丹參酮ⅡA對神經病理性疼痛大鼠的影響*

沈亦萱，馬玉清，馬越，張紅，霍斌，王曉慶

(1.蘭州大學第一醫院麻醉科，蘭州 730000；2.蘭州大學第一臨床醫學院 2015級臨床醫學1班，蘭州 730000)

神經病理性疼痛是神經系統損傷和神經元敏感性改變所致的難治性疼痛，周圍神經和中樞神經元敏感化是誘發異常疼痛的原因，阿片類藥物治療效果不佳。新的靶分子導向的止痛劑備受期待。神經損傷后不可避免地激發神經元炎癥反應。神經元炎癥反應介導神經組織的修復和再生，參與慢性疼痛的發生。研究表明，高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1 protein，HMGB1)是一族含量豐富的非組蛋白核蛋白，氨基酸序列高度保守，可促發神經元炎癥反應。通過靶向抑制HMGB1表達可減輕神經性疼痛，阻斷HMGB1通路可能是治療神經性疼痛的有效途徑[1]。Toll 樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)是與免疫或炎性疾病密切相關的模式識別受體，與相應受體結合后激活NF-κB(nuclear transcription factor)信號通路，釋放細胞因子，引起炎癥級聯反應。丹參酮 (tanshinone)是中藥丹參根的脂溶性成分，含有鄰醌或對醌結構。丹參酮ⅡA (tanshinoneⅡA，Tan ⅡA)是丹參酮中含量最高、活性最穩定的成分，有明確的分子結構，有一定的抗炎和抗氧化作用。Tan ⅡA 可通過抑制環氧化酶-2(COX2) 的過表達和膠質細胞活化，抑制神經元炎癥反應(2)。筆者在本研究將建立脊神經選擇性結扎(spinal nerve ligation，SNL)疼痛模型，在細胞和分子水平探討HMGB1-TLR4信號通路在神經病理性疼痛的作用機制及Tan ⅡA對疼痛模型大鼠的作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康成年雄性無特定病原體(SPF) 級 Sprague-Dawley(SD)大鼠，甘肅中醫學院動物實驗中心提供，實驗動物生產許可證號：SCXK(甘)2011-0001，實驗動物使用許可證號：SYXK(甘)2011-0001，體質量 200～240 g，動物脊髓取腰( lumbar，L) 4～6(L4～L6)節段。

1.2主要試劑 兔抗大鼠 HMGB1 多克隆抗體(ab 11354)、TLR4 多克隆抗體(ab 22408)和辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗，試劑盒購自Abcam公司；大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素1β(IL-1β)和白細胞介素10(IL-10)酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒購自上海源葉生物科技有限公司；丹參酮 ⅡA 磺酸鈉注射液(STS，上海第一生化藥業有限公司，批號：130408)，其輔料為葡萄糖和注射用水；10%水合氯醛溶液(蘭州大學第一醫院藥劑科)。

1.3主要儀器 熒光定量PCR檢測系統(CF×96 Touch TM，Bio-Rad 公司)；濕轉印槽(Bio-Rad 公司)；圖像分析系統(ChemiDocTMMP Imaging System，Bio-Rad 公司)；微顯紫外分光光度計(BioMateTM3SSpectrophotometer，美國Thermo scientific公司)；BIO-RAD伯樂酶標儀(美國Thermo scientific公司)；Von Frey 纖維(美國stoleting 公司)；PL-200 熱刺痛儀(成都泰盟科技有限公司)。

1.4脊神經結扎疼痛模型(SNL)的建立 參照文獻[3]的方法制備 SNL 疼痛模型。腹腔注射10%水合氯醛 300 mg·kg-1麻醉大鼠，大鼠髂棘連線為 L5～L6間隙，在 L4至L1(S1)脊柱中線偏左 0.5 cm 處作長1.5 cm的縱行切口，鈍性分離左側椎旁肌肉，暴露 L6橫突和骶骨夾角，去除部分 L6橫突，鈍性分離 L5、L6脊神經，用 6～0號醫用絲線緊緊結扎 L5脊神經，并在線結遠端 5 mm 處剪斷 L5脊神經[4]。假手術組大鼠操作與手術大鼠相同，只暴露 L5脊神經而不結扎。

1.5動物分組與處理 成年雄性SD大鼠，采用隨機數字表法分為 3 組：假手術組、模型對照組和 Tan ⅡA 組，每組根據處死時間分為 3 小組：第3天組、第7天組和第14天組(n=6) 。SNL術畢即刻，Tan ⅡA組腹腔注射 STS 30 mg·kg-1·d-1，連續14 d，而假手術組和模型對照組腹腔注射等體積注射用水。

1.6痛閾測定 參照文獻[5]方法，以Von Frey 纖維絲測定大鼠 50% 縮足反應閾值(paw withdrawal threshold，PWT)，采用 PL-200熱輻射儀測定大鼠的熱刺激縮爪潛伏期(paw withdrawal latency，PWL)。

1.7實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)檢測大鼠腰段脊髓 HMGB 和TLR4mRNA的表達 登錄 Genebank，根據大鼠 HMGB1 和 TLR4 全長基因序列，應用 Perkin- Elmer Applied Biosystems 提供的 Primer Express soft ware 設計引物，由上海生物工程有限公司合成，目的基因引物、序列和長度見表1。

表1 目的基因引物、序列和長度

Tab.1Primer,sequenceandlengthoftargetgene

目的基因擴增長度/bp引物序列HMGB1218上游引物5′AGC AAT CTG AAC GTC TGT CC 3′下游引物5′GTT CTT GTG ATA GCC TTC GC 3′TLR4356上游引物5′GCC GGA AAG TTA TTG TGG TGG T 3′下游引物5′ATG GGT TTT AGG CGC AGA GTT T 3′β-actin372上游引物5′GCC ATG TAC GTA GCC ATC CA 3′下游引物5′GAA CCG CTC ATT GCC GAT AG 3′

大鼠腰段脊髓組織(≤30 mg)，按 Total RNA Kit 說明書提取總 RNA，測定總 RNA 的濃度和純度，鑒定 RNA 完整性。以提取的總 RNA 為模板，按照逆轉錄試劑盒(Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit) 說明書進行逆轉錄反應，合成 cDNA 第一鏈，-20 ℃保存。以制備的 cDNA 為模板，分別擴增β-actin、HMGB1 和 TLR4。cDNA 樣品稀釋10倍，分別進行實時熒光定量PCR 擴增，熒光染料法(SYBR Green) 實時監測 PCR 產物量，得出熒光曲線，通過cDNA 濃度梯度的對數值對CT 值作圖比較兩基因擴增效率。反應體系為：95 ℃預變性 15 s，95 ℃變性 3 min，55 ℃退火 1 min，44個循環。采用羅氏公司的 Fast Start Universal SYBR Green Master 試劑盒，在 CF×96 TouchTM熒光定量 PCR 儀上進行目的基因(HMGB1 和TLR4)和內參基因(β-actin)擴增，取 Ct 平均值，用2-ΔΔCt法處理數據[6]。

1.8Western blotting檢測大鼠腰段脊髓 HMGB和TLR4 蛋白質的表達 采用 BCA 法蛋白質定量，在50 μg蛋白質/ 泳道中加入等體積 2×SDS 凝膠加樣緩沖液，煮沸使蛋白質變性，電泳分離蛋白質；300 mA，1 h 用半干轉膜儀將蛋白質轉移至聚偏氟乙烯(Polyvinylidene fluoride，PVDF) 膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，4 ℃封閉過夜；次日，加入稀釋的一抗(anti-HMGB1 mouse IgG，anti-TLR4 mouse IgG，anti-β-actin mouse IgG)，4 ℃孵育2 h；TBST 洗膜 10 min×3次；加入辣根過氧化物酶標記的二抗，4 ℃孵育4～8 h；TBST 洗膜10 min×3 次。用 Western blotting 熒光檢測試劑顯色液，顯色1～15 min，顯影后終止反應，用凝膠圖像成像系統分析。

1.9ELISA 檢測大鼠腰段脊髓TNF-α、IL-1β和IL-10蛋白的表達 脊髓組織稱定質量后置于勻漿緩沖液中勻漿，4 ℃，2000×g離心30 min，取上清液待用。在波長450 nm處測定標本吸光度(A450值)，通過標準品A值繪出標準曲線，按曲線方程式計算各樣本濃度，利用曲線方程式算出 TNF-α、IL-1β 和 IL-10 的蛋白含量，每組樣品點 3 孔。

2 結果

2.1Tan ⅡA對SNL大鼠痛敏的影響 SNL手術增加大鼠后足對機械性刺激和熱刺激的敏感性，與假手術組比較，模型對照組、Tan ⅡA 組PWT 和 PWL 均降低，差異有統計學意義(P<0.01)。模型對照組術后第3天時大鼠 PWT和 PWL 均較術前明顯降低(P<0.01)。與模型對照組比較，TanⅡA 組大鼠術后第3天時 PWT和 PWL 升高(P<0.01)。見圖1。

與假手術組比較，*1P<0.01；與模型對照組比較，*2P<0.01

Compared with sham-operated group，*1P<0.01；Compared with model control group，*2P<0.01

2.2Tan ⅡA對SNL大鼠腰段脊髓HMGB1和TLR4 mRNA表達的影響 Real-time PCR 檢測大鼠脊髓 HMGB1 和 TLR4 mRNA 表達水平結果見圖 2。 與假手術組比較，模型對照組大鼠在第3，7和14天脊髓 HMGB1和TLR4 mRNA 表達水平顯著升高，均差異有統計學意義(均P<0.05)。與模型對照組比較，Tan ⅡA 組大鼠脊髓 HMGB1 和 TLR4 mRNA 表達水平顯著降低，均差異有統計學意義 (均P<0.05)。

與假手術組比較，*1P<0.05；與模型對照組比較，*2P<0.05

Compared with sham-operated group，*1P<0.05；Compared with model control group，*2P<0.05

2.3TanⅡA 對SNL大鼠腰段脊髓HMGB1和TLR4 蛋白表達的影響 Western blotting 檢測大鼠脊髓 HMGB1 和 TLR4 蛋白表達水平結果見圖3，4 。與假手術組比較，模型對照組大鼠在 第3，7和 14天脊髓 HMGB1和TLR4 蛋白表達水平顯著增，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型對照組比較，Tan ⅡA 組大鼠脊髓 HMGB1和TLR4 蛋白表達水平顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。上述結果提示，模型大鼠痛閾變化可能與 HMGB1、TLR4 高表達有關。

與假手術組比較，*1P<0.05；與模型對照組比較，*2P<0.05

圖3 3組大鼠SNL術后不同時間點HMGB1蛋白的表達變化

Compared with sham-operated group，*1P<0.05；Compared with model control group，*2P<0.05

2.4TanⅡA對SNL大鼠脊髓TNF-α、IL-1β和IL-10蛋白表達的影響 ELISA 法檢測結果見圖5。與假手術組比較，模型對照組、TanⅡA 組大鼠第3，7和14天脊髓TNF-α和IL-1β表達水平增加(P<0.05)；與模型對照組比較，TanⅡA 組大鼠第3，7和14天脊髓TNF-α和IL-1β表達水平降低(P<0.05)，而IL-10的表達水平顯著增加，均差異有統計學意義(P<0.05)。

3 討論

本研究采用改良的L5SNL模型，參照文獻方法制備脊神經選擇性結扎切斷模型，行為學測試結果顯示，SNL術后大鼠后足對機械性和熱刺激的敏感性增加，術后第3，7和14天大鼠 PWT和PWL明顯降低，表明模型成功。TanⅡA 腹腔注射后大鼠后足機械性和熱刺激的敏感性降低，術后第3，7和14天大鼠 PWT和PWL明顯升高，鎮痛作用明顯。

筆者在預實驗采用30和 50 mg·kg-1的STS腹腔注射用藥，效果無明顯區別，但50 mg·kg-1時大鼠出現明顯的副作用。因此，根據藥量藥效學最佳比例，選擇實驗劑量30 mg·kg-1。Tan ⅡA不易吸收，以水溶性STS 替代以提高生物利用度。

脊髓是調節痛覺信號傳導的重要中樞，脊髓水平HMGB1 及其內源性配體在神經病理性疼痛中作用的研究不多。本研究結果顯示，假手術組脊髓組織中HMGB1 mRNA 和蛋白質表達極少，SNL 術后 第3天，隨著異常痛敏的產生，模型對照組脊髓 HMGB1 mRNA和蛋白質表達均明顯升高。推測HMGB1與病理性疼痛時的機械性痛覺超敏和熱刺激誘發的痛覺過敏有關。研究表明，大鼠神經受損后，用HMGB1抗體治療可明顯減輕痛覺過敏，說明HMGB1與神經病理性疼痛有關[7]。有研究發現 HMGB1 可延長慢性炎癥性疼痛的病理進程，推測原因為脊髓星形膠質細胞和背根神經節細胞中HMGB1表達上調所致[8]。本研究發現，Tan ⅡA 組與 模型對照組比較，大鼠脊髓組織HMGB1的表達明顯減少，且該組大鼠的PWT和PWL同時顯著減輕。提示腹腔注射 TanⅡA 在產生鎮痛效應的同時，也抑制脊髓組織 HMGBl mRNA和蛋白的表達，推測HMGB1表達下調可能是 Tan ⅡA 發揮鎮痛作用的機制。假手術組大鼠脊髓的 TLR4 mRNA 和蛋白表達較低，SNL 術后第3天，伴隨異常痛敏的出現，模型對照組脊髓TLR4 mRNA和蛋白表達上調并維持在較高水平，推測TLR4與機械痛和熱敏痛有關。HMGB 與TLR4結合呈二聚體化，激活 MAPK 和 NF-κB 信號轉導通路[9]，生成大量的細胞因子TNF-α和IL-1β，產生痛覺過敏和痛覺超敏[10]，這與本實驗結果一致。TLR位于神經元界面，越來越多的證據表明TLR激活神經膠質細胞(包括小膠質細胞和星形膠質細胞)、感覺神經元和其他細胞的炎癥反應，影響痛覺傳導，導致疼痛擴大和不易治愈[11]。本實驗檢測到TLR4的表達量較HMGB1少，因為TLR4不是HMGB1的唯一受體，晚期糖基化終末產物受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE) 也與可HMGB1受體結合，啟動NF-κB信號通路。神經元膠質細胞激活后可釋放一系列的炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6 等，產生神經病理性疼痛[12]。本研究還發現，TanⅡA腹腔注射抑制TLR4和下游炎癥因子TNF-α和IL-1β的表達，且該組大鼠的PWT和PWL同時顯著減輕，提示腹腔注射TanⅡA產生鎮痛效應的同時，抑制脊髓組織中TLR4 mRNA 及蛋白的表達，推測TLR4和下游細胞因子TNF-α和IL-1β的表達下調可能是TanⅡA發揮鎮痛作用的機制。IL-10可以抑制炎性因子IL-1β、IL-6及脊髓膠質細胞活化所致的疼痛過敏[13]。HMGB1抗體或HMGB1抑制劑對炎性病理性疼痛療效明顯[14]。HMGB1抑制劑(丙酮酸乙酯)可抑制腦損傷模型大鼠的 HMGB1/TLR4/NF-κB 信號轉導通路和炎癥反應，改善模型大鼠的腦水腫[15]。本實驗也觀察到，TanⅡA 可抑制SNL大鼠脊髓 HMGB1、TLR4、TNF-α和IL-1β的表達，促進IL-10的表達，逆轉SNL所致的熱敏痛和機械痛。

與假手術組比較，*1P<0.05；與模型對照組比較，*2P<0.05

Compared with sham-operated group，*1P<0.05；Compared with model control group，*2P<0.05

與假手術組比較，*1P<0.05；與模型對照組比較，*2P<0.05

TanⅡA可逆轉SNL所致的熱敏痛和機械痛，使HMGB1和TLR4 mRNA和蛋白質表達降低，炎癥細胞因子TNF-α，IL-1β的表達減少，抗炎因子 IL-10 的表達增加，抑制HMGB1-TLR4信號通路。表明在L5SNL模型中抑制HMGB1-TLR4信號通路有一定的鎮痛作用，HMGB1-TLR4信號通路與神經病理性疼痛有關，可作為治療病理性疼痛的靶點。