19A-ST320肺炎鏈球菌引起兒童急性中耳炎的實驗室及臨床特征分析*

雷 磊，李 倩，賈 虎

(延安大學附屬醫院 a.耳科；b.超聲科，陜西延安 716000)

急性中耳炎(acute otitis media，AOM)是中耳黏膜的急性化膿性炎癥，好發于嬰幼兒，治療不及時可導致患者鼓膜穿孔引起患耳流膿及聽力下降。肺炎鏈球菌是AOM最常見的致病菌之一，19A-ST320肺炎鏈球菌是目前最常見的血清及序列分型，在未接種7價肺炎球菌疫苗(pneumococcal 7-valent conjugate vaccine，PCV7)的人群中，該類型所占比例更高[1-3]。既往研究表明19A-ST320肺炎鏈球菌具有高毒性和較強的抗生素抗性，即使使用高劑量的β-內酰胺抗生素進行治療，19A-ST320肺炎鏈球菌引起的兒童AOM相關癥狀持續時間也較長[4-5]。本研究旨在探究19A-ST320肺炎鏈球菌引起的兒童AOM的臨床特征及抗菌治療效果。

1材料與方法

1.1 研究對象 收集2013年12月～2016年11月期間于延安大學附屬醫院住院治療的AOM患兒的中耳液(middle ear fluids，MEF)用于細菌培養，采集前所有患兒均未接受抗生素治療。鼓膜穿刺由耳鼻咽喉科醫師判斷并執行；自發性鼓膜穿孔的患者，在穿孔24 h內獲得拭子。抗生素使用史被定義為在招募事件之前的3個月內接觸過抗生素。通過審查兒童初級保健者提供的病歷來獲得兒童的免疫接種記錄。本研究共納入117例檢出肺炎鏈球菌菌株的患兒，根據血清分型和多位點序列分型將所有受試者分為19A-ST320組(69例)和非-19A-ST320組(48例)。

1.2 試劑和儀器 哥倫比亞血平板(重慶龐通公司)；VITEK-2全自動微生物分析儀(法國梅里埃公司)，DM2000顯微鏡(德國徠卡公司)，PCR擴增儀(美國伯樂公司)，棋盤式分型系統試劑盒(丹麥國家血清研究所)，QIAamp DNA Mini kit核酸提取試劑盒(德國凱杰公司)，肺炎鏈球菌血清分型引物[生工生物(上海)股份有限公司]，Taq DNA聚合酶(美國賽默飛世爾科技有限公司)等。

1.3 方法

1.3.1 細菌分離鑒定：用無菌拭子對每個MEF樣品進行取樣并保存在瓊脂凝膠中，將其置于微生物實驗室進行培養。用標準微生物學方法鑒定肺炎鏈球菌分離株，包括革蘭氏病菌形態學、光學敏感性、膽汁溶解度、抗原性檢測及生物化學方法。

1.3.2 血清分型檢測：采用特異性血清莢膜膨脹試驗法檢測肺炎鏈球菌的血清分型，挑取單菌落制成菌懸液(濃度約為0.5麥氏單位)，取3 μl放置于載玻片上，分別加入3 μl縱列和橫行分型血清池，與菌懸液充分混勻，再加入一接種環0.1 g/dl的亞甲藍溶液與抗血清混勻1 min，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察是否有莢膜或凝集出現。

1.3.3 多位點序列分型(multilocus sequence types，MLST)檢測：MLST引物和方法條件參見http：//spneumoniae.mlst.net，以肺炎鏈球菌基因組的7個管家基因(aroE，gdh，gki，recP，spi，xpt和ddl)作為目標基因進行PCR擴增，擴增產物進行測序。序列分析使用DNA star軟件，將序列提交至MLST數據庫(http：//spneumoniae.ml-st.net)可獲得相應的肺炎鏈球菌序列型(sequence type，ST)。

1.3.4 藥物敏感試驗：按2018年CLSI推薦的MIC法和E-test法進行[6]。采用法國梅里埃VITEK-2全自動微生物分析儀進行試驗。判斷標準：按CLSI 2018進行判斷。

2結果

2.1 一般臨床資料 本研究所收集的MEF樣本共來自117例AOM患兒，其中男性59例(50.4%)，女性58例(49.6%)；中位年齡為39.9個月(范圍為4～71月)，其中>60個月以上兒童的有24例(20.5%)，25～60個月的兒童有52例(44.4%)，13～24個月的兒童有28例(23.9%)，≤12個月的兒童有13例(11.1%)；通過鼓膜穿刺獲得標本55例(47.0%)，通過收集從耳朵排出的膿液獲得標本62例(53.0%)。

2.2 血清型分析及MLST分析 本組樣本共檢出8種血清型，包括19A，19F，3， 23F，14，15A，35B和6B，其中19A最常見，共有82例，占70.1%；共檢出21種序列型，包括ST180，ST236，ST271，ST320，ST1464，ST7123，ST83，ST873，ST2652，ST3111，ST3164，ST1465，ST8525，ST13，ST2108，ST81，ST242，ST76，ST90，ST63和ST558，其中以ST320最常見，共73例，占62.4%。將兩種分型方式相結合，所有樣本中共有19A-ST320肺炎鏈球菌分離株69例(59.0%)，非-19A-ST320肺炎鏈球菌分離株48例(41.0%)。

2.3 兩組臨床特征比較 見表1。兩組患兒在發病年齡、發病年份及鼓膜自發性破裂發生率方面的差異均具有統計學意義(均P<0.05)，19A-ST320組AOM患兒年齡分布較非-19A-ST320組更低，2013～2014年發病患兒比例更低，鼓膜自發性破裂發生率更高，其差異均有統計學意義(均P<0.05)。兩組在性別、疫苗接種、抗生素使用、發熱時長、乳突炎及肺炎發病率方面的差異無統計學意義(均P>0.05)。

2.4 抗生素敏感性 見表2。本研究所有菌株對左氧氟沙星、莫西沙星和萬古霉素均敏感；對紅霉素和甲氧芐啶/磺胺甲惡唑的耐藥率分別為98.29%和85.47%；對青霉素的耐藥率為21.37%；對阿莫西林和頭孢噻肟的耐藥率分別為67.52%和24.79%；85株肺炎鏈球菌分離株(72.6%)對至少一種β-內酰胺抗生素具有抗性，108珠肺炎鏈球菌分離株(92.3%)對多種藥物均具有抗性。與非-19A-ST320組比較，19A-ST320組分離株對青霉素、阿莫西林、頭孢噻肟和甲氧芐啶/磺胺甲惡唑的敏感度更低，其差異有統計學意義(χ2=4.070～23.019，均P<0.05)；對氯霉素的敏感度更高，其差異有統計學意義(χ2=15.718，P=0.000)。19A-ST320組較非-19A-ST320組具有更高的β-內酰胺抗生素抵抗性和多藥耐藥性(χ2=25.057，12.344，均P<0.001)。

表1 兩組臨床特征比較分析[n=117，n(%)]

注：*Fisher精確概率法。

表2 抗生素敏感性分析[n(%)]

注：*Fisher精確概率法，S：敏感，R：耐藥，I：中介。

3討論流行病學調查結果顯示19A-ST320肺炎鏈球菌在許多國家AOM患者中普遍存在[1-3]，既往研究表明在AOM兒童中也觀察到19A-ST320肺炎鏈球菌的存在[5]。本研究結果顯示血清為19A、序列型為ST320的肺炎鏈球菌分型是導致AOM最常見的血清和序列分型，19A-ST320肺炎鏈球菌分離株在所有樣本中所占比例最高，為59%。這提示對于AOM患兒，尤其是未確定細菌分型的患兒，選擇對19A-ST320肺炎鏈球菌敏感的抗生素進行治療可能是比較可行的。

本研究比較了19A-ST320組與非-19A-ST320組患兒的臨床特征，結果顯示19A-ST320組AOM患兒發病年齡更小，鼓膜自發性破裂率更高。鑒于既往研究報道1～2歲是兒童AOM的高發期，如不及時治療，其發展為慢性中耳炎的風險更高[7]。這提示對于年齡較小的AOM患者，更需要明確致病菌的分型，以便選擇更合適的抗生素治療方案，這對改善患者預后至關重要。

隨著抗生素的廣泛使用，肺炎鏈球菌對青霉素的敏感性逐漸下降、耐藥率逐漸增加。研究表明兒童的耐藥情況比成人更嚴重[8]，但隨著PCV7的廣泛應用及近年來抗生素臨床使用的逐漸合理化，肺炎鏈球菌的耐藥性也有所變化[9]。目前有很多對下呼吸道感染的肺炎鏈球菌耐藥監測研究[10-12]。本研究中所涉及的菌株對左氧氟沙星、莫西沙星和萬古霉素均敏感；對紅霉素、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑耐藥率均處于較高水平，約72.6%分離株對至少一種β-內酰胺抗生素具有抗性，92.3%對多種藥物具有抗性，這與既往研究大致相符。同時本研究還比較了19A-ST320肺炎鏈球菌菌株與非-19A-ST320肺炎鏈球菌菌株的藥物敏感性；結果顯示與非-19A-ST320組比較，19A-ST320組分離株對青霉素、阿莫西林、頭孢噻肟和甲氧芐啶/磺胺甲惡唑的敏感度均更低，對氯霉素敏感性較高；19A-ST320組較非-19A-ST320組具有更高的β-內酰胺抗生素抗性和多藥耐藥性。

綜上，由于AOM患兒中高耐藥性的19A-ST320肺炎鏈球菌感染比例逐漸提高，兒童宜按時接種肺炎球菌結合疫苗。癥狀嚴重的患兒應適當進行鼓膜穿刺、確定致病菌分型以控制病情；還應對19A-ST320肺炎鏈球菌進行監測以調整預防和治療策略。最后，本研究存在一定的局限性：本研究僅納入獲得MEF樣本的患兒，癥狀較輕的患兒沒有被納入研究，這對研究結果可能有一定的影響。