件下儲存冷凍蔬菜，模擬農家日常生活中人們儲存和加工蔬菜方式。但目前國內對于農家凍菜中亞硝酸鹽含量方面的研究目前還處于空白狀態，因此，研究自制凍菜亞硝酸鹽含量隨時間變化規律將具有重要的現實意義。本文采用分光度法-格林斯試劑比色法，采用最大吸收波長下（538 nm）[11]，模擬日常生活中凍菜加工方法，對自制凍菜亞硝酸鹽含量隨時間變化規律研究，為人們在凍菜的合理儲存、加工、食用中提供科學的參考根據[12-13]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大白菜、水晶白蘿卜、苤藍、芹菜：市購。

亞鐵氰化鉀、硼酸鈉、鹽酸、氨水、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、乙酸鋅、正辛醇、冰乙酸、活性炭（粉狀）、亞硝酸鈉，均為分析純：鄭州派尼化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

UV-4802 型紫外可見分光光度計：上海尤尼柯儀器有限公司；HH-S 型水浴鍋：鄭州長城科工貿有限公司；BS224S 型電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；BCD-206STPA 型冰箱：青島海爾股份有限公司。

1.3 試驗方法

將購買的新鮮蔬菜取可食部分可先用自來水、再用蒸餾水洗凈，后用濾紙吸干蔬菜表面的水分后，每種蔬菜約取700 g，切成厚0.8 mm 左右、寬1 cm～1.2 cm的長條或3 cm～4 cm 的片狀，將每種蔬菜用保鮮盒裝好，并在保鮮盒上標注相應的標簽，以便于識別樣品。根據低鹽度鹽漬和低溫環境下可以有利于抑制微生物的生長[14]，根據口味添加食用鹽，其蔬菜加鹽的鹽濃度控制在0.016 g/g，溫度控制在1 ℃左右下在冰箱內冷藏備用。定時稱取適量的4 組蔬菜樣品組織，將樣品切碎，充分混勻后用四分法取5.000 g。在取好的樣品中加1 滴～2 滴正辛醇消除泡沫劑，并置于250 mL具塞錐形瓶中，加入12.5 mL 飽和硼砂溶液，后加入70 ℃左右的純凈水150 mL，混勻，于水浴鍋中沸水浴15 min 左右，取出，冷水浴后，冷卻至室溫。加入5 mL亞鐵氰化鉀（106 g/L）溶液，充分混勻，再加5 mL 乙酸鋅（220 g/L）溶液以沉淀蛋白質，然后加入1 g 活性炭用水定容到刻度，搖勻，放置0.5 h 左右，上清液用定量濾紙過濾，濾液必須清澈（棄去初濾液30 mL）供測定用。在 0、1、2、3、4、5、6、7、9、11、13、15、17、19、21、24、27、30 d 取樣測定其亞硝酸鹽的含量，每個樣品重復測定2 次，取其樣品平均值，同時做試劑空白試驗（不加樣品），根據試驗條件采用GB 5009.33-2016《食品安全國家標準食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》測定凍菜中亞硝酸鹽含量[15]。

1.4 亞硝酸鹽含量的計算

分別精確吸取已配制的0.5 μg/mL 亞硝酸鈉標準使用液 0、0.2、0.4、0.8、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 于一組 50 mL帶塞比色管中，先加入適量的純凈水稀釋，混勻，再用移液槍分別往帶塞比色管中分別加入2 mL 對氨基苯磺酸（4 g/L）溶液，搖勻靜置約 3 min～5 min，再加入1 mL 鹽酸萘乙二胺（2 g/L）溶液，用水稀釋到刻度，混勻，在暗處放置15 min 后，用零管調節零點，用1 cm比色皿在538 nm 波長下測定亞硝酸鹽吸光度，繪制測得的各比色液的吸光度與對應的亞硝酸鹽濃度曲線圖。

根據標準曲線，樣品中亞硝酸鹽（以亞硝酸鈉計）的含量，計算公式如下：

式中：X 為試樣中亞硝酸鹽的含量，mg/kg；m1為測定用樣液中亞硝酸鹽的質量，μg；1 000 為轉換系數；m2為試樣的質量，g；V1為測定用樣液體積，mL；V0為試樣處理液總體積，mL。

根據GB 2762-2017《食品安全國家標準食品中污染物限量》對于蔬菜類食品規定中，亞硝酸鹽含量不得超過20 mg/kg[15]。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

測定亞硝酸鈉標準使用液亞硝酸鹽含量，結果見表1所示。

表1 亞硝酸鹽質量與吸光度關系Table 1 Relationship between the quality of nitrite and absorbance

根據表1 數據繪制標準曲線，試驗標準曲線如下圖1所示。

圖1 亞硝酸鹽標準曲線Fig.1 Standard nitrite curve

根據圖1 標準曲線，其線性回歸方程Y=0.089 2x+0.000 2（Y 為吸光度，x 為亞硝酸鈉質量（μg），線性相關系數R2=0.999 8，表明數據與直線之間的相關程度較好，因此可以可以滿足試驗要求。

2.2 亞硝酸鹽含量的測定

大白菜、水晶白蘿卜、苤藍、芹菜4 種自制凍菜樣品在冷溫（1 ℃）條件下冰箱儲存30 d，每天對4 種樣品進行取樣，測定和分析其亞硝酸鹽含量，測定結果如表2所示。

從表2 中可以看出幾組蔬菜在新鮮狀況下，亞硝酸鹽含量都是比較低的，自制凍菜在1 d～7 d 亞硝酸鹽含量增加速度非常緩慢，這是因為亞硝酸鹽含量受到溫度和鹽度的影響，提高了自制凍菜滲透壓、降低了自制凍菜水分的活度、有選擇地抑制其他微生物的生長[16-17]，使自制凍菜體內的亞硝酸鹽生成的速度極為緩慢，因此，低溫和加鹽對抑制亞硝酸鹽升高有一定的作用。大概從11 d～17 d 內均出現了峰值，這是因為隨著保存時間的延長，其中的微生物還是可以生長的，其細菌就會大量繁衍，使亞硝酸鹽含量升高。隨著貯存時間越長，增加越為顯著，而在17 d～30 d 又出現了亞硝酸鹽含量不同程度的下降并逐漸趨于穩定狀態。這是因為隨著微生物的生長代謝和繁殖等活動的不斷進行使保鮮盒內的氧氣被逐漸慢慢的消耗殆盡，不利于微生物及酶類生長繁殖[18]，亞硝酸鹽含量升高到一定的程度后，逐漸下降并趨于一個相對穩定的數值。

表2 凍菜亞硝酸鹽含量隨冷藏時間對變化規律的研究Table 2 Time dependence of frozen vegetables

圖2 凍菜亞硝酸鹽含量隨時間變化曲線Fig.2 Time dependence of frozen vegetables

2.3 方法驗證

2.3.1 加標回收率

本試驗是以水晶白蘿卜為例，選擇3 個樣品在其過濾的消化液中分別添加0.6、0.8、1mL 的亞硝酸鹽標準溶液，用純凈水定容到50 mL 比色管中，本試驗采用的是標準加入法測定亞硝酸鹽回收率，以此表示試驗的準確度和可靠性。試驗結果如表3。

表3 試驗回收率測定結果Table 3 Results of recovery rate

由表可知，3 個不同加標量樣品數據進行整理分析，測得亞硝酸鹽的回收率分別為95%、90%、94%，平均回收率為93%，回收率越接近1，說明樣品消解的損失率越低，試驗方法準確度越高。因此在采用紫外分光光度法過程中不存在顯著系統誤差，方法準確性具有較高的可信度。

2.3.2 精密度測定

配置1 μg/mL 亞硝酸鹽標準使用溶液，利用移液槍準確移取1 mL 的亞硝酸鹽標準溶液于具塞比色管內，按照重氮偶合法使用紫外分光度計對樣品對標樣重復測定7 次，計算吸光度的平均值和相對標準平均偏差，可以來確定儀器的準確度和靈敏度，以此確定試驗的可靠性，試驗結果如表4所示。

表4 精密度試驗測定結果Table 4 Results of precision test

由表中精密度試驗測定結果可知，通過重復測定標樣7 次，計算樣品標樣吸光度的重復性，樣品標樣吸光度的相對標準偏差為0.597%，遠小于2%，表明試驗精密度測定結果完全可以滿足試驗精密度的要求，試驗準確度較好。

3 結論

通過對4 種不同類型自制凍菜亞硝酸鹽含量的測定，結果表明：冷藏0～30 d 時亞硝酸鹽含量分別為，芹菜 0.474 mg/kg～1.193 mg/kg、苤藍 0.494 mg/kg～0.82 mg/kg、水晶白蘿卜 0.489 mg/kg～1.057 mg/kg、大白菜0.523 mg/kg～0.496 mg/kg，亞硝酸鹽含量最高的天數為15、17、17、11 d，整體峰值比新鮮蔬菜大約晚一周左右的時間。農家凍菜亞硝酸鹽含量增長速率隨冷藏時間的延長而增大，達到峰值后亞硝酸鹽含量會逐漸降低。隨著冷藏時間的持續延長亞硝酸鹽含量不斷降低直到趨于穩定狀態。試驗的回收率為93%，試驗方法準確度高，其精密度相對標準平均偏差為0.597%，遠小于2%，表明精密度試驗測定結果完全可以滿足試驗精密度的要求。根據GB 2762-2017《食品安全國家標準食品中污染物限量》對于蔬菜類食品規定亞硝酸鹽含量不得超過20 mg/kg，食用對人體健康不會造成影響。