雙氫青蒿素通過(guò)調(diào)控細(xì)胞自噬性死亡增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞的化療敏感性①

姜廣利 馬靜靜 何勝悅

(新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院產(chǎn)科,新鄉(xiāng) 453000)

近年來(lái)，隨著癌癥篩選、預(yù)防、診斷及治療水平的提高，宮頸癌患者的生活質(zhì)量得到了較大的改善，但宮頸癌仍是導(dǎo)致女性癌癥死亡的首要原因，預(yù)計(jì)每年宮頸癌發(fā)病率占癌癥發(fā)病率的3.7%，致死率占3.2%，嚴(yán)重威脅著女性健康[1]。化療是宮頸癌系統(tǒng)治療的常用方法，可增加早期宮頸癌的治愈率，改善宮頸癌患者的預(yù)后和降低宮頸癌復(fù)發(fā)率，但并不是所有患者都可從中獲益[2，3]。研究發(fā)現(xiàn)，癌癥化療抵抗性的形成是導(dǎo)致化療療效下降的主要原因，但是具體的形成機(jī)制還不完全清楚[4]。但有研究表明，自噬可幫助癌細(xì)胞對(duì)抗化療藥物的毒性，促進(jìn)癌細(xì)胞化療抵抗的形成[5]。化療藥物長(zhǎng)期應(yīng)用可誘導(dǎo)癌細(xì)胞自噬[6]。因此，抑制癌癥發(fā)展過(guò)程中的自噬可能有利于增強(qiáng)化療藥物的抗癌作用。雙氫青蒿素(Dihydroartemisinin，DHA)是青蒿素的活性代謝產(chǎn)物，是治療瘧疾的重要藥物。大量研究表明，DHA對(duì)乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌及宮頸癌等多種癌細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，能通過(guò)調(diào)控癌細(xì)胞自噬誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡及抑制癌細(xì)胞增殖[7]，也可通過(guò)調(diào)控自噬增強(qiáng)癌細(xì)胞的化療敏感性[8]。但DHA對(duì)宮頸癌化療抵抗的作用還未見報(bào)道。因此，本文將探究DHA對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞化療抵抗性的作用，以期為增強(qiáng)化療藥物的抗癌作用提供新的潛力藥物。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑 DHA購(gòu)自重慶華麗武陵山制藥廠，生產(chǎn)批號(hào)為20140703-1，順鉑注射液購(gòu)自齊魯制藥，生產(chǎn)批號(hào)為01201928B。CCK8試劑盒、BCA試劑盒及RIPA裂解液購(gòu)自北京索萊寶生物科技公司。Annexin V-FITC試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司，DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清和胰酶均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。Ki67、Cleaved Caspase-3、LC3、Beclin1一抗購(gòu)自美國(guó)CST公司，P62、雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin，mTOR)、p-mTOR、p-Ulk1、Ulk1和實(shí)驗(yàn)所用二抗均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.1.2細(xì)胞 人宮頸癌細(xì)胞系HeLa細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液將細(xì)胞培養(yǎng)于細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)環(huán)境為37℃、5%CO2和98%以上濕度。隔天換液，細(xì)胞密度達(dá)到85%以上時(shí)進(jìn)行傳代。

1.2.2細(xì)胞分組 預(yù)實(shí)驗(yàn)部分將細(xì)胞分為Control組、DHA(5 μmol/L)組、DHA(10 μmol/L)組和DHA(20 μmol/L)組或Cisplatin組、DHA(5 μmol/L)+ Cisplatin組、DHA(10 μmol/L)+ Cisplatin組和DHA(20 μmol/L)+ Cisplatin組，前者分別用0、5、 10、 20 μmol/L 的DHA處理細(xì)胞0、1、2、3和4 d后進(jìn)行檢測(cè)；后者用順鉑或順鉑聯(lián)合不同濃度DHA處理細(xì)胞48 h，檢測(cè)細(xì)胞活性。正式實(shí)驗(yàn)部分將細(xì)胞分為Control、DHA(20 μmol/L)、Cisplatin(10 μg/ml)和DHA+Cisplatin組，分別用等量溶媒、DHA、順鉑和DHA聯(lián)合順鉑處理細(xì)胞，24 h后進(jìn)行相應(yīng)檢測(cè)。

1.2.3CCK8檢測(cè)細(xì)胞活性 將細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，用不同濃度DHA或順鉑處理后，每孔加入10 μl 的CCK8試劑，于培養(yǎng)箱中孵育2 h后，用酶標(biāo)儀于450 nm處檢測(cè)各組細(xì)胞吸光度。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 用胰酶收集DHA和順鉑處理后的細(xì)胞，并將細(xì)胞密度調(diào)整為1×106個(gè)/ml。隨后將細(xì)胞以1 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，加入195 μl結(jié)合緩沖液和5 μl 的Annexin V-FITC，避光孵育10 min后，加入5 μl的PI溶液，室溫避光孵育15 min后，加入400 μl結(jié)合緩沖液并在1 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。

1.2.5免疫印跡檢測(cè)蛋白表達(dá) 用RIPA裂解液提取各組細(xì)胞蛋白，用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度并調(diào)平。每組分別取30 μg蛋白用10%SDS-PAGE分離各組蛋白，轉(zhuǎn)移蛋白到PVDF膜。用5%的脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h，隨后加入一抗(Ki67，1∶1 000;Cleaved Caspase-3，1∶1 200;Beclin1，1∶1 000;LC3，1∶1 000;P62，1∶1 100;mTOR，1∶1 200;p-mTOR，1∶900;Ulk1，1∶1 000;p-Ulk1，1∶1 000)，4℃過(guò)夜。第二天用緩沖液洗去未結(jié)合一抗，加入二抗室溫2 h并洗去未結(jié)合二抗后，滴加化學(xué)發(fā)光顯色液于凝膠成像系統(tǒng)曝光顯影。用軟件Image J對(duì)蛋白質(zhì)條帶灰度值進(jìn)行半定量分析。

1.2.6免疫熒光檢測(cè)LC3表達(dá) 將細(xì)胞用DHA和順鉑處理后，用磷酸鹽緩沖液洗凈細(xì)胞，加入4%多聚甲醛室溫固定30 min。洗去殘留多聚甲醛，滴加0.5%的TritonX-100對(duì)細(xì)胞膜進(jìn)行透膜處理。加入10%的封閉用正常山羊血清室溫孵育細(xì)胞2 h，隨后滴加LC3(1∶200)一抗，于4℃孵育過(guò)夜。第二天棄去一抗，滴加熒光二抗，室溫孵育1 h后洗去未結(jié)合二抗，加入DAPI即用液室溫染色10 min后，于熒光顯微鏡下觀察LC3表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1DHA對(duì)HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 如圖1所示，當(dāng)DHA濃度達(dá)到50 μmol/L及以上時(shí)，細(xì)胞活性降至80%以下，因此選擇5、10、20 μmol/L濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。不同濃度的DHA處理細(xì)胞4 d后，DHA(5、10、20 μmol/L)組HeLa細(xì)胞增殖速度顯著降低(P<0.01，P<0.001)，與Control組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)，并具有量效關(guān)系，表明DHA能抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖。

2.2DHA對(duì)順鉑抑制細(xì)胞增殖作用的影響 與Cisplatin組比較，DHA(10 μmol/L)+ Cisplatin組和DHA(20 μmol/L)+ Cisplatin組細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.01，圖3)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并以DHA 濃度為20 μmol/L時(shí)作用最強(qiáng)，因此選擇20 μmol/L進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與Control組比較，Cisplatin組和DHA(20 μmol/L)組細(xì)胞Ki67表達(dá)水平明顯降低(P<0.01，圖4)，DHA+Cisplatin組細(xì)胞Ki67表達(dá)水平與Cisplatin組比較明顯降低(P<0.01，圖4)，表明DHA可增強(qiáng)順鉑對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖的抑制作用。

圖1 DHA對(duì)HeLa細(xì)胞活性的影響Fig.1 Effect of DHA on cell viability of HeLa cells

圖2 DHA對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effect of DHA on HeLa cellsNote:The cell viability was determined by CCK8 assay.n=6，**.P<0.01，***.P<0.001 versus control group.

2.3DHA對(duì)順鉑促細(xì)胞凋亡作用的影響 流式實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與Control組比較，DHA(20 μmol/L)組和Cisplatin組細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.01，圖5)；與Cisplatin組比較，DHA+Cisplatin組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.01，圖5)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；此外，DHA(20 μmol/L)組和Cisplatin組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspase-3(32 kD)的表達(dá)水平與Control組比較明顯升高(P<0.01，圖4)，DHA+Cisplatin組Cleaved Caspase-3的表達(dá)水平明顯高于Cisplatin組(P<0.01，圖4)，表明DHA能增強(qiáng)順鉑對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。

2.4DHA對(duì)順鉑誘導(dǎo)自噬的影響 與Control組比較，DHA(20 μmol/L)組細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin1表達(dá)水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ明顯降低，P62表達(dá)水平明顯升高(P<0.01，圖6)； Cisplatin組Beclin1表達(dá)水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ與Control組比較明顯升高，P62表達(dá)水平明顯降低(P<0.05，P<0.01，圖6)，表明DHA能抑制HeLa細(xì)胞自噬，順鉑可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。與Cisplatin組比較，DHA+Cisplatin組Beclin1表達(dá)水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ明顯降低，P62表達(dá)水平明顯升高(P<0.01，P<0.001，圖6)，表明DHA能抑制順鉑誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞自噬。此外，DHA能顯著降低LC3在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)率(P<0.01，圖7)，順鉑能升高LC3在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)率(P<0.01，圖7)；DHA還能減弱順鉑對(duì)LC3表達(dá)的促進(jìn)作用(P<0.01，圖7)，進(jìn)一步表明DHA能抑制順鉑誘導(dǎo)的宮頸癌HeLa細(xì)胞自噬。

圖3 DHA對(duì)順鉑抑制HeLa細(xì)胞增殖作用的影響Fig.3 Effect of DHA on inhibitory effect of cisplatin on proliferation of HeLa cellNote:Cell viability was measured by CCK8 assay.n=6，**.P<0.01 versus cisplatin group.

圖4 DHA 對(duì)順鉑調(diào)控Ki67和Cleaved Caspase-3表達(dá)的作用Fig.4 Effect of DHA on regulatory effects of cisplatin on expressions of Ki67 and Cleaved Caspase-3Note:Protein levels of Ki67 and Cleaved Caspase-3 was determined by Western blot.GAPDH was used as control.n=6，**.P<0.01 versus control group；##.P<0.01 versus cisplatin group.

圖5 DHA對(duì)順鉑誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡作用的影響Fig.5 Effect of DHA on inductive effect of cisplatin on cell apoptosis of HeLa cellNote:Cell apoptosis was determined by flow cytometry.n=6，**.P<0.01 versus control group；##.P<0.01 versus cisplatin group.

圖6 DHA對(duì)順鉑誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞自噬的影響Fig.6 Effect of DHA on cisplatin-induced autophagy of HeLa cellNote:The protein levels was measured by Western blot.n=6，*.P<0.05，**.P<0.01 versus control group；##.P<0.01，###.P<0.001 versus cisplatin group.

2.5DHA對(duì)順鉑抑制mTOR/Ulk1信號(hào)通路激活作用的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與Control組比較，DHA組mTOR磷酸化和Ulk1磷酸化水平升高，p-mTOR/mTOR和p-Ulk1/Ulk1顯著升高(P<0.01，圖8)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Cisplatin組p-mTOR/mTOR和p-Ulk1/Ulk1與Control組比較明顯降低(P<0.01，圖8)；與Cisplatin組比較，DHA+Cisplatin組p-mTOR/mTOR和p-Ulk1/Ulk1顯著升高(P<0.001，圖8)，表明DHA能減弱順鉑對(duì)mTOR/Ulk1信號(hào)通路激活的抑制作用。

圖8 DHA對(duì)順鉑抑制mTOR/Ulk1信號(hào)通路激活作用的影響Fig.8 Effect of DHA on inhibitory effect of mTOR/Ulk1 signaling pathwayNote:The expressions of p-mTOR，mTOR，p-Ulk1 and Ulk1 were measured by Western blot.n=6，**.P<0.01 versus control group；###.P<0.001 versus cisplatin group.

3 討論

化療是癌癥治療的常用方法，也是宮頸癌系統(tǒng)治療的首選治療方法。鉑類藥物是宮頸癌治療的主要化療藥物，其中以順鉑最為常見。研究表明，順鉑可通過(guò)促進(jìn)癌細(xì)胞DHA鏈斷裂誘導(dǎo)癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和細(xì)胞凋亡，從而減緩癌癥的發(fā)展甚至治愈癌癥[9]。但長(zhǎng)時(shí)間使用順鉑可誘導(dǎo)癌細(xì)胞化療抵抗性的形成，減低癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，從而導(dǎo)致順鉑化療療效降低甚至是治療失效[10]。大量研究表明，自噬參與了癌細(xì)胞化療抵抗性的形成，可幫助癌細(xì)胞逃避化療藥物的細(xì)胞毒性[11]。抑制自噬可增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，增強(qiáng)化療藥物對(duì)癌細(xì)胞的殺傷作用[12]。

DHA是瘧疾治療藥物青蒿素的活性代謝產(chǎn)物，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)DHA也具有廣泛的抑癌活性。DHA能通過(guò)誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡抑制結(jié)腸癌、乳腺癌及肺癌等癌細(xì)胞增殖，還能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯減緩癌癥的發(fā)展[13-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，用5、10和20 μmol/L 的DHA處理宮頸癌HeLa細(xì)胞4 d后，細(xì)胞增殖明顯被抑制，表明DHA對(duì)HeLa細(xì)胞增殖有抑制作用。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)DHA還能增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，作用機(jī)制與活性氧介導(dǎo)的死亡受體5的表達(dá)有關(guān)[16]。本研究也發(fā)現(xiàn)，DHA和化療藥物順鉑聯(lián)用能顯著增強(qiáng)順鉑對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的抑制作用，并體現(xiàn)量效關(guān)系。DHA和順鉑聯(lián)合處理細(xì)胞24 h后，還能顯著增強(qiáng)順鉑抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白Ki67表達(dá)的作用。此外，DHA還能顯著升高HeLa細(xì)胞的凋亡率，并增強(qiáng)順鉑對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用，提示DHA不僅能誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和凋亡，還能增強(qiáng)宮頸癌HeLa細(xì)胞對(duì)化療藥物順鉑的敏感性。

自噬是機(jī)體自殺性死亡的一種形式，可通過(guò)清除受損蛋白和細(xì)胞器維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。研究表明，自噬在癌癥的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中具有重要的調(diào)控作用[17]。自噬可通過(guò)抑制基因突變及癌癥基因的表達(dá)抑制癌癥的發(fā)生，在癌癥早期可通過(guò)吞噬癌變細(xì)胞減緩癌癥的發(fā)展，癌癥發(fā)展后期自噬可通過(guò)為癌組織提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)促進(jìn)癌癥的發(fā)展，還能幫助癌細(xì)胞抵抗化療藥物的細(xì)胞毒性[18]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，多種藥物可通過(guò)抑制癌細(xì)胞自噬增強(qiáng)化療藥物對(duì)癌癥的治療作用。Fukuda等[19]研究發(fā)現(xiàn)，抗瘧藥物氯喹可通過(guò)抑制自噬抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖并減弱癌細(xì)胞對(duì)順鉑的化療抵抗性。辣椒素增強(qiáng)膽管癌對(duì)化療藥物的敏感性的作用也與抑制細(xì)胞自噬有關(guān)[20]。本文研究發(fā)現(xiàn)，順鉑能顯著促進(jìn)自噬相關(guān)蛋白Beclin1表達(dá)，上調(diào)LC3Ⅱ/LC3Ⅰ，并抑制P62的表達(dá)，表明順鉑能誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞自噬。DHA能顯著抑制HeLa細(xì)胞Beclin1的表達(dá)和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ上調(diào)，并誘導(dǎo)P62表達(dá)，同時(shí)還能顯著減弱順鉑對(duì)Beclin1、P62表達(dá)及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的調(diào)控作用，表明DHA可抑制順鉑誘導(dǎo)的宮頸癌HeLa細(xì)胞自噬。

mTOR/Ulk1信號(hào)通路是調(diào)控細(xì)胞自噬的重要通路。上游信號(hào)促進(jìn)mTOR磷酸化從而激活mTOR，活化的mTOR可通過(guò)誘導(dǎo)Ulk1磷酸化而活化Ulk1，進(jìn)而抑制自噬的發(fā)生[21]。白藜蘆醇就可通過(guò)抑制mTOR/Ulk1信號(hào)通路的激活誘導(dǎo)自噬，抑制HeLa細(xì)胞增殖[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，DHA能顯著升高p-mTOR/mTOR和p-Ulk1/Ulk1，表明DHA能誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞mTOR/Ulk1信號(hào)通路的激活。同時(shí)，DHA還能顯著減弱順鉑降低p-mTOR/mTOR和p-Ulk1/Ulk1的作用，表明DHA可通過(guò)減弱順鉑對(duì)mTOR/Ulk1信號(hào)通路激活的抑制作用抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞自噬，從而增強(qiáng)宮頸癌HeLa細(xì)胞對(duì)順鉑的化療敏感性。

綜上所述，DHA能抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并抑制HeLa細(xì)胞自噬，促進(jìn)mTOR/Ulk1信號(hào)通路激活。同時(shí)，DHA還能增強(qiáng)順鉑對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的抑制作用及對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用，同時(shí)抑制順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬，減弱順鉑對(duì)mTOR/Ulk1信號(hào)通路的抑制作用，提示DHA可通過(guò)抑制順鉑誘導(dǎo)的自噬增強(qiáng)宮頸癌HeLa細(xì)胞對(duì)順鉑的化療敏感性，并且作用機(jī)制與促進(jìn)mTOR/Ulk1信號(hào)通路激活有關(guān)。本文首次探究了DHA對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞化療敏感性的作用及作用機(jī)制，可能為降低癌細(xì)胞化療抵抗提供了新的潛力藥物。