循環腫瘤細胞檢測在乳腺癌患者中的應用研究進展

黃永鴻 潘小明 羊濤

[摘要]臨床證實乳腺癌患者存在血液轉移的情況，循環腫瘤細胞（CTC）從原發腫瘤組織中脫落后進入血液循環，并在遠處組織種植和生長，促使遠處轉移病灶形成。早期進行循環腫瘤細胞檢測對于乳腺癌患者個體化診治方案的制定具有較好的指導意義。本文對循環腫瘤細胞檢測技術以及其在乳腺癌中的應用現狀進行綜述。

[關鍵詞]乳腺癌；循環腫瘤細胞；應用價值

[中圖分類號] R737.9 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2019）5（b）-0032-03

Progress in the application of circulating tumor cell detection in patients with breast cancer

HUANG Yong-hong PAN Xiao-ming YANG Tao WANG Hui-ling LYU Mian XU Chang-qiang

Department of Breast Thyroid Surgery， the Second People′s Hospital of Nanning City， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning 530031， China

[Abstract] Clinical evidence of blood metastasis in patients with breast cancer， circulating tumor cell （CTC） enters the blood circulation from the primary tumor tissue and grows in the distant tissue， which promotes the formation of distant metastases. Early detection of circulating tumor cells has good guiding significance for individual diagnosis and treatment of breast cancer. In this paper， the technique of circulating tumor cell detection and its application in breast cancer are reviewed.

[Key words] Breast cancer； Circulating tumor cells； Application value

乳腺癌是一種發病率高的婦科惡性腫瘤[1]，該病的診斷及治療效果隨著臨床診治技術的提高以及設備的更新而不斷提升[2]。乳腺癌患者的死亡多與遠處轉移相關聯，且超過90%的癌癥患者都是因循環腫瘤細胞經血液傳播而出現的遠處轉移，傳統的檢測技術不能夠檢測到獨立腫瘤細胞的轉移過程，當血液和骨髓被入侵時，會出現遠處轉移的先兆，對血液和骨髓中的腫瘤細胞進行檢測是癌癥研究中的重要熱點，而循環腫瘤細胞作為一種“液體活檢”標志物，可對乳腺癌的療效進行評估。本文對循環腫瘤細胞進行概述，并對循環腫瘤細胞檢測技術、應用價值進行綜述。

1循環腫瘤細胞的概述

循環腫瘤細胞的概念最先出現為1896年，由Ashworth提出；在1976年，Nowell修正了循環腫瘤細胞的定義，定義為脫落于原發腫瘤，獲得脫離基底膜的能力并入侵通過組織基質進入血管的腫瘤細胞。循環腫瘤細胞是存在于外周血中各類腫瘤細胞的統稱[3]，不僅會導致癌癥患者在治療后出現復發、遠處轉移等情況，還會提高癌癥患者的死亡率。

循環腫瘤細胞的作用機制為：腫瘤轉移向原發腫瘤細胞附件相關組織、淋巴管系統、血液入侵，之后形成循環腫瘤細胞，經血液或淋巴擴散后，達到遠端組織，進行播種、定植和生長，出現遠處轉移灶[4]。

2循環腫瘤細胞檢測技術

2.1富集與分離技術

2.1.1抗原抗體反應技術 上皮細胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecular，EpCAM）的表達在循環腫瘤細胞檢測技術中十分重要，其作為一種上皮特異性蛋白，用于陽性篩選、陰性篩選中均可以富集循環腫瘤細胞，其中臨床多采用淋巴細胞標記物CD45、粒細胞標記物CD15，再利用免疫磁性技術進行細胞篩選[5]，去除血液樣本中的淋巴細胞。

2.1.2基于細胞大小的富集 按照血液樣本流過微通道流速的不同，可劃分成不同的亞群。循環腫瘤細胞的體積大于正常的血液細胞，結構不會出現太大的變化，流速穩定[6]，經過微通道后，可在收集區分離循環腫瘤細胞。螺旋生物芯片的微流體設備可高度控制血流，因此在全血樣本中可檢測到比率較高的乳腺癌細胞，但是血凝塊和氣泡會對精密的微流體設備造成影響。臨床目前正在驗證一種雙向電泳分離循環腫瘤細胞的新技術的有效性。細胞作為一種電絕緣體，在不同的電場中，對液體進行作用時出現極化情況，變成一種電介質粒子。雙向電泳設備可極化血液樣本中的細胞，將其向收集區移動，該技術的敏感性高，甚至可分離單一的循環腫瘤細胞[7]。

2.1.3密度梯度離心 通過OncoQuick儀器或者是黏性液體淋巴細胞分離液中不同的離心遷移度，能夠從其他血細胞中將單核細胞（包括循環腫瘤細胞）進行分離。循環腫瘤細胞的浮力小于外周血單核細胞[8]，因此可富集循環腫瘤細胞。密度梯度離心技術可快速富集循環腫瘤細胞，并將其從血細胞中分離出來，但是分離出的循環腫瘤細胞中會出現較多混雜的淋巴細胞[9]，經過離心后，很難精確分離單核細胞層。該技術的優點在于細胞回收率高，且操作簡單、經濟性和實用性高，對設備的要求不高，適合推廣應用在臨床中。

2.2細胞鑒定技術

2.2.1免疫細胞化學方法（ICC） ICC的原理為根據免疫學原理，利用抗體和特定抗原專一結合的反應，對抗原進行定位測定的技術，可對是否存在腫瘤細胞進行判斷。ICC的敏感度區間為105～106[10]，操作簡單且具有較好的直觀性。循環腫瘤細胞的分離可通過上皮特異抗原而實現。

2.2.2流式細胞技術（FCM） FCM的原理在于腫瘤細胞特異性標志物結合標記熒光物質的單克隆抗體，使用流式細胞儀對染色后的腫瘤細胞進行檢測和分析，進行多參數、快速的定量分析[11]，可有效檢測乳腺癌患者外周血中的腫瘤細胞。流式細胞儀可定量循環腫瘤細胞亞群，并將其特征化。

2.2.3反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR） RT-PCR是通過檢測mRNA的特異性來判斷是否存在腫瘤細胞。RT-PCR可將血液樣本中溶解的細胞是否含有循環腫瘤細胞分子進行確定，循環腫瘤細胞的mRNA反轉錄生成cDNA，利用PCR可進行擴增，可根據PCR反應結果對循環腫瘤細胞于樣本中的數目、表達方式進行預估[12]。RT-PCR技術具有敏感性高、特異性高以及自動化的特點，采用多重mRNA標記物可對循環腫瘤細胞、正常血細胞進行較好地鑒別診斷。但是RT-PCR技術仍存在不足之處，例如其會破壞循環腫瘤細胞，無法觀察循環腫瘤細胞的形態學和計數。

2.2.4激光掃描細胞計量技術（LSC） LSC是一種具有圖像細胞儀功能、流式細胞儀功能的高通量細胞分析儀，通過進行連續掃描熒光顯微鏡下的圖像，可對所產生的數據進行自動分析。LSC技術通過顯微鏡可在30 min～1 h內自動篩查5×104個細胞。當LSC技術結合濃聚細胞技術時，經熒光染色可提高敏感度。

2.3 CTC芯片技術

CTC芯片技術于2007年提出，是在微流平臺上采用的微芯片技術，在精確操控的層流條件下利用包裹EP-CAM抗體的微柱將循環腫瘤細胞從循環血中進行分離，該技術應用在結腸癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤患者的循環血中均成功檢測出了循環腫瘤細胞。隨著臨床的進一步研究，Herringbone-chip的出現促使循環腫瘤細胞與抗體接觸的機會大大增加，從而使循環腫瘤細胞檢出率大幅提高。分析其原理在于：基于癌細胞尺寸的捕獲與分離法、片上介電電泳法以及細胞親和微層析法等。

3循環腫瘤細胞檢測技術在乳腺癌中的應用

3.1循環腫瘤細胞作為乳腺癌預后標志物

3.1.1早期乳腺癌循環腫瘤細胞檢測 循環腫瘤細胞數目為獨立的預后指標之一，且循環腫瘤細胞檢出絕對值的高低可對乳腺癌患者的預后進行判斷，成負相關關系。循環腫瘤細胞可作為早期無癥狀乳腺癌患者的常規檢查項目，根據結果對乳腺癌患者進行相應的治療。另外乳腺癌患者新輔助化療前檢出循環腫瘤細胞可促進其預后的改善，循環腫瘤細胞同PCR結合有助于對患者進行分層治療干預。

3.1.2晚期乳腺癌循環腫瘤細胞檢測 臨床普遍認為循環腫瘤細胞計數是轉移性乳腺癌的重要預后標志物，其數目可預測患者的無進展生存情況、生存期。邊莉等[13]學者提出，若是轉移性乳腺癌患者每7.5 ml外周血中的循環腫瘤細胞計數超過5個，則可判斷該類患者的預后較差。隨著臨床對于循環腫瘤細胞的進一步研究，對乳腺癌循環腫瘤細胞簇的認知逐漸加深，認為其可對單個循環腫瘤細胞的轉移風險進行判斷，且風險性高出23～50倍，乳腺癌患者的預后越差，循環腫瘤細胞簇數目越多。分析轉移性乳腺癌患者富集的循環腫瘤細胞，發現TP53基因突變最為常見，且會導致乳腺癌患者的預后變差。

3.2循環腫瘤細胞檢測與治療方案的選擇

3.2.1循環腫瘤細胞檢測同化療方案的選擇 循環腫瘤細胞檢測具有無創性，可對藥物治療的效果進行持續動態監測，便于進行隨訪和進一步的研究。在接受1個周期的化療后，乳腺癌患者的循環腫瘤細胞數目會出現改變，可對化療的短期療效進行判斷。通過對化療后循環腫瘤細胞檢測數目變化進行分析，可對化療方案進行調整，選擇更加合理的化療方案進行個體化治療，從而促進患者臨床療效的提高。

3.2.2循環腫瘤細胞檢測同HER-2靶向治療 在HER-2擴增型乳腺癌患者的標準治療中，曲妥珠單克隆抗體為其中的一部分，輔助曲妥珠單克隆抗體治療可獲得較多的獲益，可將微小殘余病灶消除，促使腫瘤耐藥性降低。循環腫瘤細胞作為代表性的微小殘余病灶，其數目的減少說明微小殘余病灶的減少；HER-2過度表達的循環腫瘤細胞在增殖過程中會出現HER-2表達改變（獲得或丟失）的情況，而HER-2陰性細胞更多是出現獲得HER-2表達，因此采用循環腫瘤細胞檢測技術可為HER-2靶向治療提供新的治療思路。

3.2.3循環腫瘤細胞檢測同內分泌治療 目前臨床尚未統一采用化療或內分泌治療激素受體為陽性的轉移性乳腺癌患者的量化指標，在循環腫瘤細胞數目指導下的一線治療選擇，如他莫昔芬、氟維司群聯合HSP90抑制劑具有較好的耐藥性和有效性，采用循環腫瘤細胞檢測技術可對內分泌治療耐藥機制進行分析，并為臨床治療策略的選擇提供參考。

3.3循環腫瘤細胞檢測在乳腺癌療效和預后評估中的作用

較多的乳腺癌患者由于在術后無可測量的病灶，因此不能有效評估輔助治療的效果。循環腫瘤細胞檢測可評估乳腺癌患者治療過程中的效果，同時可評估病情進展，對疾病進展加強控制。陳海濤等[14]在某一項研究中提到，治療后，每7.5 ml外周血中循環腫瘤細胞數目>5個的乳腺癌患者，同循環腫瘤細胞數目<5個的患者進行比較，病情進展率更高，且倍數>5倍，充分地說明了循環腫瘤細胞的存在可判斷臨床療效，兩者之間存在聯系。謝寧等[15]在《循環腫瘤細胞在40例晚期轉移性乳腺癌患者中的檢測意義》一文中寫道，CTC≥5個/7.5 ml的復發轉移性乳腺癌患者與CTC<5個/7.5 ml的患者進行比較，肝臟轉移、骨轉移、轉移灶>3處的陽性率更高，但前者的預后效果更差，較好地證明了上述觀點的真實性。

單海琳等[16]于《血循環腫瘤細胞檢測在中晚期乳腺癌療效評價及轉移監測中的應用》一文中提及，中晚期乳腺癌患者的CTC數目隨著化療周期的增加而不斷減少，CTC陰性乳腺癌患者在化療結束后3、6、9個月的轉移復發率均高于CTC陽性乳腺癌患者，較好地提示了循環腫瘤細胞檢測應用于轉移監測中具有較好的效果，可對乳腺癌患者的預后進行預測。

4小結

循環腫瘤細胞檢測技術對于乳腺癌個體化治療方案的實施具有良好的促進作用，但該檢測技術在臨床中的普及還存在以下解決的問題：①應用上皮細胞特異性抗原進行循環腫瘤細胞檢測，可能會導致出現上皮細胞-間充質轉化的腫瘤細胞遺漏；②RT-PCR技術對循環腫瘤細胞的破壞會影響其計數，無法進行表型分析；③循環腫瘤細胞數目過少促使臨床對標本量具有較高的需求，對臨床的可重復性操作造成限制。但是循環腫瘤細胞檢測技術的臨床應用價值仍較高，以后臨床研究中應注意解決上述問題，為乳腺癌患者提供理想的個體化治療方案，具有廣闊的應用前景。

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（收稿日期：2018-11-15 本文編輯：閆 佩）