伯氏瘧原蟲絲/蘇氨酸磷酸酶6抗血清對原蟲有性階段發育抑制作用的研究①

孫 林 洪明陽 曹雅明 朱曉彤 崔立旺

(中國醫科大學免疫學教研室，沈陽 110122)

瘧疾是經蚊媒傳播的寄生原蟲感染性疾病。迄今為止，全球仍有1.2億瘧疾患者，3億無癥狀攜帶者，每年仍有近百萬非洲兒童死于瘧疾感染[1]。因此，亟待研發安全有效的疫苗以在全球范圍內防治瘧疾。瘧疾疫苗主要包括紅前期、紅內期和傳播阻斷疫苗(Transmission blocking vaccines,TBVs)。其中，TBVs由于其候選抗原表達于蚊階段原蟲，不受人體免疫系統選擇壓力影響，故具有低多態性和良好的免疫原性[2]，被廣泛認為是一種在瘧疾流行地區降低瘧疾傳播的有效策略。現已發現多個瘧疾TBVs候選抗原，如配子體和配子表面蛋白P48/45與P230，合子和動合子期表面蛋白P25和P28，蚊階段原蟲表面蛋白HAP2(Hapless 2 protein)[3-5]。盡管上述TBVs候選抗原具有一定的傳播阻斷效應，但仍不能完全阻斷瘧原蟲傳播。因此，篩選并研發新的TBVs候選抗原將為阻斷瘧疾在流行區的傳播提供必要的理論依據。

瘧原蟲復雜的生活史包括人體內的無性裂體增殖和按蚊體內的有性生殖兩個階段。其中，有性發育階段始于雌性按蚊吸食瘧原蟲感染患者血液。雄/雌配子體隨同血液進入蚊胃。在蚊胃內環境刺激下，雄配子體經歷3次有絲分裂，并通過“出絲”破裂宿主紅細胞而發育為8個雄配子。雄/雌配子結合成合子，進而發育成動合子。動合子穿越蚊胃壁發育成卵囊，隨后發育為子孢子。子孢子進入蚊唾液腺，隨按蚊再度叮咬感染新的宿主[6]。多種蛋白磷酸酶(Protein phosphatases,PPs)和蛋白激酶(Protein kinases，PKs)參與瘧原蟲有性階段發育中的信號轉導調控[7]。因此，PPs和PKs為小分子藥物的有效作用靶位，同時也是瘧疾TBVs潛在的候選抗原[8]。

蛋白絲/蘇氨酸磷酸酶(Serine/threonine protein phosphatase)參與細胞分裂、轉錄、翻譯、凋亡和RNA剪接等細胞發育過程。蛋白磷酸酶6(PPP6)屬于PP2A家族，在調控細胞功能過程中發揮重要作用[9,10]。與 Mg2+依賴性磷酸酶家族的其他成員一樣，PPP6能夠將無機底物以及多肽去磷酸化。此外，PPP6蛋白磷酸酶活性可被岡田酸抑制[11-13]。氨基酸序列預測分析顯示，伯氏瘧原蟲PPP6的催化結構域與磷酸化絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶(Phosphoserine and phosphothreonine residues phosphatases,PPPs)其他成員高度同源且保守[14]。鑒于PPPs在瘧原蟲生活周期中具有不可替代的作用，其可作為瘧疾防治的潛在靶位。本項目采用生物信息學方法選取伯氏瘧原蟲PPP6(PbANKA_041210)蛋白，擴增其編碼基因，構建原核表達載體，表達并純化PPP6重組蛋白。免疫小鼠后，通過ELISA和Western blot方法評估PPP6蛋白的免疫原性和免疫反應性，并通過體內外傳播阻斷實驗評估抗PPP6免疫血清的傳播阻斷效果，以期為研制新型高效瘧原蟲TBVs提供理論依據。

1 材料與方法

1.1實驗材料 6～8周齡雌性BALB/c小鼠購自北京實驗動物研究所；Pb.ANKA 2.34原蟲及基因組DNA(gDNA)由中國醫科大學免疫學教研室保存。KOD-Plus-Neo(Toyobo)；Rosetta(DE)competent cell、限制性內切酶BamHⅠ和NotⅠ、T4 DNA連接酶、TaKaRa Agarose Gel DNA Extraction Kit v4.0(TaKaRa)；快速質粒小提試劑盒(天根)；LB Broth(Solarbio)；氨芐青霉素(Genview)；IPTG、Tween-20(北京鼎國)；HisPurTMNi-NTA Magnetic Beads、SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate、Goat anti-Mouse IgG(H+L)Secondary Antibody,HRP、6×His Tag Monoclonal Antibody、ECL試劑盒 (Thermo Fisher Scientific)；anti-tubulin Ⅱ antibody(Abcam)；1640培養基(Gibco)；胎牛血清(Hyclone)；脫脂奶粉(BD DifcoTMSkim Milk)；弗氏佐劑(Sigma-Aldrich)；Pbs21抗體由教研室自己制備。

1.2實驗方法

1.2.1PPP6(PlasmoDB ID:PbANKA_041210)基因合成及原核表達載體構建 以Pb.ANKA原蟲gDNA為模板，采用引物:PPP6-BamHⅠF:5′-cgcggatccACTAGGGGAGACGAAAAAAAATGG-3′；PPP6-NotⅠ R:5′-ttttccttttgcggccgcTAAAAAATACGGAAT-GGTCGC-3′，擴增PPP6基因功能區域。將上述PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠純化后，經BamHⅠ和NotⅠ限制性內切酶37℃孵育2 h，純化回收。pET32a(+)原核表達載體采用BamHⅠ和NotⅠ雙酶切后回收純化。采用T4連接酶16℃過夜連接pET32a(+)載體和PPP6-DNA片段酶切產物，構建pET32a(+)-PPP6表達載體。連接產物轉化至宿主菌Rosetta(DE)Competent Cell，菌落PCR鑒定選取陽性克隆后，質粒小提，送華大基因公司測序。采用MEGA7.0軟件，將測序結果與PlasmoDB(http://www.plasmodb.org)數據庫中PPP6基因組DNA序列進行比對分析。

1.2.2重組蛋白的表達、純化與實驗動物免疫 選取pET32a(+)-PPP6陽性克隆菌液加入LB培養基中，經1 mmol/L IPTG誘導后20℃過夜搖菌表達重組蛋白，采用HisPurTMNi-NTA Magnetic Beads純化PPP6-his重組蛋白并檢測蛋白濃度。將純化的重組蛋白用10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，使用25 V、30 min 半干法轉膜條件，使用5%脫脂奶粉封閉，4℃過夜。將封閉后的PVDF膜用TBST漂洗3次后，采用6×His Tag Monoclonal Antibody(1∶2 000)孵育PVDF膜，室溫1 h。用TBST洗滌3次，每次10 min，采用HRP標記的山羊抗小鼠IgG二抗孵育PVDF膜，室溫1 h，TBST洗滌6次，每次5 min。采用ECL發光方法，熒光圖像分析系統中檢測結果。實驗動物免疫方法為6～8周齡BALB/c雌性小鼠隨機分為2組，每組5只，組1免疫PPP6重組蛋白(PPP6)；組2為PBS對照組(PBS)。隔周皮下免疫一次，共免疫3次，初次免疫重組蛋白(50 μg/只)與完全弗氏佐劑充分混合，二免和三免中重組蛋白與不完全弗氏佐劑混合。

1.2.3血清特異性抗體水平檢測 用溶解在碳酸鹽緩沖液的PPP6重組蛋白(10 μg)包被96孔酶標板，4℃過夜。采用含1%BSA的PBST封閉，37℃ 1 h，PBST清洗3次。以PBS緩沖液連續倍比稀釋免疫后不同時間點小鼠抗PPP6免疫血清，每孔100 μl，37℃孵育2 h，PBST清洗3次后，加入1∶5 000 倍稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG，孵育1 h，PBST清洗后，加入底物鄰苯二胺和過氧化氫進行顯色，酶標儀檢測450 nm處OD值。

1.2.4抗PPP6免疫血清對原蟲有性發育階段抑制效果觀察 采用1×107個Pb.ANKA感染BALB/c小鼠，待感染后第3天，感染率達5%時取10 μl小鼠尾血與40 μl動合子培養基(1640培養基+25%胎牛血清)混合，并將抗PPP6免疫血清按1∶5稀釋加入動合子培養基中，放置于25℃培養箱中培養15 min 后，取1 μl涂片，并于10 min內計數40個視野，計數配子體出絲的數目。取10 μl血液置于90 μl 動合子培養液中，加稀釋的重組蛋白/對照免疫的小鼠血清(1∶5)。瘧原蟲在19℃培養24 h。用抗Pbs21抗體固定和標記培養物，在熒光顯微鏡下計數動合子數目并計算動合子形成率。采用1×107個Pb.ANKA感染BALB/c小鼠，待感染后第3天，感染率達到3%，放置于饑餓12 h的雌性按蚊蚊籠中吸食血液30 min，去除未吸血的按蚊，吸血后的按蚊于10 d后解剖計數蚊胃壁的卵囊數及蚊感染率。

1.3統計學方法 應用GraphPad Prism 6.0統計軟件對實驗數據進行統計分析，原蟲血癥的組間比較采用Student′st檢驗，配子體出絲和動合子轉化率實驗組間比較采用Mann-Whitney U檢驗，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1pET32a (+)-PPP6載體構建及其表達和純化 本研究中成功構建了pET32a (+)-PPP6原核表達載體，并轉至大腸桿菌Rosetta(DE)Competent Cell表達系統，加入1 mmol/L IPTG，經16℃誘導20 h 后，SDS-PAGE電泳分析可見大量可溶性PPP6重組蛋白(約38 kD)的表達。使用HisPurTMNi-NTA Magnetic Beads柱純化重組蛋白，并對洗脫及透析后的樣品進行Western blot檢測，可清晰看到目標蛋白條帶約38 kD，大小符合目的蛋白分子量。其蛋白純度>85%，濃度可達到1 mg/ml，見圖1A、B。ELISA結果顯示，抗PPP6免疫血清抗體滴度為1∶3 200，見圖1C。

2.2抗PPP6免疫血清對雄配子體出絲的影響 為觀察抗PPP6免疫血清傳播阻斷效果，本研究首先通過體外實驗觀察抗PPP6免疫血清對雄配子體出絲的抑制作用。與PBS免疫血清處理的對照組相比，1∶5倍稀釋的抗PPP6免疫血清可使配子體出絲數目減少62.5%(P<0.000 1)，提示抗PPP6免疫血清可影響雄配子出絲功能，見圖2。

2.3抗PPP6免疫血清對體外動合子期原蟲發育的影響 如圖3A所示，1∶5倍稀釋的抗PPP6免疫血清與原蟲進行體外動合子培養24 h后可使動合子數目顯著下降65.3% (P<0.000 1)。動合子轉化率觀察顯示，1∶5倍稀釋的抗PPP6免疫血清可顯著抑制動合子轉化率，使動合子轉化率下降42.07%(P<0.000 1，圖3B)。上述結果提示抗PPP6免疫血清可體外抑制動合子的形成和分化。

2.4抗PPP6免疫血清對囊合子形成數量的影響 采用100 μl抗PPP6免疫血清尾靜脈輸入Pb.ANKA原蟲感染3 d的BALB/c小鼠體內，1 h后對感染小鼠進行蚊飼1 h，10 d后計數蚊胃內囊合子數量。本研究發現，吸食抗PPP6免疫血清過繼轉移組小鼠血液的按蚊胃內囊合子形成顯著減少(P<0.000 1，圖4)。與對照組相比，蚊感染率下降8.39%，而蚊胃內囊合子密度減少68.91%，見表1。上述結果提示抗PPP6免疫血清可抑制蚊體內囊合子形成。

圖1 PPP6重組蛋白表達檢測Fig.1 Expression of recombinant PPP6 proteinNote: A.The coomassie brilliant blue staining result of recombinant PPP6 protein.B.Western Blot detection of recombinant PPP6 protein by using 6×His Tag Monoclonal Antibody (1∶2 000 dilutions).Arrows indicate recombinant PPP6 proteins.C.ELISA assay for antibody titer detection of anti-PPP6 serum.*.P<0.05;**.P<0.01;***.P<0.001.

圖2 抗PPP6免疫血清對雄配子體出絲的影響Fig.2 Effect of anti-PPP6 serum on male gametocyte exflagellationNote: PBS.PBS immunized group;PPP6.Recombinant Plasmodium berghei PPP6 protein immunized group.****.P<0.000 1.tubⅡ.anti-tubulin Ⅱ antibody.Arrows indicate microgamete exflagellation.

圖3 抗PPP6血清對動合子數目和形成率的影響Fig.3 Effect of anti-PPP6 serum on ookinete number and ookinete conversion rateNote: A.The effect of anti-PPP6 serum on ookinete number.B.The effect of anti-PbPPP6 serum on ookinete conversion rate.PBS.PBS immunized group;PPP6.Recombinant Plasmodium berghei PPP6 protein immunized group.****.P<0.000 1.P21.Anti-Pbs21 mAb.

圖4 抗PPP6血清對囊合子形成的抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of anti-PPP6 serum on oocysts formationNote: PBS.PBS immunized group;PPP6.Recombinant Plasmodium berghei PPP6 protein immunized group.****.P<0.000 1.M1,M2 and M3 represents three times biological replicates.Right panels are representative oocysts′ figures from mosquito midgut of PBS and PPP6 group,respectively.

表1 抗PPP6免疫血清傳播阻斷效果Tab.1 Transmission blocking effect of anti-PPP6 serum

Note：1)P<0.05 for comparisons between the experimental group and the control group.a.The prevalence of infection was calculated by the number of mosquitoes with oocysts/total mosquitoes dissected in each group×100%；b.The percent reduction of prevalence was calculated as % mean prevalencecontrol-% mean prevalencerPb51；c.Mean number of oocysts per mosquito midgut；d Standard error of the mean；e.The percent reduction in oocyst intensity was calculated as (mean oocyst intensityPBS-mean oocyst intensityPPP6)/mean oocyst intensityPBS×100%.

3 討論

蛋白磷酸化與去磷酸化是真核細胞信號轉導的共同通路，其動態變化幾乎涉及從胚胎發育到個體成熟的所有過程，包括細胞的癌變和凋亡[15]。磷酸化與去磷酸化的平衡主要由PKs和PPPs調控。其中PKs的研究目前已經取得一定成果，并被普遍認為是抗瘧重要靶位，關于瘧原蟲PPPs的研究近幾年也已成為熱點。根據氨基酸序列的同源性、結構特征和催化機制的不同,PPP分為三個家族:PPPs、磷酸化酪氨酸蛋白磷酸酶(Phosphotyrosine residues phosphatases,PTPs)和 Mg2+依賴的磷酸化絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶(Mg2+-dependent phosphoserine and phosphothreonine residues phosphatases,PPMs)。PPPs由PP1、PP2A、PP2B、PP5和PP7 等亞家族組成[16]。PPP6屬于PP2A家族，其研究尚處于起步階段。本研究中，我們選取伯氏瘧原蟲絲/蘇氨酸磷酸酶PPP6蛋白，探討其免疫血清對瘧原蟲有性階段生長發育的影響[12]。

經典的TBVs候選抗原，如:配子受精前期靶抗原P45/48、P230，受精后期靶抗原P25、P28和 蚊 蟲 中 腸 靶 抗 原HAP2均為原蟲有性階段表面蛋白。P25和P28為動合子表面蛋白，介導動合子侵入胃壁上皮細胞[17-19]。Pvs25已經進入了Ⅰ期臨床試驗，Pvs25疫苗可減少80%的卵囊形成，并降低20%～30% 的按蚊感染率，但其傳播阻斷效果未達到100%[20]。本課題組前期研究發現，PPP6蛋白主要表達在原蟲有性發育階段(結果未顯示)。本研究中，采用PPP6重組蛋白免疫后，ELISA實驗檢測發現小鼠血清中抗PPP6特異性抗體水平顯著升高。同時，Western blot結果顯示抗PPP6免疫血清可以特異性結合內源性PPP6蛋白。上述實驗結果提示伯氏瘧原蟲PPP6重組蛋白免疫后的抗血清具有良好的免疫原性和抗原性，為其作為TBVs候選抗原提供了理論基礎。抗PPP6免疫血清在體外可顯著抑制配子體出絲，與對照組相比，出絲數量減少62.5%，提示其可抑制雄配子體發育，并影響后續發育階段中的雄/雌配子體受精過程。前期研究中發現，PPP6蛋白在有性發育階段高表達，并定位于配子體和動合子期原蟲胞漿膜內側。由于有性階段原蟲胞膜的高通透性可使免疫血清中特異性抗體進入細胞內部，進而與特異性抗原結合。為明確抗PPP6免疫血清的傳播阻斷效果，我們分別進行體外動合子培養和蚊體內卵囊形成實驗。與預期研究結果一致，當在動合子培養基中加入1∶5的抗PPP6免疫血清時，其對動合子形成的抑制效果明顯，大于40%的原蟲停滯在未成熟動合子階段。同時，蚊體內卵囊形成實驗顯示，抗PPP6血清可顯著抑制蚊胃內卵囊形成，證實抗PPP6免疫血清的良好傳播阻斷效果。由于PPP6蛋白在伯氏瘧原蟲中的多個發育階段均有表達，因此抗PPP6的免疫血清可能對伯氏瘧原蟲的其他發育階段也存在影響，如子孢子的形成及其感染能力等。此假設尚需后續實驗進行驗證。同時，抗PPP6免疫血清對紅內期原蟲生長發育的作用尚需深入研究。

綜上所述，本研究對伯氏瘧原蟲PPP6蛋白免疫小鼠后的免疫原性和免疫反應性及抗PPP6免疫血清的傳播阻斷效應進行了研究。實驗結果證實PPP6具有良好的免疫原性和免疫反應性。通過使用鼠瘧模型確定了伯氏瘧原蟲PPP6蛋白作為新型TBVs候選抗原的傳播阻斷能力，并為惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲PPP6蛋白作為瘧疾TBVs候選抗原的可行性提供了必要的理論依據。