枸櫞酸芬太尼對人肝癌HepG2細胞生物學性狀的影響①

徐連生 卿 帥 黃世明

(宜賓市第一人民醫院麻醉科,宜賓 644000)

原發性肝癌是常見的惡性腫瘤之一，據最新研究顯示，肝癌已經成為腫瘤相關死亡的第二大類[1]。原發性肝癌主要包括肝細胞癌、肝內膽管癌和混合型三種，其中肝細胞癌占90%以上[2]。乙/丙型肝炎病毒感染、長期酗酒和其他促發肝硬化的因素都會加大患肝癌的風險[3]。對于早期肝癌患者，手術切除腫瘤是最為有效的方法，但由于患者檢測不及時或者切除部位影響肝臟功能，使手術切除率不高[4]。對于不能手術切除的患者，肝臟移植是最好的選擇，但是捐贈者的短缺極大限制該技術的應用[5]。目前臨床上常用的是射頻消融，但是對體積較大的腫瘤治療效果不佳[6]。靶向藥物、化療藥常用于晚期肝癌的治療，但是容易復發且生存期太短，近年來出現的免疫療法技術尚不成熟，因此尋找治療肝癌的新型藥物顯得尤為重要[7,8]。劇烈疼痛是晚期癌癥患者的典型癥狀，給患者帶來極大的痛苦。阿片類鎮痛藥是治療長期和短暫性疼痛的最佳藥物[9]。枸櫞酸芬太尼是人工合成的阿片類強效麻醉鎮靜劑，鎮痛效果是嗎啡的50～100倍，具有安全、藥效快、副作用小等特點[10]。臨床上作為麻醉輔助用藥，用于各種外科手術后的鎮痛。近來有研究發現，枸櫞酸芬太尼能抑制胃癌和乳腺癌的發展，但枸櫞酸對肝癌細胞生物學性狀的影響還未見報道。本文探究枸櫞酸芬太尼對人肝癌HepG2細胞生物學性狀的影響。

1 材料與方法

1.1材料 枸櫞酸芬太尼注射液由宜昌人福藥業提供；人正常肝細胞LO2購自中國科學院上海細胞所；BrdU ELISA檢測試劑盒購自Roche公司；人肝癌HepG2細胞株購自ATCC；DMEM、FBS、胰酶、盤尼西林和鏈霉素均購自Hyclone；CCK-8檢測試劑盒購自碧云天生物；凋亡雙染試劑盒購自上海復申生物；Ki67、Cleaved-Caspase-3、VEGF鼠抗人一抗購自Abcam；來源于兔的二抗及顯影液均購自艾美捷。

1.2方法

1.2.1細胞的培養 將液氮凍存的人肝癌細胞株HepG2細胞迅速轉入37℃水浴鍋，手動搖晃3 min，1 000 r/min離心5 min，去上清，于10%胎牛血清的DMEM，補充青霉素100 U/ml、鏈霉素100 mg/ml，37℃ 5%CO2生化培養箱中培養。正常人肝細胞LO2接種于10%胎牛血清的DMEM中，37℃ 5%CO2生化培養箱中培養。

1.2.2CCK8 將100 μl的LO2細胞懸液接種于96孔板中，細胞密度為3×104個/ml，正常條件下預培養12 h；向對應的孔中加入10 μl不同濃度的待測物質，設置空白對照組，每組設置3個復孔，培養箱中孵育24 h；每孔中加10 μl CCK8溶液，培養箱中孵育2 h；用酶標儀檢測450 nm處的吸光值。

1.2.3BrdU-ELISA檢測細胞增殖 取對數生長期的人肝癌細胞HepG2，胰酶消化制成單細胞懸液，調整細胞密度為1×104個/ml，按照每孔200 μl接種于96孔板，加枸櫞酸芬太尼使終濃度為10、20、50 nmol/L，設置空白對照組和背景對照組。培養1、2、3、4 d后，加20 μl的BrdU標記液，繼續培養6 h，加Fix Denat使細胞變性，然后每孔加100 μl的辣根過氧化物酶標記的BrdU抗體，洗3次，加100 μl的TMB底物液顯色，20 min終止反應。在酶標儀下檢測450 nm和630 nm雙波長下數值，每組設置3個復孔。

1.2.4流式細胞術檢測細胞凋亡 用胰酶消化細胞后，1 000 r/min離心5 min，棄培養液，用預冷的PBS緩沖液清洗3次后重懸沉淀，使細胞密度為1×106個/ml。加入Annexin V-FITC和PI溶液，混勻后室溫下避光孵育15 min，加入結合緩沖液，用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.5劃痕實驗 實驗前用Maker筆于培養板背面畫平行的5條直線，滅菌后備用。將細胞傳代培養于12孔板中，加入不同劑量的藥物后，用10 μl槍頭垂直于培養板背面直線劃痕，用預冷的PBS洗滌3次后，加入無血清培養液進行培養，于0 h和24 h進行拍照記錄，并計算劃痕愈合率，劃痕愈合率 =(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度。

1.2.6Transwell 將人肝癌細胞以無血清培養液培養24 h后，用0.25%胰蛋白酶消化細胞并傳代接種于用Matrigel預處理的Transwell小室中，細胞密度為3×105個/ml。小室上層加入無血清培養液培養細胞，下層則加入含血清的正常培養液。24 h后用無菌棉簽擦去小室上層細胞，下層細胞染色后計數統計，每個孔隨機選擇5個視野。

1.2.7Western blot 收集細胞，加含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30 min，離心后轉移上清。用BCA試劑盒檢測總蛋白濃度，加蛋白上樣緩沖液，沸水浴10 min，15 000 r/min離心10 min，12%SDS-PAGE分離蛋白后用半干轉膜儀轉移蛋白質至PVDF膜。用5%脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h，隨后加入一抗(Ki67，1∶1 000;Cleaved Caspase-3，1∶1 000;VEGF，1∶1 000)于4℃孵育過夜，加入對應二抗室溫封閉1 h，最后滴加ECL曝光顯影。使用Image-Pro plus6.0分析蛋白條帶灰度值。

1.3統計學分析 所有實驗數據均用統計軟件SPSS18.0進行統計分析。方差齊且服從正態分布則組間比較用One-Way ANOVA，反之則用秩和檢驗。P<0.01表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1不同劑量枸櫞酸芬太尼對正常人肝細胞LO2細胞活力的影響 使用不同劑量枸櫞酸芬太尼處理LO2細胞后24 h，檢測細胞活力。檢測結果顯示(見圖1)，IC10為59 nmol/L，當枸櫞酸芬太尼濃度在50 nmol/L 及以內時，對正常肝細胞毒性很小。因此本文選擇劑量為10、20、50 nmol/L的枸櫞酸芬太尼進行后續實驗。

2.2枸櫞酸芬太尼抑制人肝癌HepG2細胞的活力 HepG2細胞經枸櫞酸芬太尼加藥處理后，HepG2細胞的增殖倍數明顯下降，且隨著枸櫞酸芬太尼劑量的升高和用藥時間的增加，細胞活力下降越明顯。加藥處理后第4天，HepG2組細胞生長倍數約為6倍，低劑量FC組約為5倍，中劑量FC組低于4倍，高劑量FC組低于3倍，10、20和50 nmol/L的枸櫞酸芬太尼均能明顯抑制HepG2細胞的活力，且呈時間和濃度依賴效應，見圖2。

2.3枸櫞酸芬太尼誘導人肝癌HepG2細胞凋亡 HepG2細胞經枸櫞酸芬太尼處理后，凋亡細胞比率明顯升高，且凋亡細胞比率隨著枸櫞酸芬太尼劑量的增加而升高。實驗結果表明，枸櫞酸芬太尼可誘導人肝癌HepG2細胞凋亡，見圖3。

2.4枸櫞酸芬太尼對人肝癌HepG2細胞Ki67、Caspase-3、VEGF表達的影響 為了進一步探究枸櫞酸芬太尼對肝癌細胞增殖、凋亡和血管生成相關蛋白表達的影響，我們用Western blot檢測枸櫞酸芬太尼處理后HepG2細胞Ki67、Caspase-3，VEGF的蛋白表達水平。HepG2細胞加枸櫞酸芬太尼處理后，檢測結果顯示，Ki67和VEGF的表達水平顯著下調，活化Caspase-3的表達水平顯著上調，見圖4。

圖1 不同劑量枸櫞酸芬太尼對正常肝細胞LO2活力的影響Fig.1 Effect of different dose fentanyl citrate on cell viability of human hepatocellular LO2

圖2 BrdU-ELISA檢測枸櫞酸芬太尼對人肝癌HepG2細胞活力的影響Fig.2 Effects of fentanyl citrate on cell viability of human hepatocellular carcinoma HepG2 cells was detected by BrdU-ELISANote: *.P<0.01 compared with the control group.

2.5枸櫞酸芬太尼抑制人肝癌HepG2細胞侵襲 HepG2細胞經枸櫞酸芬太尼處理后， 細胞侵襲數目明顯降低。隨著枸櫞酸芬太尼濃度的增加，侵襲細胞數目逐漸減少，見圖5。實驗結果表明，枸櫞酸芬太尼抑制人肝癌HepG2細胞侵襲，且HepG2細胞的侵襲能力與枸櫞酸芬太尼的加藥濃度呈負相關。

圖3 枸櫞酸芬太尼對人肝癌HepG2細胞凋亡的影響Fig.3 Effect of fentanyl citrate on cell apoptosis of human hepatocellular carcinoma HepG2 cellsNote: *.P<0.01 compared with the control group.

圖4 枸櫞酸芬太尼對人肝癌HepG2細胞Ki67、Caspase-3、VEGF表達的影響Fig.4 Effect of fentanyl on expression of Ki67，Caspase-3，VEGF of human hepatocellular carcinoma HepG2 cellsNote: *.P<0.01 compared with the control group.

圖5 枸櫞酸芬太尼對人肝癌細胞HepG2細胞侵襲的影響Fig.5 Effect of fentanyl citrate on cell invasion of human hepatocellular carcinoma HepG2 cellsNote: *.P<0.01 compared with the control group.

圖6 枸櫞酸芬太尼對人肝癌細胞HepG2細胞遷移的影響Fig.6 Effect of fentanyl citrate on cell migration of human hepatocellular carcinoma HepG2 cellsNote: *.P<0.01 compared with the control group.

2.6枸櫞酸芬太尼抑制人肝癌HepG2細胞遷移 為了進一步研究枸櫞酸芬太尼對HepG2細胞遷移能力的影響，我們用劃痕實驗檢測枸櫞酸芬太尼處理HepG2細胞24 h后劃痕閉合程度。加藥組劃痕閉合程度明顯低于HepG2組，且隨著枸櫞酸芬太尼劑量的增加，劃痕閉合程度越低，見圖6。實驗結果表明，枸櫞酸芬太尼抑制人肝癌HepG2細胞遷移。

3 討論

肝癌是常見的惡性腫瘤，早期癥狀不明顯，且發展迅速，因此到確診時常常發現為局部晚期或者發生遠端轉移，造成治療困難、預后效果差、生存期短[11,12]。芬太尼是臨床上常用的麻醉性鎮靜劑，用于治療創傷性疼痛、術后疼痛和癌癥疼痛[13]。芬太尼是阿片受體類激動劑，其作用原理與嗎啡類似[14]。細胞毒性是指由化學物質引起的單純的細胞殺傷事件，不依賴于凋亡或壞死的細胞死亡機理[15]。研究顯示，化學物質引起體外細胞毒性的濃度與體內血液藥物濃度有良好的相關性。體外細胞毒性實驗常用于藥物篩選時檢測藥物安全性和選擇合適的加藥濃度。Chechik等[16]研究發現，正常劑量下，芬太尼對人關節軟骨細胞生存能力和增殖沒有影響。Ficklscherer等[17]發現，將人成纖維細胞暴露于0.025%芬太尼中7 d，細胞生存能力沒有明顯改變。根據藥物毒性實驗，IC10=59 nmol/L，因此本文選擇濃度為10、20、50 nmol/L 的枸櫞酸芬太尼進行后續實驗。

無限增殖是腫瘤的重要特征，有研究顯示，芬太尼具有抑制腫瘤生長的作用。如Miao等[18]研究發現，芬太尼能抑制體外胰腺癌細胞株細胞存活，降低移植瘤小鼠腫瘤的生長。Qin等[19]研究顯示，芬太尼通過下調NF-κB和上調PTEN，抑制人胃癌MGC803細胞的生長。Ki67是與細胞增殖密切相關的核蛋白，同時與核糖體RNA的轉錄有聯系[20]。Ki67的表達與細胞周期密切相關，因此Ki67被認為是檢測惡性腫瘤增殖能力的最可靠的標記蛋白之一[21,22]。BrdU-ELISA結果顯示，枸櫞酸芬太尼降低人肝癌HepG2細胞的增殖倍數。與BrdU檢測結果相對應，Western blot檢測結果顯示，枸櫞酸芬太尼處理后的HepG2細胞Ki67的表達顯著下調。與前人研究結果一致，本文研究結果表明，枸櫞酸芬太尼抑制人肝癌HepG2細胞增殖。

細胞凋亡是高度有序的多基因參與調控的復雜過程。細胞凋亡異常與腫瘤的發展有著密切的聯系。Li等[23]研究發現，芬太尼通過抑制NF-κB的激活，進而抑制下游VEGF-A、MMP-9和BAX/Bcl-2的表達，促進細胞凋亡，抑制人胃癌MGC-803細胞的生長。Caspase家族在介導細胞凋亡的過程中發揮著重要作用，其中Caspase-3是下游關鍵的執行蛋白分子[24]。正常情況下，Caspase-3以酶原的形式存在于細胞質中，凋亡早期被上游酶切蛋白激活，形成活化的形式。活化后的Caspase-3通過酶切特異性的底物，使DNA不能正常合成、轉錄和修復，進而導致細胞發生不可逆轉的凋亡[25]。研究顯示，Caspase-3在肝癌的表達水平顯著下調。本文研究結果顯示，枸櫞酸芬太尼處理后的HepG2細胞Caspase-3顯著下調，發生凋亡的細胞數目明顯增加，與前人研究結果一致。實驗結果表明，枸櫞酸芬太尼促進人肝癌HepG2細胞凋亡。

在原發性腫瘤生長早期，腫瘤細胞主要從臨近組織微環境中攝取生長所需養分。當腫瘤生長到直徑超過1～2 mm后，從周圍組織攝取養分已經不能滿足需求，此時腫瘤細胞分泌大量的VEGF細胞，促使腫瘤組織血管生成[26]。血管生成不僅為腫瘤的生長提供必要的養分，也為腫瘤的進入血液循環系統提供基本條件。研究顯示，在腫瘤生長過程中，癌基因的激活、抑癌基因失活都會引起VEGF的高表達[27]。本文研究發現，人肝癌HepG2細胞經枸櫞酸芬太尼處理后，細胞中VEGF的表達顯著下調。與前人研究結果一致，實驗結果提示，枸櫞酸芬太尼可能抑制腫瘤新生血管的形成。

腫瘤從原發部位，經血液或淋巴液等途徑散播，到其他部位繼續生長稱之為腫瘤轉移[28]。惡性腫瘤具有侵襲和遷移能力是其難于治愈的主要原因[23]。近年來大量報道芬太尼具有抑制腫瘤運動的能力。如Look等[29]研究發現，芬太尼通過阻斷Ets-1對BANCR的調節，進而抑制結直腸癌的侵襲和遷移。Marks等[30]的研究結果顯示，芬太尼通過下調miR-182和MMP-9的表達，抑制結直腸癌的增殖和侵襲。本文研究結果顯示，枸櫞酸芬太尼能抑制人肝癌HepG2細胞侵襲和遷移。綜上所述，枸櫞酸芬太尼抑制人肝癌HepG2細胞增殖和運動能力，促進細胞凋亡，對人肝癌HepG2細胞具有抑制作用。