microRNA-373過表達(dá)可促進(jìn)乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移

叢竹軍 張海俊 李 漪

(新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院普外二科，石河子 832008)

乳腺癌發(fā)病率約為29%，列女性惡性腫瘤第一位，死亡率為14%，居女性惡性腫瘤的第一位，嚴(yán)重威脅女性患者的生命安全和生活質(zhì)量[1]。研究顯示，乳腺癌轉(zhuǎn)移是其主要死因，探究乳腺癌的分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、病因和細(xì)胞起源等在改進(jìn)治療方案和鑒別預(yù)后等方面發(fā)揮重要作用[2]。miRNA是內(nèi)源性非編碼蛋白質(zhì)的單鏈RNA，可從轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，異常表達(dá)涉及腫瘤的生長、侵襲、凋亡、侵襲等過程[3,4]。近年來的研究顯示，miRNA-373與胃癌、肺癌發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)，但在乳腺癌中研究較少[5]。本研究通過人工化學(xué)合成的miRNA-373擬似物和阻遏物轉(zhuǎn)染乳腺癌MCF-7細(xì)胞，探討miRNA-373對乳腺癌MCF-7細(xì)胞侵襲的影響，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株與動物 乳腺癌MCF-7購自上海中科院細(xì)胞庫；細(xì)胞培養(yǎng)條件：10%胎牛血清，100 U/ml青霉素鈉和100 mg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，含5%CO2的37℃恒溫箱中孵育。4～6周齡BALB/c無胸腺雌性裸鼠12只，購自山東大學(xué)實驗動物中心，動物合格證號：SCXK(魯)2017-102，動物使用許可證號：SYXK(魯)2017-131。

1.1.2主要儀器和試劑 胎牛血清購自上海慧穎生物科技有限公司，0.25%胰蛋白酶購自上海千曦生物科技有限公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、Trizol和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司；Transwell小室購自北京雅安達(dá)生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱購自上海杰涵實驗設(shè)備有限公司；RT-PCR試劑盒購自深圳市康百得生物科技有限公司；分光光度計、酶標(biāo)儀、PCR儀購自上海譜元儀器有限公司；miRNA-373擬似物、阻遏物、陰性對照物合成與測序均由寶生物工程(大連)有限公司。

1.2方法

1.2.1裸鼠移植瘤模型建立 MCF-7細(xì)胞8×106懸浮于磷酸鹽溶緩沖液中，取200 μl接種于裸鼠腋窩皮下，腫瘤平均體積達(dá)到100～200 mm3時進(jìn)行觀察。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞，胰酶消化后1 000 g離心2 min，收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個/ml，接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔添加2 ml細(xì)胞懸液，37℃ 5%CO2條件下培養(yǎng) 24 h，共分為4組，即空白對照組(Blank control group，BC組)只轉(zhuǎn)染試劑，陰性對照組(Negative control group，NC組)轉(zhuǎn)染miRN-373陰性對照物，miRNA-373擬似物轉(zhuǎn)染組(Mimetic transfection group，MT組)轉(zhuǎn)染miRNA-373擬似物，miRNA-373阻遏物轉(zhuǎn)染組(Repressor transfection group，RT組)轉(zhuǎn)染miRNA-373阻遏物，轉(zhuǎn)染過程按照Lipofectamine 2000說明進(jìn)行。

1.2.3轉(zhuǎn)染后MCF-7細(xì)胞miRNA-373表達(dá)檢測 轉(zhuǎn)染后48 h，采用6孔板接種密度2×105個/孔，酚氟仿法抽取RNA，取2 μg總RNA，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，取2 μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為PCR反應(yīng)模板，熒光定量法檢測miRNA-373含量。引物序列：miRNA-373，上游：5′-GTAGCAGGATGGCCCTAGAC-3′，下游：5′-CGCCCTCTGAACCTTCTCTT-3′；內(nèi)參(RNU6-B)，上游：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游：5′-AACGCTTCACGAATTTGC-3′。

1.2.4轉(zhuǎn)染后MCF-7細(xì)胞侵襲能力檢測 取轉(zhuǎn)染后HCF-7細(xì)胞1×105ml-1，接種于Transwell板上室，每孔160 μl，加入20%ASPS血清40 μl，800 μl RMPI1640培養(yǎng)基加入下室，培養(yǎng)24 h，計數(shù)基底膜下室細(xì)胞數(shù)，采用在×400顯微鏡下隨機(jī)選取中央和上下左右5個視野的穿越基底膜細(xì)胞數(shù)，取均值。

1.2.5癌組織miRNA-373表達(dá) 取12只裸鼠的癌組織和癌旁組織，Trizol法抽提總RNA并進(jìn)行純化，采用qRT-PCR法檢測癌組織和癌旁組織中miRNA-373的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1癌組織和癌旁組織miRNA-373表達(dá)比較 qRT-PCR檢測顯示，乳腺癌組織miRNA-373表達(dá)顯著低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

2.2轉(zhuǎn)染后MCF-7細(xì)胞miRNA-373表達(dá)比較 qRT-PCR檢測顯示，轉(zhuǎn)染后BC組和NC組miRNA-373表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，MT組miRNA-373表達(dá)顯著高于BC組、NC組和RT組(P<0.05)，RT組miRNA-373表達(dá)顯著低于BC組、NC組和MT組(P<0.05)。見圖2。

圖1 癌組織和癌旁組織miRNA-373表達(dá)比較Fig.1 Comparison of miRNA-373 expression in cancer tissues and adjacent tissues

圖2 轉(zhuǎn)染后MCF-7細(xì)胞miRNA-373表達(dá)比較Fig.2 Comparison of miRNA-373 expression in MCF-7 cells after transfection

圖3 轉(zhuǎn)染后MCF-7細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)比較Fig.3 Comparison of transmembrane cells′ number in MCF-7 cells after transfection

2.3轉(zhuǎn)染后MCF-7細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)比較 MT組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著低于BC組、NC組和RT組，RT組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著高于BC組、NC組和MT組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；BC組和NC組穿膜細(xì)胞數(shù)相比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

3 討論

Yang等[6]及Huang等[7]研究均顯示，低表達(dá)的miRNA-373可通過上調(diào)靶基因提高腫瘤細(xì)胞增殖能力，促進(jìn)細(xì)胞的生長和侵襲。Wang等[8]研究顯示，靶向下調(diào)miRNA-373表達(dá)可誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞增殖。曲蘊(yùn)慧等[9]研究顯示，microRNA-373可介導(dǎo)Bcl-6抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。武衛(wèi)華等[10]研究則顯示，通過轉(zhuǎn)染方式表達(dá)microRNA可增加鈣黏蛋白表達(dá)，降低體外培養(yǎng)的人腹腺癌A549細(xì)胞的遷移能力。以上結(jié)果初步揭示了miRNA-373表達(dá)在惡性腫瘤的增殖侵襲過程中發(fā)揮重要作用。

本研究首先通過建立裸鼠MCF-7移植模型，探討了miRNA-373在乳腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示癌組織miRNA-373表達(dá)顯著低于癌旁組織，提示miRNA-373在乳腺癌組織中低表達(dá)。本研究同時通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染miRNA-373擬似物和阻遏物至乳腺癌MCF-7細(xì)胞，RT-PCR檢測結(jié)果顯示擬似物轉(zhuǎn)染組MCF-7細(xì)胞miRNA-373表達(dá)顯著高于空白對照組和陰性對照組，阻遏物轉(zhuǎn)染組MCF-7細(xì)胞miRNA-373表達(dá)顯著低于空白對照組和陰性對照組，Transwell小室研究顯示，擬似物轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著低于空白對照組和陰性對照組，阻遏物轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著高于空白對照組和陰性對照組，結(jié)果提示，乳腺癌MCF-7細(xì)胞的侵襲和遷移能力受miR-373調(diào)控，增強(qiáng)miRNA-373可降低MCF-7細(xì)胞侵襲和遷移能力，為乳腺癌治療的新基因靶點藥物的開發(fā)提供了思路。