用自制單克隆抗體建立檢測NGAL的膠體金方法

郭會燦 李君華 武曉莉 張麗媛 徐冬梅

(石家莊職業技術學院，石家莊 050000)

人中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(Neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)，是Lipocalin 家族的成員，NGAL發現于中性粒細胞中的過氧化物酶的陰性顆粒中[1]，經研究發現在人體盲腸、胃、子宮、唾液腺等多種組織器官中的表達都很穩定。研究顯示，NGAL參與了炎癥、免疫應答、趨化作用、信號轉導的過程，并與多種腫瘤的發生發展有密切關系，NGAL在急性腎損傷早期的患者尿液中含量會迅速升高，因此作為新型腎損傷標志物受到廣泛的關注[2]。國內外醫院和生物醫藥公司對NGAL診斷研究正處在白熱化階段，雖然有部分公司已經取得一定成果，但多數停留在臨床研究階段。目前只有丹麥BioPorto公司生產的NGAL試劑盒通過了歐盟認證并批準生產銷售[3]。國外進口NGAL檢測試劑盒在價格上必然昂貴，一方面給患者增加了診療成本，同時也限制了該項檢測在臨床上的普及和應用。隨著即時檢測(POCT)[4]和電化學發光技術的飛速發展[5]，這些技術以高特異、高靈敏度的抗體原料為基礎，成為醫學研究的一個熱門方向。本文制備了高靈敏度、高特異性的NGAL單克隆抗體，在此基礎上初步建立了NGAL免疫膠體金層析試紙條檢測方法，為臨床早期腎損傷診斷提供了快速、便捷、準確的檢測方法。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗材料 弗氏佐劑(包括完全和不完全)、抗體亞型檢測試劑盒購自Sigma公司；硝酸纖維素膜、PVC板、玻璃纖維膜、吸水墊等購自MILLI-PORE；HRP羊抗小鼠IgG購自北京中杉金橋；重組人NGAL(rhNGAL)為本實驗室自表達；其他化學試劑為分析純；BALB/c小鼠由本實驗室飼喂；S/P20小鼠骨髓瘤細胞由本實驗室傳代保存。

1.1.2臨床樣本 臨床樣本為患者尿液，來自河北醫科大學第二醫院腎內科門診，經酶聯免疫吸附試劑盒檢測后的已知結果樣本。

1.2方法

1.2.1NGAL單克隆抗體的制備[6]選用5只BALB/c小鼠，采用背部多點免疫的方法，首次采用弗氏完全佐劑進行免疫，以后每2周采用弗氏不完全佐劑進行免疫。通過細胞融合技術制備雜交瘤細胞株，經有限稀釋法篩選特異性抗NGAL單克隆抗體。將建株細胞混合石蠟注入小鼠腹腔，誘生腹水獲得大量單一的單克隆抗體。經過硫酸銨沉淀和Protein A柱兩步驟對抗體進行純化即得到純化的NGAL單克隆抗體，分別采用Sigma的亞型試劑盒對抗體進行亞型測定，間接ELISA法測定抗體效價，雙抗夾心法進行配對測定。

1.2.2金標NGAL抗體的制備 在離心管中加入10 ml 膠體金溶液，再加入0.1 mg抗NGAL單克隆抗體，振蕩混勻后調pH至8.8，在室溫下攪拌1 h，用0.1%BSA溶液作為封閉液，繼續攪拌1 h，將上述溶液用超低溫離心機4℃下8 000 r/min離心30 min，保留下層沉淀，用1 ml pH7.5的10 mmol/L的磷酸緩沖液(含0.3%PC300、0.5%BSA%、2%蔗糖)重懸即得金標NGAL抗體溶液，4℃保存備用。

1.2.3金標NGAL抗體偶聯物的質量鑒定

1.2.3.1紫外-可見分光光度計鑒定 在400～600 nm 的可見范圍內，用紫外-可見分光光度計分別對金標NGAL抗體偶聯物和膠體金粒子進行掃描，由于抗體表面會吸附膠體金粒子，體積變大，如果偶聯成功，在最大吸收波長及峰形上膠體金粒子會有變化，也就能驗證金標NGAL抗體偶聯物是否偶聯成功。

1.2.3.2透射電鏡鑒定 通過透射電鏡對金標NGAL抗體偶聯物及膠體金粒子進行粒徑測定，在電鏡相同縮放比例下，查看兩者的粒徑和顆粒表面的變化情況，來判斷是否偶聯成功。

1.2.3.3試紙條鑒定 將羊抗鼠的二抗1∶10稀釋，以10.0 μl的量分別在NC膜上劃線，并標記位置，將其在干燥箱靜置干燥。分別在劃線處滴加金標NGAL抗體(1∶10稀釋)及0.01 mol/L 磷酸緩沖液(作為陰性對照)，5 min后觀察試驗結果。若在滴加金標NGAL抗體的劃線處出現明顯的紅色線條，且滴加磷酸緩沖液的劃線處為無色，則表明金標NGAL抗體具有活性；若劃線處均不顯色，則表明金標NGAL抗體失活或沒有偶聯成功。

1.2.4NGAL膠體金試紙條的制備 將結合墊預先處理后備用，用移液器吸取金標NGAL抗體，均勻涂布在結合墊上，干燥即得；適量的羊抗鼠IgG和配對的抗NGAL抗體用劃膜儀分別噴涂在NC膜(30 cm×2.5 cm)上，作為C線質控線和T線檢測線，干燥備用。NGAL膠體金試紙條由樣品墊、結合墊、NC膜和吸水墊按圖1所示的順序組裝而成。

1.2.5NGAL膠體金試紙條的檢測方法 吸取待檢樣品100 μl，滴在加樣孔內，待檢樣品基于層析原理，會由樣品墊依次經過結合墊、NC膜(檢測線、質控線)到達吸水區。檢測時間僅為5 min，即可顯示結果。

若待檢樣品中含有NGAL，先與吸水墊上的金標NGAL抗體偶聯物結合，層析至NC膜后，與包被在檢測線處的NGAL單克隆抗體結合形成NGAL單克隆抗體-NGAL抗原-金標NGAL抗體復合物，形成紅色可見條帶。結果判定方法：C線和T線均顯色，判為陽性；C線顯色，T線不顯色，判為陰性；T線顯色，C線不顯色或C、T線均不顯色，判為無效。

1.2.6NGAL膠體金試紙條的性能測定

1.2.6.1靈敏度試驗 將1 mg/ml的rhNGAL貯備液稀釋成下列10個濃度梯度，分別為0、2、3、4、5、6、8、10、25、50 ng/ml的標準系列溶液，分別用制備好的NGAL試紙條按1.2.5所述的檢測方法對上述標準溶液進行檢測，每個濃度測試3次，共測試3個批次的NGAL試紙條。

1.2.6.2重復性試驗 分別配制成為陰性、5 ng/ml、50 ng/ml的NGAL標準溶液，每個濃度測試10條，共抽取3批進行測試。

1.2.6.3穩定性試驗 將上述制備好的NGAL試紙條同干燥劑一起用鋁箔袋塑封，在鋁箔袋上標注生產日期，進行穩定性測試。分別貯存在4℃、室溫、37℃三種保存條件下，進行穩定性試驗。其中4℃、室溫貯存的NGAL膠體金試紙條每月檢測一次，37℃貯存的NGAL膠體金試紙條每天檢測一次，分別對陰性樣本和5、10 ng/ml陽性樣本進行測試，觀察穩定性測試結果。

圖1 試紙條組成示意圖Fig.1 Diagram of paper strip composition

1.2.6.4臨床樣本的檢測 使用制作好的NGAL膠體金試紙條對臨床樣本進行檢測，臨床樣本包括30份陽性患者樣本和20份正常體檢者樣本，記錄編號后，打亂順序，進行檢測。檢測結果與臨床結果進行比較，通過兩者結果的一致率來判斷自制的NGAL膠體金試紙條的臨床應用性能。

2 結果

2.1NGAL單克隆抗體鑒定 本研究獲得5株能分泌NGAL單克隆抗體的細胞株，通過雙抗夾心ELISA對分泌的單克隆抗體進行兩兩抗體配對，最后篩選出1B4、2C6兩株分泌的單克隆抗體配對成功。間接ELISA測定1B4效價為1∶1.02×106、親和力達到2×108，亞型為IgG1；2C6效價為1∶5.12×105，親和力達到4×108，亞型為IgM。

圖2 膠體金溶液400～600 nm掃描圖譜Fig.2 Scanning map of colloidal gold solution at 400-600 nm

圖3 金標NGAL抗體2C6偶聯物400～600 nm掃描圖譜Fig.3 Scanning map of anti-NGAL antibody 2C6 conjugate with colloidal gold at 400-600 nm

2.2金標NGAL抗體2C6偶聯物的質量鑒定

2.2.1紫外-可見分光光度儀鑒定結果 圖2、圖3分別為膠體金粒子和金標NGAL抗體2C6偶聯物在400～600 nm波段內經紫外-可見分光光度計掃描的結果，膠體金粒子最大吸收波長為526.0 nm；金標NGAL抗體2C6偶聯物最大吸收波長為536.0 nm。由此看出膠體金標記NGAL抗體后粒徑增大，且最大波長出現紅移，證明偶聯成功。

2.2.2透射電鏡法鑒定結果 經過電鏡觀察，圖4為膠體金粒子透射電鏡結果，顆粒大小均勻圓潤，圖5為金標NGAL抗體2C6偶聯物透射電鏡結果，顆粒變大且邊緣出現不規則絮狀物，由此表明抗NGAL單克隆抗體與膠體金偶聯成功。

圖4 膠體金透射電鏡圖Fig.4 Transmission electron microscopy of colloidal gold

圖5 金標NGAL抗體2C6偶聯物透射電鏡圖Fig.5 Transmission electron microscopy of anti-NGAL antibody 2C6 conjugate with colloidal gold

2.2.3試紙條法鑒定結果 試紙條檢測結果如圖6所示，在羊抗鼠二抗點樣處，加入金標NGAL抗體的出現了紅色條帶，陰性對照則無紅色條帶出現，證明抗NGAL單克隆抗體與膠體金的偶聯物具有活性。

2.3優化NGAL膠體金試紙條 本研究通過兩兩配對的雙抗夾心試驗，篩選出1B4、2C6兩個抗體配對，通過棋盤法確定兩配對抗NGAL抗體的最佳工作濃度。1B4的包被濃度為0.25、0.5、1.0 1 mg/ml，金標抗體2C6的稀釋濃度為1∶5、1∶10、1∶15。如圖7所示，金標NGAL抗體2C6的稀釋濃度為1∶5，1B4包被濃度為0.5 mg/ml這個組合，提供了低的cut-off值、低的抗體用量、深的檢測線和清晰的背景，因此篩選金標抗體1∶5和包被抗體濃度0.5 mg/ml 的稀釋比例作為最佳反應組合來制備NGAL試紙條。

2.4NGAL膠體金試紙條的性能測定

2.4.1靈敏度試驗 3批次NGAL試紙條重復試驗的結果一致，如表1所示，樣本中NGAL含量在5 ng/ml 及以上時，結果測試均為陽性。樣本中NGAL含量為4 ng/ml時，T檢測線較C質控線顏色變淺，沒有完全消失但肉眼分辨不清楚，無法明確判定結果。樣本中NGAL含量低于4 ng/ml時，檢測線基本消失，肉眼很難分辨，測試結果均為陰性。經對不同批次進行反復驗證，結果基本一致，由此確定本NGAL試紙條的檢測限為5 ng/ml。

圖6 試紙條鑒定結果Fig.6 Test strip identification resultsNote: A.Anti-NGAL antibody 2C6 conjugate with colloidal gold was added；B.Negative control.

2.4.2重復性試驗 由表2可知，NGAL濃度為5 ng/ml、50 ng/ml的樣本，重復10次的結果保持一致，均為陽性；陰性樣本重復10次檢測的結果保持一致，均為陰性；由此試驗說明NGAL試紙條在批間和批內的重復性和重現性都很好。

2.4.3穩定性試驗 在4℃、室溫保存的試紙條，追蹤一年的測試中，檢測陰性樣本的質控線清晰，檢測線沒有出現，且背景干凈；檢測5 ng/ml和10 ng/ml 的NGAL陽性樣本時，T檢測線和C質控線顏色深淺一致，并沒有因為保存時間的延長出現顏色變淺的現象，并與對照試紙條比較顏色沒有變弱，說明試紙條在4℃、室溫下可以保存1年的有效期。NGAL試紙條在37℃條件下，前6 d，T檢測線和C質控線顏色深淺一致，且與對照NGAL試紙條比較，顏色沒有變弱，檢測到第7天時，T檢測線相對于對照NGAL試紙條的T檢測線開始變淺，得出試紙條有效期1年。

2.4.4臨床樣本的檢測 通過對自制的NGAL膠體金試紙條對50份臨床樣本的檢測結果比對分析，檢出30份陽性樣本和20份陰性樣本，且結果符合率100%。說明本研究制備的NGAL膠體金試紙條的準確度高、穩定性好，該試紙條在準確度、 靈敏度和穩定性上能與市售成熟的試劑盒相媲美，應用前景廣闊。

圖7 NGAL抗體最佳稀釋濃度組合篩選Fig.7 Optimal dilution concentration combination screening of NGAL antibody

表1 試紙條靈敏度測定Tab.1 Sensitivity determination of strip

表2 試紙條重復性測定Tab.2 Repeatability determination of strip

3 討論

經研究顯示，NGAL作為Lipocalin家族的一個新成員，不但組織分布廣，還參與多種病理、生理過程。Nielsen等[7]對兒童和成人的心臟手術后前瞻性研究發現，在術后2～6 h，在病人的血液和尿液中就能檢測到濃度高于正常值10倍以上的NGAL，Mishra等[8]也通過研究得出急性腎損傷之后，在早期尿NGAL會急速上升，證明了NGAL是心臟手術后急性腎損傷的早期跡象。2011年Hinze等[9]利用ROC曲線對NGAL預測AKI進行了探討，其中曲線下的面積為0.78，敏感性76%，特異性80%，得出了NGAL可以在不聯合肌酐檢測的情況下，獨立預測亞臨床的AKI。2013年最新研究發現NGAL同IL-18、MA、NAG、αl-MG及UCr相比，是預測搭橋后急性腎損傷的最佳分子，可以更早發現腎臟損傷，為臨床治療腎臟損傷提供參考價值[10]。

而本研究研制的NGAL膠體金試紙條，靈敏度高，檢測限為5 ng/ml，與何瑩等[11]建立的雙抗夾心ELISA免疫檢測方法的靈敏度4.8 ng/ml基本一致，但本研究的NGAL試紙條檢測時間短，且成本低，重復性、特異性、穩定性好，保存期長達一年，能夠滿足臨床應用要求，應用前景廣闊。