4株姬松茸胞外多糖含量和生物活性的對比分析

解修超，劉軍生，羅陽蘭，鄧百萬，柏秋月，張毓文

（陜西省食藥用菌工程技術研究中心，陜西理工大學生物科學與工程學院，陜西 漢中 723001）

姬松茸（Agaricus blazei）又名巴西蘑菇，屬擔子菌亞門（Basidiomycotina）、層菌綱（Hymenomycetes）、傘菌目（Agaricales）、蘑菇科（Agaricaceae）、蘑菇屬（Agaricus），原產于巴西、秘魯和美國等地，后被引進日本和中國等國家，并對其進行了深入研究。研究發現，姬松茸具有較高的食藥用價值，富含多種活性成分，與白蘑菇的親緣關系較近，其多糖含量更是食用蕈菌之首[1]。近年來相關學者對姬松茸多糖在抗氧化[2]，抗疲勞[3]，抗炎[4]，抗腫瘤[5-6]，抗衰老[7]，降血糖[8]等方面的作用進行了深入研究，表明姬松茸多糖在糖尿病[9]、肥胖癥等疾病的治療方面具有一定的潛在價值。

然而目前，一方面對姬松茸多糖的研究主要集中在胞內多糖，對胞外多糖研究較少，僅有關于姬松茸胞外多糖抗氧化活性的初步報道[10]，尚無系統性的研究，相對于胞內多糖而言，胞外多糖提取加工方便，成本較低[11]；另一方面，國內目前用于生產或研究的姬松茸種大部分來源于巴西和日本等地，我國品質優良的姬松茸菌株稀缺，種質資源嚴重不足[12-13]，優良菌株亟待篩選補充。本研究利用4 株姬松茸菌株采用液體深層發酵法生產胞外多糖，測定其胞外多糖產量并考察其抑菌、抗氧化、抑制α-淀粉酶活性，篩選產胞外多糖的優勢菌株，以期為姬松茸的進一步綜合開發和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試的4 株姬松茸由陜西省食藥用菌工程技術研究中心保藏。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，批號 CMCC63501）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus，批號ATCC-25925）、大腸埃希菌（Escherichia coli，批號ATCC-25922）、白色念珠菌（Candida albicans，批號 CMCC85021），以上4 種菌株由陜西理工大學陜西省資源生物重點實驗室菌種保藏中心提供，試驗前復蘇傳代使用。

維生素 C（VC，分析純，批號：20160105）：天津市天新精細化工開發中心；DPPH：Sigma 公司；ABTS：上海生工生物工程有限公司；其余試劑均為分析純：天津市盛奧化學試劑有限公司。

馬鈴薯瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：馬鈴薯200.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、蛋白胨5.0 g/L、磷酸二氫鉀5.0 g/L、硫酸鎂3.0 g/L、瓊脂15.0 g/L、水1 000 mL、pH 值自然。

察氏培養基：硝酸鈉3.0 g、磷酸氫二鉀1.0 g、七水合硫酸鎂（MgSO4·7H2O）0.5 g、氯化鉀 0.5 g、硫酸亞鐵0.01 g、蔗糖 30.0 g、瓊脂 15.0 g、蒸餾水 1 000 mL。

牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉浸粉3.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，氯化鈉 5.0 g/L，瓊脂 15 g/L，水 1 000 mL。

1.2 儀器與設備

EYELA N1000 型旋轉蒸發儀：上海愛郎儀器有限公司；SW-CJ-1D 型單人超凈工作臺：上海蘇凈實業有限公司；YXQ-LS-50S 型高壓滅菌鍋：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；KQ5200DE 型數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；UV2550 型紫外分光光度計：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株菌落及細胞形態

分別將4 株姬松茸菌株接種于察氏培養基上，28 ℃暗培養5 d，觀察其菌落形態，采用棉藍染色法[14]在光學顯微鏡下觀察菌絲體的形態和大小[15]。

1.3.2 菌株ITS分子鑒定

對4 株姬松茸菌株進行ITS 分子鑒定，利用CTAB 法提取4 株姬松茸菌株的DNA，采用真菌通用引物 ITS-1（5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和 ITS-4（5′TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）對 ITS 序列進行擴增。PCR 反應體系 50 μL：2×Taq Master Mix 25 μL，10 μmol/L 引物各 2 μL，模板 DNA1 μL（濃度 10 ng/μL），雙蒸水補齊至50 μL。反應條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃ 30 s，59 ℃退火 30 s，72 ℃ 60 s，33 個循環；72 ℃延伸2 min，4 ℃保存。將試驗陽性PCR 產物送上海生工生物工程有限公司測序，測序結果整理后提交National Center for Biotechnology Information 數據庫，申請并獲得登錄號，并利用blast 進行序列比對，下載相似序列后利用Mega7.0 構建系統發育樹。

1.3.3 胞外多糖提取及含量測定

將4 株姬松茸菌株接入150 mL PDA 液體培養基中，120 r/min 振蕩發酵7 d，抽濾，收集濾液旋轉蒸發濃縮至60 mL，采用Sevag 法去除蛋白質，濾液與Sevag試劑按3 ∶1（體積比）置于250 mL 三角瓶中120 r/min振蕩30 min，分液漏斗靜置20 min，重復3 次，取上層清液。真空濃縮至50 mL，轉入三角瓶中加入3 倍體積的無水乙醇，4 ℃靜置過夜，5 000 r/min 離心 10 min，45 ℃干燥至恒重，即得姬松茸胞外多糖[16]。首先取除蛋白質后上層清液采用苯酚-濃硫酸法[17]測定總糖含量，并作葡萄糖標準曲線，其回歸方程為y=28.529x-0.001 9，R2=0.993 9。然后取加入乙醇沉降并離心后的上清液利用DNS 法測定還原糖含量，兩者之差即為胞外多糖的含量[18]，計算公式如下：

1.3.4 抑菌活性分析

采用濾紙片擴散法[19]研究4 株姬松茸胞外多糖（各取50 μL）對指示菌-枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis、金黃色葡萄球菌Staphyloccocus aureus、大腸桿菌Escherichia coli、白色念珠菌Candida albicans 菌株的抑菌效果，以含無菌PDA 培養基50 μL 的紙片作為溶劑陰性對照，以含 25 μg/mL 青霉素 50 μL 的紙片作為陽性對照，以0.96%生理鹽水100 μL 的紙片為空白對照。利用十字交叉法測量抑菌圈直徑D，抑菌效果（E）按下列公式計算：

采用二倍連續梯度稀釋法測定最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC），以 0.5 mL 的生理鹽水為空白對照，同時采用平板轉種法[20]測定最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）。

1.3.5 α-淀粉酶抑制作用的測定

參考文獻[21-22]，稍作修改，用無菌水將4 種胞外多糖樣品配制成 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL溶液，取0.5 mL 樣品溶液，加入0.5 mL 1 U/mL 的α-淀粉酶溶液與1 mL 0.25%的淀粉溶液，混勻后于50 ℃恒溫水浴反應10 min。然后立即加入1 mL DNS 溶液，沸水浴加熱5 min，冷卻后用pH 6.6 磷酸緩沖液定容至10 mL，測定575 nm 處吸光值。每樣重復3 次，取平均值，按下列公式計算α-淀粉酶活性的抑制率：

式中：AS為 0.5 mL 樣品液 +0.5 mL α-淀粉酶溶液的樣品吸光值；ASB為0.5 mL 樣品+0.5 mL 磷酸緩沖液的樣品對照組吸收值；AC為0.5 mL 二甲基亞砜+1 mL磷酸緩沖液的空白對照組吸光值。

1.3.6 體外抗氧化活性

1.3.6.1 還原能力測定

參考文獻[23]，稍作修改，用無菌水將4 種胞外多糖樣品及 VC配成 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 不同濃度的樣品溶液，取1mL 樣品，加入1mLpH6.6 磷酸緩沖液，1 mL 1%鐵氰化鉀溶液，混勻后于50 ℃水浴中反應20 min，加入1 mL10%三氯乙酸，混勻后取2 mL，加超純水 2 mL 與 200 μL 0.1%三氯化鐵，5 000 r/min 離心5 min，取上清液測定OD700，同時將鐵氰化鉀溶液替換成1 mL 去離子水作為對照組。以VC作為陽性對照，重復3 次，取平均值。

1.3.6.2 DPPH 自由基清除能力的測定

參考文獻[24]，稍作修改，用無菌水將4 種胞外多糖樣品及 VC配制成 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL不同濃度的樣品溶液，取2 mL 樣品溶液加入1 mL 0.2 mmol/L DPPH-99.9%乙醇溶液，混勻，放置在室溫（25 ℃）暗處 10 min，5 000 r/min 離心 5min，取上清液測定517 nm 處吸光值，以VC為陽性對照，每樣重復3 次，取平均值，并按下列公式計算DPPH 自由基清除率：

式中：AS為2 mL 樣品液+1 mL DPPH-乙醇溶液的樣品吸光值；ASB為2 mL 樣品液+1 mL 99.9 %乙醇溶液的樣品對照組吸光值；AC為2 mL 二甲基亞砜+1 mL 99.9%乙醇溶液的空白對照組吸光值。

1.3.6.3 ABTS+自由基清除能力的測定

參考文獻[25-26]，稍作修改，將7 mmol/L 的ABTS溶液和2.45 mmol/L 的過硫酸鉀溶液等體積混合，在室溫（25 ℃）、避光條件下靜置過夜，形成ABTS+儲備液。使用前將ABTS+儲備液用99.9 %乙醇稀釋（約稀釋60 倍），即 OD734為0.7±0.02。用無菌水將4 種胞外多糖樣品和 VC配制成 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL不同濃度的樣品溶液，取1 mL 樣品溶入2 mL ABTS+工作液，振蕩混合，放置于暗處5 min 后5 000 r/min 離心5 min，取上清液測定OD734，VC為陽性對照。每樣重復3 次，取平均值，并按下列公式計算ABTS+自由基清除率：

式中：AS為 1 mL 樣品液+2 mL ABTS+工作液的樣品吸光值；ASB為1 mL 樣品+2 mL 99.9%乙醇溶液的樣品對照組吸收值；AC為1 mL 二甲基亞砜+2 mL 99.9%乙醇溶液的空白對照組吸光值。

1.3.6.4 羥自由基清除能力的測定

參考文獻[27]，稍作修改，用無菌水將4 種胞外多糖樣品及 VC配制成 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 溶液，在1 mL 樣品中分別加入9 mmol/L FeSO4和9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液各2 mL 最后加2 mL 1.2 mmol/L H2O2啟動反應，于 37 ℃反應 30 min，5 000 r/min 離心 5 min，取上清液以去離子水調零在波長510 nm 測定樣品濃度吸光度A1；另外，去離子水代替H2O2重復上述操作，測定兩樣品本身的吸光值A2，同時以水代替兩樣品溶液，測定吸光度A0。VC為陽性對照。每樣重復3 次，取平均值，并按下列公式計算羥自由基清除率：

1.4 數據分析

試驗采用SPSS22.0，Origin8.5 軟件進行數據分析、圖表制作等，結果取3 次平行試驗的平均值。

2 結果與分析

2.1 菌株菌落形態

菌株外觀形態與顯微特征圖見圖1。

圖1 菌株外觀形態與顯微特征圖Fig.1 Colony morphology and microscopic characteristic of strains

4 株姬松茸菌絲有隔膜，具鎖狀分枝彎曲，與次頂端細胞融合，形成一橋狀結構。菌絲呈白色，呈扇面狀，背面呈淡黃色。4 株姬松茸菌株呈現不同的菌落形態，JS01 和JS06 氣生菌絲較為發達，生長速度快，生長后期能夠擰結成束，而JS04 和JS05 以基生菌絲為主，生長速度較慢。

2.2 菌株ITS 分子鑒定

JS01、JS04、JS05 和 JS06 菌株 ITS 的擴增結果顯示其序列大小在800 bp 左右。

將菌株ITS 序列測序后，提交至GenBank 數據庫中，進行序列分析和相似性比較，并建立系統發育樹以證實該菌的系統發育地位，結果如圖2所示。菌株與Agaricus blazei 中的ITS 序列具有99%的高度相似性，同時結合菌株菌落形態及顯微特征結果認為，菌株 JS01、JS04、JS05 和 JS06 為姬松茸菌株。

2.3 胞外多糖含量測定

采用苯酚-濃硫酸法和DNS 法測定4 株姬松茸胞外多糖含量見表1。

圖2 4 株姬松茸菌株系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of 4 Agaricus blazei strains

表1 胞外多糖含量Table 1 Extracellular polysaccharide content of strains

如表1所示，各姬松茸菌株的胞外多糖含量有所差異，其中JS01 胞外多糖含量為8.50 mg/mL，JS04 為3.34 mg/mL，JS05 為 8.81 mg/mL，JS06 為 7.70 mg/mL。

2.4 抗菌活性分析結果

本試驗利用濾紙片擴散法對4 株姬松茸胞外多糖的抗菌活性進行對比分析，結果見表2。

表2 胞外多糖抗菌活性分析Table 2 Antibacterial activity analysis of extracellular polysaccharide

菌株 JS01、JS04 的胞外多糖對 Escherichia coli 這種革蘭氏陰性菌有微弱的抑制作用，抑菌圈的大小為8 mm～12 mm，但 JS06 的胞外多糖對 Staphylococcus aureus 和Escherichia coli 均有很強的抑制作用，抑菌圈大小為21 mm～28 mm。4 株姬松茸胞外多糖對病原菌Staphyloccocus aureus 均具有一定的抑制作用。上述研究表明，JS06 胞外多糖在抑制病原菌方面效果更好。

2.5 抑菌活性對比

胞外多糖的MIC 和MBC 結果見表3。

試驗對照組無菌水紙片周圍無抑菌環，陽性對照組0.5%碘伏溶液周圍抑菌環均＞1.5 cm，表明試驗方法可行且無誤。結果表明，4 株姬松茸的胞外多糖對Bacillus subtilis、Staphyloccocus aureus、Escherichia coli和Candida albicans 均有一定的抑制作用，4 種姬松茸菌株對金黃色葡萄球菌的抑制效果較好，對枯草芽孢桿菌的抑制效果差距不大；試驗表明菌株JS06 有更好抑菌活性，而對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的抑菌效果明顯優于其他兩株致病菌，其最小抑菌濃度分別為0.31 g/L 和0.77 g/L，最小殺菌濃度為0.39 g/L 和0.94 g/L。

表3 胞外多糖的MIC 和MBCTable 3 MIC and MBC of extracellular polysaccharide

2.6 α-淀粉酶抑制能力測定

胞外多糖對α-淀粉酶的抑制作用見圖3。

圖3 胞外多糖對α-淀粉酶的抑制作用Fig.3 Inhibitory effect of extracellular polysaccharide on α-Amylase

由圖3 可以看出，4 株姬松茸胞外多糖成分對α-淀粉酶均有一定的抑制作用。濃度在0.1 mg/mL～1.0 mg/mL 內，隨著質量濃度的增加，α-淀粉酶抑制率不斷增加時，當濃度達到1.0 mg/mL 時，對α-淀粉酶的抑制率分別為93.55%、81.44%、89.46%和91.79%。經回歸分析得JS01 胞外多糖成分回歸方程為：y=9.539 8x+26.862（R2=0.998 8），計算得 IC50為 2.425 mg/mL；JS04 胞外多糖成分回歸方程為：y=10.95x+3.388 5（R2=0.997 2），計算得IC50為4.257 mg/mL；JS05 胞外多糖成分回歸方程為：y=9.756 2x+21.572（R2=0.999 3），計算得 IC50為2.905 mg/mL；JS06 胞外多糖成分回歸方程為：y=10.869x+17.854（R2=0.991 0），計算得 IC50為 2.958 mg/mL，表明4 株姬松茸胞外多糖成分對α-淀粉酶抑制作用存在較大差異，JS01 對α-淀粉酶抑制效果明顯優于其他3 株姬松茸菌株。

2.7 體外抗氧化活性對比

2.7.1 還原能力測定

胞外多糖的還原能力見圖4。

圖4 胞外多糖的還原能力Fig.4 Reducing activity of extracellular polysaccharide

由圖4 可知，4 株姬松茸胞外多糖成分均表現出不同程度的還原能力，與陽性對照VC相比，還原力從大到小排序為 VC＞JS01＞JS06＞JS05＞JS04。還原能力隨濃度的增加而逐漸增加，當濃度為0.1 mg/mL 時，4 株姬松茸胞外多糖的還原能力大小無顯著差異，但當大于0.1 mg/mL 時，四者的還原能力差距逐漸變大。當濃度為 1.0 mg/mL 時，VC和菌株 JS01、JS06、JS05、JS04 的還原力分別為 0.70±0.05 和 0.53±0.04、0.52±0.02、0.50±0.04、0.41±0.03，表明JS04 胞外多糖成分還原能力明顯小于其他3 株姬松茸菌株，4 株姬松茸胞外多糖都小于VC的還原能力。

2.7.2 DPPH 自由基清除能力的測定

胞外多糖對DPPH 自由基的清除作用見圖5。

圖5 胞外多糖對DPPH 自由基的清除作用Fig.5 DPPH free radicals scavenging activity of extracellular polysaccharide

由圖5 可知，4 株姬松茸胞外多糖成分對DPPH自由基均有一定的清除能力，0.1 mg/mL～1.0 mg/mL內，隨著質量濃度的增加，DPPH 自由基清除能力不斷增強，呈現良好的劑量效應關系。DPPH 自由基清除能力從大到小排序為 VC＞JS06＞JS01＞JS05＞JS04，濃度為1.0 mg/mL 時，對DPPH 自由基清除率分別為98.33%、96.47%、68.62%、45.75%和37.42%，經回歸分析得VC回歸方程為：y=10.007x+25.484（R2=0.983 8），計算得EC50為2.449 mg/mL；JS06 多糖成分回歸方程為：y=17.928x-33.145（R2=0.985 0），計算得 EC50為 4.638 mg/mL；JS01 多糖成分回歸方程為：y=11.292x-13.442（R2=0.988 6），計算得 EC50為 5.618 mg/mL；JS05 多糖成分回歸方程為：y=6.652 5x-1.204 3（R2=0.997 3），計算得EC50為7.697 mg/mL；JS04 多糖成分回歸方程為：y=5.543 4x-2.579 3（R2=0.985 2），計算得 EC50為 9.486 mg/mL。半數有效濃度（median effective concentration，EC50）是指清除率為50%時的樣品質量濃度，一般認為某種物質的EC50值低于10 mg/mL，表明其具有較好的抗氧化性[28]，因此4 株姬松茸胞外多糖成分均有較好的DPPH 自由基清除能力且存在顯著差異，JS06 胞外多糖的清除能力顯著優于其他3 株姬松茸的胞外多糖，表明JS06 的胞外多糖成分具有較強的DPPH 自由基清除能力。任朝輝等研究發現，姬松茸菌絲體多糖對DPPH 自由基的EC50為0.184 mg/mL，清除DPPH 自由基能力顯著大于胞外多糖，這可能與多糖本身活性和濃度有關，這有待于后續試驗的驗證。

2.7.3 ABTS+自由基清除能力的測定

胞外多糖對ABTS+自由基的清除作用見圖6。

圖6 胞外多糖對ABTS+自由基的清除作用Fig.6 ABTS+free radicals scavenging activity of extracellular polysaccharide

由圖6 可知，4 株姬松茸胞外多糖成分均具有較強的ABTS+自由基清除能力，隨著其質量濃度的增加，清除作用也隨之增強。ABTS+自由基清除能力從大到小排序為塊 VC＞JS01＞JS05＞JS06＞JS04，濃度為 1.0 mg/mL 時，對ABTS+自由基清除率分別為93.65%、83.06%、80.30%、77.27%和65.71%，經回歸分析Vc 和4 株姬松茸菌株的 EC50值依次為 2.163、3.203、3.647、3.708 mg/mL 和5.046 mg/mL，表明4 株姬松茸菌株胞外多糖成分對ABTS+自由基清除能力存在較大差異，JS01 的清除能力明顯優于其他3 株姬松茸菌株。說明JS01 的胞外多糖成分具有更強的ABTS+自由基清除能力。

2.7.4 羥自由基清除能力的測定

胞外多糖對羥自由基的清除作用見圖7。

圖7 胞外多糖對羥自由基的清除作用Fig.7 Hydroxyl free radical scavenging activity of extracellular polysaccharide

由圖7 可知，4 株姬松茸胞外多糖成分和VC均具有明顯的清除羥自由基作用且隨著質量濃度的增加不斷增加，對羥自由基的清除能力也逐漸增強。羥自由基清除能力從大到小排序為JS06＞JS01＞VC＞JS05＞JS04，濃度為1.0 mg/mL 時，對羥自由基清除率分別為99.71%、99.48%、99.03%、97.80%和94.25%。表明4株姬松茸菌株胞外多糖成分對羥自由基清除能力存在較大差異，JS06 和JS01 的清除能力優于VC，且明顯優于其他2 株姬松茸菌株。說明JS06 和JS01 的胞外多糖成分具有較強的羥自由基清除能力，張卉等[29]研究發現姬松茸胞外多糖AbEXP-la 在30 mg/L 的濃度條件下對羥基自由基的清除率達32.74%，這與本試驗的結果類似。

3 結論

4 株姬松茸菌株對4 種致病菌的均有一定抑制效果，對金黃色葡萄球菌抑制效果最好，表明菌株JS06有更好抑菌活性，可為天然抗菌藥物的開發提供新材料。

抗氧化結果顯示4 株姬松茸胞外多糖均具有一定的抗氧化活性，當濃度為1.0 mg/mL 時，JS01 的還原能力為 0.53±0.04，相當于 0.76 mg/mL VC當量。JS06 對于DPPH 自由基和羥自由基的清除率分別為96.47%和99.71%，均高于其他3 株姬松茸菌株，且對于羥自由基的清除率高于VC；菌株JS01 對α-淀粉酶的IC50為2.425 mg/mL，明顯優于其他3 株姬松茸菌株的抑制作用。由此可見，4 株姬松茸胞外多糖均具有抑菌、抗氧化活性和α-淀粉酶抑制作用，表明其胞外多糖具有潛在的藥用價值，有利于加大對姬松茸的研究力度，對姬松茸種質資源的開發利用具有重要意義。4 株姬松茸菌株中JS01 和JS06 的綜合表現較好，值得進一步研究。本試驗未對提取得到的胞外多糖進行脫色和進一步的純化處理，這可能會對其生物活性有一定影響，需要后續試驗進一步驗證，并提出有效解決方案，以便在不破壞胞外多糖活性的前提下，對其進行進一步的脫色和純化。