老年心腦血管病影像學診斷與MTHFR基因多態性及同型半胱氨酸水平的相關性

李卓然 高詠璇 林楚瑩 秦琴保 梁廣鐵 闕志權 雷秀霞 江新青

廣州醫科大學附屬廣州市第一人民醫院1放射科，2檢驗科，3老年病科（廣州510180）

近年心腦血管疾病已成為我國發病率及死亡率最高的疾病之一［1］。隨著醫學的發展，各種先進診療技術如電子計算機斷層掃描（computed tomography，CT）/核磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）以及分子診斷技術的廣泛應用，使心腦血管疾病的早期診療成為可能。研究［2］發現高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocystinemia，HHcy）會引起血管內皮廣泛受損，血液雜質容易沉積在血管內而引起血管硬化及血管閉塞，從而誘發心腦血管疾病的發生，是動脈粥樣硬化與動脈硬化的獨立危險因素。相關研究結果［3］顯示：同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）每升高5 μmol/L 腦卒中風險升高59%，缺血性心臟病風險升高32%。體內Hcy 濃度除了受葉酸及B 族維生素等的影響外，還受一些代謝酶遺傳多態性的限制，而亞甲基四氫葉酸還原酶（methylene tetrahydrofolate reductase，MTHFR）是Hcy 代謝過程中最重要的調節酶，該基因的C677T 位點發生突變將會導致體內Hcy 水平增高從而誘發心腦血管疾病的發生［4］。本研究擬對筆者醫院收治的部分老年心腦血管疾病患者顱腦部CT/MRI 影像學、頸動脈內膜中層厚度（carotid intima-media thickness，IMT）的診斷結果及血漿Hcy 含量改變與MTHFR基因多態性的關系作回顧性分析，旨在為臨床早期預測心腦血管疾病的發生及對不同基因型的人群進行早期預防管理提供實驗依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2015年12月至2018年1月，在廣州醫科大學附屬廣州市第一人民醫院進行MTHFR基因多態性檢測的年齡≥60 歲的老年住院患者864例，其中男525例，女339 例，年齡（79.47 ± 9.30）歲。在864 例患者中排除：（1）慢性腎功能不全患者、接受腎臟移植患者；（2）甲狀腺功能亢進或甲狀腺功能減退患者；（3）急性肝功能受損患者；（4）惡性腫瘤患者；（5）近期服用甲氨蝶呤、茶堿、B 族維生素及葉酸患者后，被納入研究對象的患者共有294 例，均為年齡在65～89 歲范圍內，無親緣關系的患者，采集并記錄其頸動脈彩超影像、顱腦CT/MRI、冠心病病史等資料。本研究所涉及患者均已簽署知情同意書并符合倫理審核。

1.2 分組 根據1995年第4 屆全國腦血管病學術會議修訂的診斷標準，對已行顱腦部CT/MRI 檢查的864 例老年患者結合臨床資料分為兩組：腦梗死組（n=468），其中男331 例，女137 例，年齡（82.49 ± 8.23）歲；非腦梗死組（n=396），其中男194 例，女202 例，年齡（75.90 ± 9.24）歲。294 例患者根據2012年美國心臟協會冠心病（coronary heart disease，CHD）診斷指南分CHD 組（n=96）與非CHD 組（n=198）；排除40 例所需研究資料不全的患者，根據顱腦部CT/MRI 分腔隙性腦梗死（lacunar infarction，LI）LI 組（n=207）與非LI 組（n=47）；排除46 例無頸動脈彩超資料的患者，根據MTHFR 基因多態性分為3 組：CC 組（n=99）、CT 組（n=87）、TT 組（n=62）。

1.3 研究方法

1.3.1MTHFR基因多態性檢測 采集EDTA 抗凝血2 mL，然后進行全血DNA 抽提—PCR 擴增—雜交—掃片，記錄結果。MTHFR基因C677T 位點基因型分為：野生CC 型、雜合突變CT 型和純合突變TT 型。芯片試劑盒由上海BaiO 公司提供。

1.3.2 血漿Hcy 水平檢測 清晨空腹抽取靜脈血3～5 mL，4 000 r/min 離心5 min，采用AU5800全自動生化分析儀進行檢測，試劑由金斯爾公司提供。

1.3.3 顱腦部CT/MRI 檢查 CT檢查：采用Philips公司64 排螺旋CT 掃描機，掃描條件為120 kV，399 mAs，層厚、層間距均為5 mm，螺距為1.5 mm，FOV 為25.0 cm × 29.2 cm。常規平掃后，肘前靜脈注射對比劑行增強掃描，使用高壓注射器。顱腦CT 圖像見圖1。

圖1 顱腦CT 圖像Fig.1 Brain CT imaging pictures

MRI 檢查：采 用Philips Achieva1.5T MR 掃 描儀，采用常規自旋回波序列軸位T1W、T2W 和FLAIR序列。掃描參數：T1WI，TR 499 ms，TE 15 ms；T2WI，TR 3 567 ms，TE 100 ms；層厚6 mm，層間距0.5 mm，矩陣256×256。FLAIR序列，TR 6 000 ms，TE 120 ms。增強掃描參數同平掃T1WI，對比劑為Gd-DTPA，劑量0.1 mmol/kg 體質量，采用高壓注射器自肘靜脈注射。顱腦MRI 圖像見圖2。

圖2 顱腦MRI 圖像Fig.2 Brain MRI imaging pictures

1.3.4 頸動脈內膜中層厚度測量方法及頸內膜分級標準 專業醫師使用HP5500 彩色多普勒超聲儀（4～10 MHz 線陣式探頭），按標準操作規程測量頸動脈內膜中層厚度，通過測量血管內中膜厚度、血管腔直徑以及觀察血流情況等，判斷頸動脈血管狹窄程度，并參照2003年北美放射年會中超聲會議制定的診斷標準，將頸動脈內膜分為0～5級。見圖3。

1.4 統計學方法 使用SPSS 22.0 統計軟件，計量資料以表示，計數資料用百分比表示。計量資料采用t檢驗或非參數秩和檢驗，組間計量資料的比較若分布符合正態分布的采用t檢驗，相關性分析采用pearson 相關系數計算，不符合正態分布的數據采用非參數檢驗方法比較，相關性分析采用spearman 相關系數計算，計數資料采用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。采用Hardy-Weinberg（HWE）平衡檢驗進行群體遺傳分析，P＞0.05為符合HWE。

圖3 頸動脈內膜0～5 級彩色多普勒超聲圖像Fig.3 Color doppler ultrasound image of carotid intima 0～5 level

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg 平衡檢驗 864 例患者的基因檢測結果，通過卡方檢驗計算實際基因型和理論基因型頻數間的差異，結果顯示3 種基因型符合遺傳平衡定律（P＞0.05），說明選取的研究對象具有群體代表性、恒定性。見表1。

表1 MTHFR 基因型Hardy-Weinberg 平衡檢驗Tab.1 Hardy-Weinberg equilibrium test for MTHFR genotype

2.2 腦梗死組和非腦梗死組不同基因型占比比較 468 例腦梗死組患者CC 型、CT 型和TT 型3 種基因型所占百分率依次為43.38%、43.80%、12.82%；396 例非腦梗死組依次為56.82%、36.36%、6.82%，兩組患者各基因型經Pearson 行列表卡方檢驗，差異有統計學意義（χ2=18.438，P＜0.001）。見表2。另外，將兩組患者中存在MTHFRC677T 位點突變的基因型（CT 型+ TT 型）和野生型（CC 型）進行四格表卡方檢驗，差異有統計學意義（χ2=15.505，P＜0.001）。

2.3 CHD 組與非CHD 組結果分析

2.3.1 CHD 組與非CHD 組的MTHFR基因型及等位基因分組結果比較 從各基因型的頻率分布來看，CHD 組與非CHD 組的MTHFRC677T 基因構成差異有統計學意義（χ2=7.187，P＜0.05）；前者的T/C 等位基因頻率（109%）明顯高于后者（66%）（χ2=8.129，P＜0.05）。見表3。

2.3.2 CHD 組與非CHD 組患者血漿Hcy 水平比較 CHD 組與非CHD 組患者兩組間血漿Hcy 水平比較差異無統計學意義（Z=-0.496，P＞0.05）。兩組組內TT 型患者的血漿Hcy 水平均顯著高于CC型（Z=-2.032，Z=-2.630；均P＜0.05）；而CT型患者與CC 型患者的血漿Hcy 水平比較差異則無統計學意義（Z=-1.310，Z=-0.496；均P＞0.05），但CT型患者血漿Hcy水平高于CC型患者。見表4。

表2 腦梗塞組和非腦梗塞組的MTHFR 基因型分布Tab.2 Genotype frequency distribution of MTHFR genotype in cerebral infarction group and non-cerebral infarction group例（%）

2.4 LI 組與非LI 組結果分析

2.4.1 LI 組與非LI 組的MTHFR基因型及等位基因分組結果比較 從各基因型的頻率分布來看，LI組與非LI 組相比差異有統計學意義（χ2=12.967，P＜0.05）；前者的T/C 等位基因頻率（114%）明顯高于后者（54%）（χ2=12.449，P＜0.05）。見表3。

2.4.2 LI 組與非LI 組患者的血漿Hcy 水平比較 LI 組的血漿Hcy 水平與非LI 組相比差異無統計學意義（Z=-1.311，P＞0.05）。兩組組內的各基因型組患者的血漿Hcy水平比較差異均有統計學意義（χ2=183.338，χ2=138.872，均P＜0.05）；進一步比較發現TT 型、CT 型患者的血漿Hcy 水平均顯著高于CC 型（Z=-12.841，Z=-5.694；Z=-3.326，Z=-3.976，均P＜0.05）。見表4。

表3 兩疾病組和對照組的MTHFR 基因型分布結果比較Tab.3 Genotype frequency distribution of MTHFR genotype in two diseases groups and control groups例

表4 兩疾病組和對照組的血漿Hcy 水平結果比較Tab.4 Comparison of plasma Hcy levels in two diseases groups and control groups ±s，μmol/L

表4 兩疾病組和對照組的血漿Hcy 水平結果比較Tab.4 Comparison of plasma Hcy levels in two diseases groups and control groups ±s，μmol/L

注：與TT 型經非參數秩和檢驗，*P ＜0.05

組別血漿Hcy 水平CHD（n=294）CT 19.09±6.20 19.20±8.80 TT 21.17±10.16 21.15±7.94 CC 15.72±3.76*17.58±5.22*LI（n=254）CHD（n=96）非CHD（n=198）P 值LI 組（n=207）非LI 組（n=47）P 值總18.77±7.60 18.93±7.39＞0.05 18.57±6.93 17.54±6.80＞0.05 18.17±5.99 21.37±12.00 21.09±9.35*18.19±4.53*17.15±5.16*16.11±4.14*

2.5 不同基因型頸動脈內膜中層厚度（IMT）及血漿Hcy 水平的比較 IMT 與血漿Hcy 水平的相關性分析結果顯示兩者無明顯相關性（r2=0.016，P＞0.05）；各基因型組間的IMT 差異均無統計學意義（χ2=2.723，P＞0.05），另各基因型組間頸動脈內膜分級構成差異亦無統計學意義（χ2=4.919，P＞0.05）。見表5。

各基因型組血漿Hcy 水平差異有統計學意義（χ2=10.129，P＜0.05），TT 型患者血漿Hcy 水平顯著高于CC 型患者（Z=-3.206，P＜0.05），CT 型患者血漿Hcy 水平高于CC 型，但差異無統計學意義（Z=-1.276，P＞0.05）。見表6。

3 討論

人體正常生理狀態下空腹血漿Hcy 水平為5 ～15 μmol/L，當空腹血漿Hcy 水平持續高于15 μmol/L時就稱為高同型半胱氨酸血癥（HHcy）。血漿中Hcy 濃度水平受遺傳因素、年齡、雌激素水平、營養狀況、藥物及疾病等多種因素影響［5］，其中，遺傳因素是影響HHcy 水平的重要因素，而MTHFR是Hcy 代謝最重要的調節酶，C677T 位點堿基純合突變可作為HHcy 一個重要的遺傳因素［6］。據文獻［7］報道：MTHFRC677T 的TT 型突變可使正常酶活性降低70%，從而顯著提高血漿內Hcy 水平。本研究結果顯示，各心腦血管疾病組的突變純合子TT 基因型平均Hcy 水平均顯著高于野生CC 型，與以往研究報道一致［8］。說明TT 型基因突變確實會導致MTHFR 調節酶的活性減低。

表5 不同基因型頸動脈內膜分級情況的比較Tab.5 Comparison of carotid intima level in different genotype 例（%）

表6 不同基因型頸動脈內膜厚度和血漿Hcy 水平的比較Tab.6 Comparison of carotid intima-media thickness,plasma Hcy levels in different genotype ±s

表6 不同基因型頸動脈內膜厚度和血漿Hcy 水平的比較Tab.6 Comparison of carotid intima-media thickness,plasma Hcy levels in different genotype ±s

注：與TT 型經非參數秩和檢驗，*P ＜0.05

基因型CC（n=99）CT（n=87）TT（n=62）P 值頸動脈內膜中層厚度（cm）0.120 6±0.008 9 0.118 4±0.009 4 0.123 8±0.030 0＞0.05血漿Hcy 水平（mmol/L）17.15±5.00*19.79±8.71 21.36±9.41＜0.05

冠心病（CHD）是指冠狀動脈血管發生動脈粥樣硬化病變而引起血管腔狹窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或壞死而導致的心臟病，是動脈粥樣硬化致器官病變的最常見的類型。黃暉等［9］認為血漿中Hcy 水平與冠狀動脈病變的復雜程度密切相關，TANNE 等［10］研究發現血漿中高Hcy 水平與穩定性冠心病患者發生缺血性事件的風險相關；然而另一項Meta 分析［11］認為血漿中Hcy 水平與CHD的發病風險無相關關系，用葉酸和維生素B12 治療并未發現可以降低心血管疾病高危人群的發病風險。本研究結果顯示，CHD 組血漿Hcy 濃度水平與非CHD 組相比差異無統計學意義，提示在老年群體中，血漿Hcy 水平與冠心病發病風險未見直接相關關系。而WALD 等［12］從基因層面研究發現MTHFR基因C677T 基因突變純合子TT 基因型人群發生冠狀動脈疾病的風險更高，尤以低葉酸攝入的人群為著。本研究結果中也顯示CHD 與非CHD 組的MTHFR基因構成分布及T/C 等位基因頻率比較差異均有統計學意義，提示：攜帶T 等位基因的患者更容易發生CHD，MTHFRC677T 基因突變純合子TT 型與CHD 發病風險密切相關。

腦小血管病（CSVD）主要以腦內微小動脈血管病變為主，是臨床上常見的隨年齡增長而伴發的一種疾病。CSVD 在MRI 上主要表現為腔隙性腦梗死（LI）、腦白質病變、陳舊性腦微出血、腦萎縮等。王立俠等［13］認為引起腦小動脈內皮損傷所需的Hcy 濃度低于在主動脈中引發同類效應所需的濃度，也就是說腦小血管對HHcy 水平更為敏感。有學者研究發現［14］，Hcy 與CSVD 的預后與風險轉歸密切相關，血漿Hcy 水平越高，CSVD 患者的認知功能評分越低。JEON 等［15］研究也表明，TT型與血漿中高Hcy 水平有關，與動脈粥樣硬化性大血管病及腦小血管病的發病無關，但RUTTEN等［16］發現，T 等位基因與LI 及腦白質病變均有關，且TT 型與LI 的發病具有強關聯性。本研究結果顯示，在腦小血管病中，LI 組與非LI 組之間的血漿Hcy 水平比較差異無統計學意義，提示在老年群體中血漿Hcy 水平與CVSD 無相關關系；但LI 組與非LI 組的TT 等位基因分布及T/C 等位基因頻率比較差異有統計學意義，提示攜帶T 等位基因者LI 的發生風險增加。

頸動脈內膜中層厚度（IMT）是動脈粥樣硬化的早期表現，頸動脈硬化及硬化程度可用來預測心腦血管疾病的發生風險。姜紅霞等［18］在校正了性別、年齡、高血壓、糖尿病等因素后，認為HHcy與頸動脈狹窄程度密切相關。另外，趙成敏等［19］研究表明在HHcy 人群中，血漿Hcy 水平與IMT 呈明顯的正相關關系。CATENA 等［20］發現血漿Hcy水平與頸動脈斑塊發生風險有關；聶穎等［21］認為血漿Hcy 水平與頸動脈斑塊的分布與程度有關；吳慶慶等［22］研究表明MTHFRC677T 基因突變純合子TT 型會導致較高的IMT 和頸動脈斑塊發生率。但李振洲等［23］則認為MTHFR基因多態性突變對頸動脈粥樣硬化無直接致病關系。本研究結果顯示，血漿Hcy 水平與IMT 未見相關關系；MTHFR基因多態性C677T 基因突變純合子TT 型對頸動脈粥樣硬化的致病性及嚴重程度均未見直接相關關系，與李振洲等［22］的研究結果一致。

另外，本研究結果顯示，腦梗死組MTHFR基因TT 型和CT 型患者比例顯著高于非腦梗死組（P＜0.01），說明MTHFRC677T 突變與腦梗死的發生密切相關，與文獻［24-25］報道一致。

本研究結果顯示：在CHD 和LI 分組中，疾病組和非疾病組的血漿Hcy 水平差異均沒有統計學意義，可能與本研究入選病例年齡普遍較大、Hcy水平普遍較高有關；另外，本研究還存在一些不足之處，由于本研究研究對象為老年人群，受患者年齡和所需影像學檢查數據等因素的限制，故最后能滿足研究所需的完整病案資料的病例數較少，在864 例老年患者中只篩選出294 例，所以還缺乏大數據支持。同時本研究未對CHD 和LI 并發病例進行單獨討論，對患多種疾病病例的分析可能還不夠全面。后續還將進一步擴大觀察病例數和年齡段、細化入選對象、建立回歸分析模型，并對影像學數據作進一步的量化處理以期得到更有效、更精準的實驗數據。

近年，精準醫學已得到學者們的高度重視，基因檢測作為精準醫學的重要組成部分，有望進一步結合臨床影像學改變而助力預防醫學發展，也就是說可通過對不同基因型的人群實施疾病的早期預防性管理、個體化用藥，以達到降低心腦血管疾病的發生風險和致殘風險的目的。