白樺脂醇通過抑制PI3K/AKT途徑抑制宮頸癌小鼠移植瘤增殖①

剛小青 吳衡慧 周文磊

(河南省人民醫院婦科,鄭州 450000)

宮頸癌是全球主要的健康問題，是女性癌癥死亡的第二常見原因，每年造成27萬人死亡[1]，占癌癥死亡人數的8%[2]。盡管已經為預防宮頸癌做出了努力，但在過去的幾十年里，子宮頸癌的發病率仍在增加[1]。標準治療包括手術治療、放療和化療。化療有很大的副作用，比如順鉑，不僅對人體產生嚴重的副作用還會使腫瘤產生耐藥性[3]。因此，迫切需要開發其他治療宮頸癌的藥物[4]。白樺脂醇(Betulin)是一類可以從多種植物中提取的帶有羽扇烷骨架[3β-lup-20(29)-en-3,28-diol]的五環三萜類化合物[5]。白樺脂醇擁有廣泛的生物學活性，如抗癌、抗病毒和抗炎作用[6，7]，已經被證明對幾種類型的癌癥細胞有抑制作用，包括RCC4、DLD-1、PC-3、HeLa、SK-HEP-1、HepG2、A549和MCF-7細胞，其機制是通過誘導凋亡相關的線粒體通路促進腫瘤細胞凋亡，發揮抗腫瘤活性[8,9]。然而，白樺脂醇對宮頸癌細胞系c4-1的體內外研究還未見報道。多數關于三萜化合物，包括白樺脂醇或樺木酸抗腫瘤性質的數據，都是從體外研究得來的。本研究的目的是體內研究白樺脂醇是否抑制宮頸癌細胞系c4-1裸鼠移植瘤的生長及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑 白樺醇酯購自美國Selleck公司，分子式為C30H50O2，分子量 442.72，純度=99.05%;TUNEL試劑盒(In Situ Cell Death Detection Kit)購自羅氏(Roche)；抗Ki67和抗VEGF免疫組化抗體購自賽默飛世爾公司；抗PI3K和磷酸化PI3K(P-PI3K)、抗AKT和磷酸化AKT(P-AKT)抗體購自Abcam公司；蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒購自Solarbio公司；Waymouth′s MB 752/1 培養基和胎牛血清購自美國Gibco公司。

1.1.2細胞系和實驗動物 宮頸癌細胞系c4-1 (ATCC?CRL-1594TM)購自ATCC，培養于完全培養基Waymouth′s MB 752/1 含10%胎牛血清,37℃恒溫培養于CO2培養箱中。無病原體(SPF級)雌性裸鼠(BALB/c)，13～15 g，4周齡，購自上海賽萊科實驗動物有限公司。裸鼠在無病原體條件下喂養，并根據國家衛生研究院對實驗動物的護理和使用進行研究。所有動物的手術和護理都得到了機構倫理委員會的批準。

1.2方法

1.2.1移植瘤模型建立和分組 白樺醇酯溶解到DMSO中，配制成20 mg/ml儲藏液。異種移植瘤模型建立：將1×106宮頸癌細胞系c4-1細胞(100 μl)通過皮下注射植入6周的雌性BALB/c裸鼠，7 d內異種移植瘤出現表示模型建立成功，隨后分為：對照組(DMSO)、白樺脂醇低劑量組(Betulin 50)：模型組裸鼠腹腔注射Betulin 50 mg/kg體重、白樺脂醇高劑量組(Betulin 200)：模型組裸鼠腹腔注射Betulin 200 mg/kg體重；腹腔注射藥物或DMSO持續1周，3次/d。

1.2.2腫瘤體積測定和裸鼠生存率測定 腫瘤大小用長徑(L)和短徑(W)計算，計算公式為：腫瘤體積V (mm3) =L×W2/2。用游標卡尺每5 d測量一次。在停止治療30 d后，采取頸椎脫臼處死裸鼠。將3組裸鼠培養30 d，每天記錄存活裸鼠數量，制成存活曲線。

1.2.3免疫組化 免疫組化檢測Ki67和VEGF表達。切片脫蠟復水處理，用3%過氧化氫在37℃處理10 min。然后，用10%正常山羊血清在37℃封閉30 min。隨后，在4℃過夜孵化抗Ki67和VEGF抗體。用PBS沖洗3次后，在室溫下孵育二抗30 min，然后加入顯色試劑3′3′-二氨基苯胺，用光學顯微鏡觀察凋亡細胞并拍照。

1.2.4TUNEL染色 二甲苯脫蠟，每次5 min ；梯度乙醇(100%、95%、90%、80%、70%)復水，每次3 min；Proteinase K 工作液在25℃消化組織15 min ；PBS 漂洗；按照說明書進行TUNEL染色，漂洗；玻片干燥后加50 μl converter-POD 于標本上，加蓋玻片在暗濕盒中37℃反應30 min，漂洗；在組織處加50 μl DAB 底物，在25℃下反應10 min，漂洗；拍照，然后用蘇木素復染3～5 s，立即用自來水沖洗。梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。加一滴PBS在視野下，用光學顯微鏡觀察TUNEL陽性細胞。

1.2.5Western blot檢測蛋白相對表達水平 液氮研磨各組腫瘤組織，冰上裂解，提取組織中總蛋白；用BCA試劑盒進行蛋白定量；取等量蛋白與Loading buffer混合，100℃金屬浴10 min；離心，取上清上樣到SDS-PAGE凝膠電泳中分離蛋白，并轉移至 0.22 μm 孔徑的PVDF膜；5%的脫脂奶粉室溫封閉1～2 h；加入抗PI3K及磷酸化PI3K(p-PI3K)和AKT及磷酸化AKT(p-AKT)的一抗，4℃過夜孵育，次日，TBST清洗后再加標記HRP的二抗，室溫孵育1 h，清洗。最后加入ECL發光液，于凝膠成像系統進行曝光拍照，并用Image J軟件統計灰度值計算相對表達量。GAPDH作為內參，進行3次獨立的重復實驗。

1.3統計學分析 本實驗所有對比數據用SPSS 16.0軟件進行統計學分析，兩兩比較用獨立的t檢驗，分析比較處理組與對照組之間腫瘤體積、裸鼠存活率、凋亡率以及蛋白表達的差異。以上各組檢驗標準取P<0.01為差異具有顯著統計學意義。

2 結果

2.1白樺脂醇減小宮頸癌c4-1移植瘤體積 觀察3組移植瘤并拍照，分別計算3組移植瘤的體積。如圖1A所示，對照組(DMSO)腫瘤明顯較大，且含有豐富的血管，而白樺脂醇低劑量組(Betulin 50)和白樺脂醇高劑量組(Betulin 200)腫瘤依次較小，且看不到明顯的血管組織。統計腫瘤體積，如表1和圖1B所示，白樺脂醇低濃度和高濃度均能抑制腫瘤體積增長(P<0.01)。

2.2白樺脂醇提高宮頸癌c4-1移植瘤裸鼠生存率 白樺脂醇移植瘤模型建立后，每天統計裸鼠的存活率。存活曲線如圖2所示，可以看到，對照組(DMSO)沒有進行治療，注射10 d后生存率顯著下降(P<0.01)；而注射白樺脂醇的低劑量組(Betulin 50)和高劑量組(Betulin 200)10 d后存活率沒有下降，且高劑量組(Betulin 200)存活率>低劑量組(Betulin 50)存活率(P<0.01)。

2.3白樺脂醇下調c4-1移植瘤中Ki67和VEGF蛋白表達 免疫組化原位檢測Ki67和VEGF的表達情況，如圖3A、B所示，同一視野下，對照組(DMSO)Ki67和VEGF陽性細胞較多；與對照組(DMSO)相比，加藥組(Betulin 50)和(Betulin 200)染色細胞大大減少。白樺脂醇明顯減少c4-1移植瘤中Ki67陽性細胞率和VEGF陽性細胞率(P<0.01)。

2.4白樺脂醇促進c4-1移植瘤細胞凋亡 TUNEL結果如圖4A所示，對照組(DMSO)染色細胞很少；與對照組(DMSO)相比，加藥組(Betulin 50)和(Betulin 200)染色細胞明顯增加(P<0.01)，尤其是(Betulin 200)組，出現了大量染色的凋亡陽性細胞。統計凋亡細胞數結果如圖4B所示，明顯看出低濃度和高濃度白樺脂醇均能促進c4-1細胞凋亡。

圖1 白樺脂醇減小宮頸癌c4-1移植瘤體積Fig.1 Betulin reduced tumor volume of cervical cancer c4-1 xenograft tumorNote: *.P<0.01 vs DMSO group.

表1 腫瘤體積Tab.1 Tumor volume

2.5白樺脂醇抑制PI3K/AKT信號 磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/AKT通路是細胞中抑制凋亡的重要通路。Western blot 分析腫瘤中P-PI3K/AKT表達情況，如圖5A所示，對照組(DMSO)P-PI3K/AKT呈高表達狀態；與對照組(DMSO)相比，加藥組(Betulin 50)和(Betulin 200)P-PI3K/AKT表達水平明顯被抑制(P<0.01)。統計灰度值，計算P-PI3K/PI3K、P-AKT/AKT的比值，如圖5B所示，低濃度和高濃度白樺脂醇抑制PI3K/AKT磷酸化激活，從而抑制該通路。

圖2 白樺脂醇提高宮頸癌c4-1移植瘤裸鼠生存率Fig.2 Betulin improved survival rate of nude mice with cervical cancer c4-1 xenograft tumorNote: *.P<0.01 vs DMSO group.

圖3 白樺脂醇降低Ki67 和VEGF的表達水平Fig.3 Betulin decreased expression levels of Ki67 and VEGFNote: *.P<0.01 vs DMSO group.

圖4 白樺脂醇促進c4-1移植瘤細胞凋亡Fig.4 Betulin promoted apoptosis of tumor cells in cervical cancer c4-1 xenograft tumorNote: *.P<0.01 vs DMSO group.

圖5 白樺脂醇抑制PI3K/AKT信號通路Fig.5 Betulin inhibited PI3K/AKT signaling pathwayNote: *.P<0.01，vs DMSO group.

3 討論

天然化合物誘導癌細胞凋亡是治療和預防腫瘤的機制之一。白樺脂醇是一種具有藥理活性的三萜，天然存在于樺樹皮中。有研究報道，白樺脂醇在人肺、宮頸癌和肝癌細胞中具有抗癌作用[11]。宮頸癌在盆腔和盆腔主動脈淋巴結的擴散是常見現象，宮頸癌患者的預后不良主要來源于高頻率的轉移[12]。如果宮頸癌細胞的高轉移能力可以通過“靶向”治療有效地消除，那么宮頸癌患者的預后就可以大大改善。腫瘤血管生成在腫瘤的生長、侵襲和轉移過程中起著重要的作用。血管內皮生長因子(VEGF)，通過自分泌和或旁分泌機制促進腫瘤血管生成和腫瘤侵襲。VEGF的表達增加，促進腫瘤血管生成[13]。因此，下調VEGF的表達可能有效抑制腫瘤促血管生成作用。本文研究結果表明，白樺脂醇抑制宮頸癌c4-1移植瘤的生長，支持證據為白樺脂醇治療后，腫瘤體積明顯減小；Ki67表達降低。同時，本研究還觀察到白樺脂醇下調宮頸癌c4-1移植瘤中VEGF表達，且觀察到移植瘤血管減少。表明白樺脂醇抑制宮頸癌c4-1移植瘤的血管生成。該研究結果提示白樺脂醇可能通過抑制血管新生，使腫瘤生長減緩或抑制腫瘤生長或由于血供不足而誘導腫瘤凋亡。上述證據表明，白樺脂醇抑制宮頸癌c4-1移植瘤生長和存活。

藥物的抗腫瘤活性一般體現在抑制生長，抑制生長的主要方式一般為促凋亡和抑制增殖兩個方面。因此，本文檢測了白樺脂醇對宮頸癌c4-1移植瘤細胞凋亡的影響。前人研究表明，白樺脂醇可以促進多種癌細胞凋亡。例如，白樺脂醇可以通過調節TRAIL受體和TNFR1從而調節抗凋亡或促凋亡蛋白的表達進而促進人腎癌細胞RCC4凋亡[8]；白樺脂醇可促進人類黑色素瘤細胞518A2、人肺癌細胞A549、頭頸癌細胞、乳腺癌細胞MCF-7和結腸癌細胞 HT-29凋亡[14]。本文TUNEL實驗證明白樺脂醇可以促進宮頸癌c4-1細胞凋亡，與上述研究結果一致。

據報道，三萜類化合物通過調節PI3K/Akt通路誘導細胞周期阻滯和凋亡[15]。PI3K/Akt是一種細胞內信號通路，在調節多個細胞過程中起重要作用。PI3K/Akt通路的激活已被證實能促進癌細胞的細胞存活[16]。PI3K/Akt信號通路是一個重要的抗癌靶點，尤其是線粒體凋亡，因為Akt通過蛋白翻譯途徑對線粒體呼吸活動進行調控[17,18]。生長因子和激素觸發一個PI3K磷酸化事件，進而協調細胞生長、細胞周期進入、細胞遷移和細胞存活[19]。此外，PI3K通路通過下游分子Akt發揮作用，調節各種細胞功能，包括細胞增殖、細胞轉化、細胞凋亡、腫瘤生長和血管生成[20，21]。鑒于PI3K/Akt在腫瘤細胞中的重要作用，本文探究了白樺脂醇是否改變了c4-1細胞中 PI3K、AKT表達和磷酸化狀態。本文Western blot 實驗結果證明，白樺脂醇明顯抑制了PI3K、AKT磷酸化水平，抑制了PI3K/Akt信號激活，抑制宮頸癌c4-1移植瘤存活。本研究表明白樺脂醇是通過調節PI3K/Akt信號誘導宮頸癌細胞凋亡，與上述白樺脂醇抗腎癌機制研究有所不同。說明白樺脂醇在不同癌細胞中的作用機制可能不一樣，或存在交叉調控，需要進一步研究。

綜上所述，三萜化合物白樺脂醇可以通過抑制PI3K/Akt信號通路，從而下調Ki67和VEGF表達，促進宮頸癌c4-1移植瘤細胞凋亡，最終導致宮頸癌c4-1移植瘤存活抑制。本文研究補充了白樺脂醇抗癌的相關機制，并提示白樺脂醇可能作為治療宮頸癌的潛在藥物。