虎杖甙對人乳腺細胞系MDA-MB-231增殖、侵襲和遷移的調節(jié)作用①

馮傳波 邵 華 王鐘林 朱雙九 鄭新聞

(連云港市第二人民醫(yī)院甲乳外科，連云港 222006)

乳腺癌是女性最常見的腫瘤之一，是導致女性癌癥死亡的首要原因[1]。據報道，全球每年乳腺癌的新發(fā)病例約有1 400 000人，約有450 000人死于乳腺癌[2]。乳腺癌好發(fā)于發(fā)達國家，但由于醫(yī)療資源的限制，約有60%的乳腺癌死亡發(fā)生在發(fā)展中國家[3]。近年來，靶向治療等新型治療方法的發(fā)展使乳腺癌的致死率有所降低，但仍不足以治愈乳腺癌[4]。大多數乳腺癌患者在確診時已經出現癌癥的系統轉移，大大增加了乳腺癌患者的死亡率[5]。因此，尋找抑制癌細胞轉移的方法可能有利于降低乳腺癌的致死率。現代研究表明，天然藥物在抑制癌癥復發(fā)和癌細胞轉移方面具有一定的優(yōu)勢，與現代化療藥物比較還具有低毒副作用的特點[6]，因此成為近年來抗癌藥物研究的熱點。虎杖是我國傳統中藥，其主要有效成分虎杖甙(Polydatin)對休克、缺血損傷、充血性休克及子宮內膜異位等疾病具有明顯的療效，同時還能減緩一些癌癥的發(fā)展[7]。Chen等[8]研究表明，虎杖甙也能誘導乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7細胞凋亡，但關于虎杖甙對乳腺癌細胞侵襲及遷移的作用還未見報道。本研究采用不同濃度虎杖甙處理乳腺癌MDA-MB-231細胞，以探究虎杖甙對乳腺癌細胞侵襲及遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1材料 虎杖甙購自美國Sigma公司，DMEM細胞培養(yǎng)液、特級胎牛血清和胰蛋白酶購自美國Thermo Fisher公司，CCK8試劑盒和BCA試劑盒購自美國Bio-Rad公司，Matrigel膠及Transwell小室購自美國Millipore公司，Ki67、血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)和基質金屬蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase-9,MMP-9)一抗購自英國Abcam公司，HRP偶聯的山羊抗兔和山羊抗小鼠二抗購自北京中杉生物公司，HE染色劑購自北京博奧森公司，ECL試劑盒購自廣州吉賽生物有限公司。

1.2方法

1.2.1試劑配置 精密稱取適量虎杖甙用微量的二甲基亞砜溶解，溶解后加入無血清培養(yǎng)液配置為100 μmol/L的虎杖甙儲存液，經過濾除菌后，密封保存于-20℃冰箱，臨用前用完全培養(yǎng)液稀釋到實驗所需濃度后備用。

1.2.2細胞培養(yǎng)及分組 乳腺癌細胞系MDA-MB-231購自美國ATCC公司。用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液將細胞培養(yǎng)于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中，隔天換液，2～3 d傳代一次。

將MDA-MB-231細胞分為MDA-MB-231組、Polydatin(0.2 μmol/L)組、Polydatin(0.5 μmol/L)組和Polydatin(1 μmol/L)組，并分別用0、0.2、0.5和1 μmol/L的虎杖甙處理MDA-MB-231細胞，根據實驗設計進行對應后續(xù)檢測。

1.2.3CCK8檢測細胞活性 將MDA-MB-231細胞接種于96孔板中，種板密度為5×104個/ml。用0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20和50 μmol/L的虎杖甙處理細胞，每個濃度6個復孔。24 h后根據CCK8試劑盒說明書檢測各組細胞的細胞活性。

將細胞接種于96孔板中，分為MDA-MB-231組、Polydatin(0.2 μmol/L)組、Polydatin(0.5 μmol/L)組和Polydatin(1 μmol/L)組，并用不同濃度的虎杖甙分別處理0、1、2、3和4 d，根據CCK8試劑盒說明書檢測各組細胞活性。

1.2.4Transwell檢測細胞侵襲能力 將Matrigel提前放于4℃冰箱中，待Matrigel溶化后取出，迅速加入到Transwell小室內，以蓋住小室底部為宜，并保證無氣泡產生。將加有Matrigel的Transwell小室放入培養(yǎng)箱中，待Matrigel凝固后取出備用。將MDA-MB-231細胞以1×105個/ml的密度接種于Transwell小室內，上層分別加入含有不同濃度虎杖甙的無血清培養(yǎng)液，下層則加入正常培養(yǎng)液。24 h后用無菌棉簽擦去上層未遷移蛋白，用HE將下層遷移細胞染色并計數。

1.2.5劃痕實驗檢測細胞遷移能力 用無菌maker筆于6孔板背面劃平行直線，使每個培養(yǎng)孔背面至少有5條平行直線。將MDA-MB-231細胞接種于6孔板內，細胞密度為1×105個/ml。待細胞貼壁后，用10 μl的槍頭垂直于培養(yǎng)板背面直線劃痕，用磷酸鹽緩沖液洗去被劃下的細胞，將細胞分為MDA-MB-231組、Polydatin(0.2 μmol/L)組、Polydatin(0.5 μmol/L)組和Polydatin(1 μmol/L)組，并按照1.2.2所描述的方法處理24 h并記錄 0 h 和24 h時各組細胞的劃痕寬度，計算細胞劃痕閉合率。

1.2.6免疫印跡檢測蛋白表達 將細胞按照1.2.2描述方法處理24 h后，用RIPA裂解液提取各組細胞蛋白，用BCA試劑盒檢測蛋白質濃度并調平蛋白質濃度。每組分別取30 μg蛋白用10%的SDS-PAGE分離蛋白并用半干法將蛋白質轉移到PVDF膜，用5%的脫脂奶粉溶液室溫封閉膜2 h，隨后加入適宜濃度一抗，4℃孵育過夜。第二天用緩沖液洗去多余一抗，加入二抗室溫孵育1 h后，滴加化學發(fā)光顯色液于暗室曝光顯影。

2 結果

2.1虎杖甙對MDA-MB-231細胞增殖的影響 如圖1 所示，當虎杖甙濃度為2 μmol/L時，MDA-MB-231細胞的細胞活性明顯降至80%以下，并隨虎杖甙濃度升高，細胞活性逐漸降低。因此，選擇0.2、0.5和1 μmol/L三個對MDA-MB-231細胞無明顯細胞毒性的濃度進行后續(xù)實驗。用虎杖甙處理MDA-MB-231不同時間后發(fā)現，虎杖甙處理細胞4 d后，MDA-MB-231細胞增殖倍數顯著降低，與MDA-MB-231組比較差異有統計學意義(P<0.01,圖2)。此外，與MDA-MB-231組比較，Polydatin(0.2 μmol/L)組、Polydatin(0.5 μmol/L)組和Polydatin(1 μmol/L)組細胞增殖相關蛋白Ki67的蛋白表達水平顯著降低(P<0.01,圖3)，并體現出量效關系，表明虎杖甙能抑制MDA-MB-231細胞增殖。

2.2虎杖甙對MDA-MB-231細胞侵襲能力的影響 與MDA-MB-231組比較，Polydatin(0.2 μmol/L)組、Polydatin(0.5 μmol/L)組和Polydatin(1 μmol/L)組侵襲細胞數量顯著減少(P<0.01,圖4)，差異具有統計學意義，表明虎杖甙能抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞侵襲。

圖1 不同濃度虎杖甙對MDA-MB-231細胞活性的影響Fig.1 Effect of different concentration of polydatin on cell viability of MDA-MB-231 cells

圖2 虎杖甙對MDA-MB-231細胞增殖倍數的影響Fig.2 Effect of polydatin on cell growth folds of MDA-MB-231 cellsNote：n=6,**.P<0.01 vs MDA-MB-231 group.

圖3 虎杖甙對Ki67、VEGF和MMP-9蛋白表達的影響Fig.3 Effect of polydatin on expression of Ki67,VEGF and MMP-9Note：n=6,**.P<0.01 vs MDA-MB-231 group.

2.3虎杖甙對MDA-MB-231細胞遷移能力的影響 劃痕實驗結果表明，與MDA-MB-231組比較，Polydatin(0.2 μmol/L)組、Polydatin(0.5 μmol/L)組和Polydatin(1 μmol/L)組細胞劃痕閉合率顯著降低(P<0.01,圖5)，差異有統計學意義，并具有量效關系。同時,Polydatin(0.2 μmol/L)組、Polydatin(0.5 μmol/L) 組和Polydatin(1 μmol/L)組細胞侵襲和遷移相關蛋白VEGF和MMP-9的蛋白表達水平顯著降低(P<0.01,圖3)，與MDA-MB-231組比較差異有統計學意義，表明虎杖甙能抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞侵襲和遷移。

圖4 虎杖甙對MDA-MB-231細胞侵襲能力的影響Fig.4 Effect of polydatin on invasion ability of MDA-MB-231 cellsNote：n=6,**.P<0.01 vs MDA-MB-231 group.

圖5 虎杖甙對MDA-MB-231細胞遷移能力的影響Fig.5 Effect of polydatin on migration ability of MDA-MB-231 cellsNote：n=6,**.P<0.01 vs MDA-MB-231 group.

3 討論

虎杖是我國傳統中藥，在我國已有上千年的用藥歷史，并已被列入我國藥典[9]。虎杖甙，又稱為白藜蘆醇苷，是虎杖的主要有效成分，虎杖甙常被用于慢性支氣管炎、肝炎、休克的治療，具有明顯的心血管系統保護作用[10]。研究表明，虎杖甙可由白藜蘆醇衍生而來，因此與白藜蘆醇有著多種相似的藥理學活性，并且虎杖甙更易被機體吸收、具有更強的抗氧化活性[10]。白藜蘆醇對多種癌細胞的增殖、侵襲及遷移具有明顯的抑制作用[11]。近年來也有研究發(fā)現，虎杖甙也能誘導宮頸癌、結腸癌及卵巢癌等多種癌細胞凋亡[12-14]。同時，虎杖甙還能誘導MDA-MB-231細胞凋亡[11]。但虎杖甙是否能影響MDA-MB-231細胞的侵襲和遷移能力還未見報道。Jiao等[15]研究發(fā)現，虎杖甙還能抑制肝癌HepG2細胞增殖、侵襲及遷移，還能通過抑制磷酸戊糖途徑抑制小鼠頭頸部鱗狀細胞癌的轉移，提示其也能影響癌細胞侵襲和遷移的能力[16]。為了探究虎杖甙對乳腺癌細胞增殖、侵襲及遷移的作用，本研究首先采用多濃度的虎杖甙處理MDA-MB-231細胞并發(fā)現虎杖甙濃度達到2 μmol/L時能使MDA-MB-231細胞活性降至80%以下，表明虎杖甙濃度達到2 μmol/L 時對MDA-MB-231細胞具有明顯的細胞毒性，并且隨虎杖甙濃度的升高，細胞毒性逐漸增強。因此，本研究選擇0.2、0.5和1 μmol/L三個濃度進行后續(xù)實驗。用虎杖甙處理MDA-MB-231細胞4 d后，MDA-MB-231細胞的增殖速度顯著降低，并且具有劑量依賴性。同時，虎杖甙還能顯著抑制細胞增殖相關蛋白Ki67蛋白表達，提示虎杖甙能抑制MDA-MB-231細胞增殖，與之前的研究報道一致[11]。

癌癥轉移涉及多個病理學過程，包括腫瘤細胞的分離、轉移、黏附和侵襲進入血液或淋巴管[17]。其中，癌細胞的侵襲和轉移是導致癌癥轉移的主要原因[18]。本研究采用Transwell實驗和劃痕實驗檢測虎杖甙對MDA-MB-231細胞侵襲和遷移能力的影響發(fā)現，虎杖甙能顯著減少侵襲的乳腺癌細胞數量并降低MDA-MB-231細胞的劃痕閉合率，同時體現量效關系，表明虎杖甙可降低MDA-MB-231細胞的侵襲和遷移能力。癌細胞的侵襲和轉移是由多個細胞因子共同調控的過程， MMP家族在癌細胞轉移到靶向組織的過程中發(fā)揮了重要作用，其中以MMP-9最為重要[19]。MMP-9能夠降解Ⅳ膠原酶，在乳腺癌中呈高表達狀態(tài)，并與乳腺癌患者的預后有關[5]。抑制MMP-9的表達能抑制乳腺癌細胞的轉移，有利于乳腺癌的治療[20]。本文研究結果表明，虎杖甙能顯著抑制MDA-MB-231細胞中MMP-9的表達，并具有量效關系，同時還能顯著抑制VEGF的表達。研究表明，VEGF在癌癥轉移的過程中也具有重要作用，能通過促進細胞外基質的降解、增大血管通透性促進癌細胞的侵襲和遷移[21]。結合實驗結果進一步表明，虎杖甙能抑制MDA-MB-231細胞侵襲和轉移。

綜上所述，虎杖甙能降低MDA-MB-231細胞的生長倍數和增殖相關蛋白Ki67的表達，同時還能減少MDA-MB-231細胞的侵襲，降低細胞劃痕閉合率，此外還能降低侵襲和遷移相關蛋白MMP-9和VEGF的表達，表明虎杖甙能抑制MDA-MB-231細胞增殖、侵襲和遷移。本研究首次探究了虎杖甙對MDA-MB-231細胞侵襲和遷移能力的影響，但關于具體作用機制的探究還比較欠缺，因此實驗室后期將進一步探究虎杖甙抑制MDA-MB-231細胞侵襲和遷移的作用機制。