非小細胞肺癌中免疫檢查點表達與臨床特征及預后的關系分析

黃維，張慶娟，劉柯，徐茜，周美英

宜賓市第一人民醫院腫瘤科，四川宜賓644000

肺癌作為臨床最常見的惡性腫瘤，近年來發病率及病死率持續上升，均居惡性腫瘤第1位，嚴重威脅人類的健康和生命[1]。非小細胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）是最常見的肺癌類型，約占肺癌的80%以上，大多數患者確診為NSCLC時已處于晚期，采取化療、放療等傳統治療方法效果均不理想[2]。近年來，程序性死亡受體1（programmed cell death 1，PDCD1，也稱 PD-1），程序性死亡受體配體1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也稱PD-L1），B、T淋巴細胞衰減因子（B-and T-lymphocyte attenuator，BTLA）、淋巴細胞活化基因3（lymphocyte activating 3，LAG3）及細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）等免疫檢查點的研究逐漸成為NSCLC治療研究的熱點[3]。研究證實免疫檢查點能夠抑制T細胞等的免疫功能，介導腫瘤細胞免疫逃逸[4]，因此，通過免疫檢查點阻斷劑對其表達進行干涉，成為治療NSCLC的一種新型、有效的治療方式。目前臨床關于免疫檢查點與NSCLC患者臨床特征及預后關系的報道較少。基于此，本研究選取了144例NSCLC患者的腫瘤組織標本，探討其免疫檢查點表達情況與臨床特征及預后的關系，以期為NSCLC免疫治療提供新的理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2011年4月至2014年4月于宜賓市第一人民醫院接受手術治療的NSCLC患者的腫瘤組織標本。納入標準：①符合NSCLC診斷標準并經組織學檢查確診為NSCLC[5]；②患者術前未接受放療、化療或其他抗腫瘤治療。排除標準：①合并其他腫瘤；②患者有或疑似有自身免疫性疾病；③患者接受過類固醇治療。根據納入、排除標準，共納入144例NSCLC患者的腫瘤組織標本。144例患者中，男95例，女49例；年齡為37～78歲，平均年齡為（55.35±16.14）歲；TNM分期[6]：Ⅰ期52例，Ⅱ期29例，Ⅲ期63例；吸煙65例，不吸煙79例；病理類型：腺癌86例，鱗癌32例，其他26例；有淋巴結轉移69例，無淋巴結轉移75例。

1.2 檢測方法

選取納入研究的腫瘤組織標本，采用免疫組織化學法對腫瘤組織的PD-L1、PD-1、BTLA、CTLA-4和LAG3的表達情況進行檢測：3μm連續切片，粘貼于載玻片上，濾紙吸干水分，置于60℃烤箱中烘烤2 h后取出，置于二甲苯中脫蠟，每次3 min，連續3次，依次經100%、80%、60%無水乙醇浸泡2 min，自來水洗凈。經乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）抗原修復液修復后，將切片浸泡在配置好的H2O2溶液中，培養10 min后，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）沖洗 3次，每次3 min。PBS清除后，先后向切片上滴加配置好的一抗、二抗，分別培養1 h、10 min、30 min，并用PBS沖洗。清除PBS后，滴加二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色劑，待切片顯色后，用自來水沖洗，置于蘇木素溶液中復染30 s后，用自來水沖洗，吹風機吹干，封片。

1.3 觀察指標及評價方法

評價腫瘤組織標本中PD-L1、PD-1、BTLA、CTLA-4、LAG3的表達情況。PD-1、PD-L1表達情況判定：陽性細胞比例＜5%為陰性，陽性細胞比例≥5%為陽性。采用免疫組織化學半定量評分系統，得出LAG3的平均值為87分，以此為截點，≤87分為陽性，＞87分為陰性；BTLA的平均值為179分，以此為截點，≤179分為陽性，＞179分為陰性；CTLA-4的平均值為125分，以此為截點，≤125分為陽性，＞125分為陰性。

1.4 隨訪

隨訪3年，隨訪方式為門診及電話隨訪。

1.5 統計學方法

采用SPSS 18.0統計軟件分析數據。計數資料以例數和率（%）表示，采用χ2檢驗；NSCLC患者預后的單因素分析采用χ2檢驗；將單因素分析后差異有統計學意義的因素引入Cox風險比例模型進行多因素分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同臨床特征NSCLC患者腫瘤組織的免疫檢查點陽性表達率比較

144例患者中，有淋巴結轉移的患者腫瘤組織的PD-L1的陽性表達率明顯高于無淋巴結轉移的患者，差異有統計學意義（χ2=0.619，P=0.006）；不同病理類型患者腫瘤組織中的PD-L1的陽性表達率比較，差異有統計學意義（χ2=1.259，P=0.013）；吸煙的患者腫瘤組織中的PD-1陽性表達率高于不吸煙的患者，差異有統計學意義（χ2=2.031，P=0.018）；女性、吸煙、有淋巴結轉移的患者腫瘤組織中的BTLA陽性表達率均高于男性、不吸煙、無淋巴結轉移的患者，差異均有統計學意義（χ2=0.896、2.047、1.632，P=0.047、0.034、0.030）；不同TNM分期患者腫瘤組織中的LAG3陽性表達率比較，差異有統計學意義（χ2=0.951，P=0.035）。（表1）

表1 不同臨床特征NSCLC患者腫瘤組織的免疫檢查點陽性表達情況[ n=144， n（%）]

2.2 NSCLC患者預后的單因素分析

PD-L1、PD-1陰性表達及LAG3陽性表達患者的中位無疾病生存（disease-free survival，DFS）時間分別為23.5、22.0、35.5個月，均長于 PD-L1、PD-1陽性表達及LAG3陰性表達患者的17.0、16.0、14.5個月，差異均有統計學意義（χ2=6.856、4.611、4.169，P＜0.05）；PD-L1陰性表達及BTLA、LAG3陽性表達患者的3年DFS率分別為38.5%、35.0%、48.5%，均高于PD-L1陽性表達及BTLA、LAG3陰性表達患者的23.2%、27.1%、19.1%，差異均有統計學意義（χ2=5.387、5.359、3.117，P＜0.05）；BTLA、CTLA-4陽性表達與陰性表達患者的中位DFS時間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；PD-1、CTLA-4陽性表達與陰性表達患者的3年DFS率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表2）

表2 免疫檢查點陽性表達與陰性表達患者的中位DFS時間及DFS率情況

2.3 NSCLC患者預后的多因素分析

采用Cox回歸模型進行NSCLC患者預后的多因素分析，結果顯示PD-L1、LAG3是NSCLC患者預后的影響因素（P＜0.01）。（表3）

表3 Cox回歸模型分析

3 討論

NSCLC是肺癌的主要類型，傳統的治療方法對該病的治療效果不甚理想，5年病死率達85%以上[7]。因此，探索新的治療方法成為NSCLC研究的熱點。近年來的研究發現，免疫檢查點具有抑制T細胞功能及阻斷免疫信號通路的作用，在腫瘤的發生發展過程中起重要的作用[8]。其中，PD-1是主要表達在活化T細胞表面的抑制性受體，PD-L1是PD-1的配體，兩者結合，可抑制T細胞的活化，減弱T細胞對腫瘤細胞的抑制，并誘發腫瘤細胞免疫逃逸。BTLA是表達在B、T細胞的抑制性受體，在機體抗腫瘤免疫應答中發揮負性調節作用。LAG3在多種腫瘤微環境中表達，與其配體主要組織相容性復合體Ⅱ(major histocompatibility complex-Ⅱ，MHC-Ⅱ）結合后，調節T細胞功能，參與腫瘤細胞免疫逃逸[9-10]。研究顯示免疫檢查點表達與惡性腫瘤患者臨床特征及預后相關，但有關免疫檢查點表達與NSCLC的臨床特征及預后關系的報道較少[11]。因此，本研究對此作進一步研究，試圖為NSCLC的細胞免疫治療提供更多的臨床參考依據。

PD-1最早發現于凋亡T細胞雜交瘤中，PD-L1作為其主要配體之一，在機體內起負性調控免疫作用，PD-L1/PD-1信號通路在機體免疫調控中發揮主導作用，利用這一特點，異常刺激PD-L1/PD-1信號通路，可使T細胞活化和增殖受到抑制，誘導T細胞凋亡，實現腫瘤細胞免疫逃逸[12]。研究表明，PD-L1和PD-1在NSCLC腫瘤組織中陽性表達率升高，且PD-L1陽性表達率越高，患者預后越差[13]。本研究顯示，PD-L1表達與NSCLC患者預后相關，是患者預后不良的影響因素，與以上研究結果一致。研究顯示，BTLA、CTLA-4高表達與胃癌患者預后不良緊密相關[14]。BTLA是一種新被發現的抑制性受體，通過與皰疹病毒侵入介質相結合，起到調節T細胞活化、增殖和凋亡的作用，從而發揮其負性調節作用。CTLA-4主要表達在CD4+T細胞表面，表達在抗原呈遞細胞的CD80/CD86是其配體，T細胞激活后，兩者結合可抑制T細胞活化和增殖。本研究顯示，BTLA表達與患者的性別、是否吸煙及有無淋巴結轉移有關，而CTLA-4與NSCLC患者的性別、年齡、是否吸煙、TNM分期、有無淋巴結轉移、病理類型均無關，與以上研究結果不同，可能是腫瘤類型不同，或者是本研究樣本量較少，導致結果存在差異。研究顯示，在結直腸癌、乳腺癌、黑色素瘤等惡性腫瘤中發現LAG3陽性表達率升高，且其表達與腫瘤的發生發展存在一定的關聯[15]。本研究顯示，不同TNM分期患者腫瘤組織中的LAG3陽性表達率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；Cox回歸模型分析顯示LAG3是NSCLC患者預后的影響因素。LAG3是一種負性免疫刺激因子，在多種腫瘤微環境中異常表達，和MHC-Ⅱ結合后能夠起到負性調控T細胞的作用，從而導致腫瘤免疫逃逸。綜上，PD-1與LAG3在腫瘤組織中存在共表達現象。但也有研究顯示，當同時阻斷PD-1與LAG3的信號通路時，T細胞能夠恢復正常的分泌腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）的功能，但只阻斷LAG3信號通路時，這一分泌功能則不會恢復，說明腫瘤細胞逃逸機制十分復雜，免疫檢查點存在不同的共表達現象，在腫瘤細胞逃逸機制中發揮協同或排斥作用，從而影響腫瘤的發生和發展。

綜上所述，NSCLC患者腫瘤組織中免疫檢查點PD-1、PD-L1、BTLA、LAG3的表達與患者的臨床特征有一定的關系，PD-L1、LAG3是NSCLC患者預后的影響因素，對預測患者預后及指導細胞免疫治療有重要的意義。