乳酸菌發酵枸杞過程中理化指標及風味物質的變化

喬博鑫,邢紫娟,郭紅蓮

(天津科技大學食品工程與生物技術學院,天津 300457)

枸杞(Lyciumbarbarum)為茄科(Solanaceae)枸杞屬(Lyclum)植物,在我國寧夏、甘肅、青海等地廣為種植[1-2],其果實含有多糖、脂類、維生素等營養成分,具有滋補肝腎、益精明目等作用,深受人們喜愛[3]。現代醫學證明,枸杞具有調節機體免疫力、增強機體免疫力、抗氧化和抗衰老等多種藥理功能[4]。作為傳統的藥食同源食品,枸杞的加工利用一直是人們關注和研究的重點。

乳酸菌是一類能從發酵性碳水化合物中產生大量乳酸的革蘭氏陽性菌的統稱,可明顯改善食品風味,提高食品營養價值[3],同時乳酸菌又是具備多種功效的腸道有益菌,所以以枸杞為原料進行乳酸菌發酵,可能會產生許多美味又健康的食品。閻淳泰等[5]選用三種乳酸菌混合發酵枸杞汁72 h,得到了既有益生菌活力又有枸杞風味的乳酸菌飲料,郭紅轉[6]以保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌發酵枸杞汁與牛乳混合液,得到枸杞乳飲料;此外還有人用葡萄糖酵母、嗜酸乳桿菌混合發酵枸杞葉浸提漿,研制出口感獨特的枸杞茶[7]等,這些研究在一定程度上揭示了乳酸菌類發酵枸杞的研究已引起人們的關注,但這些報導多是針對枸杞乳酸菌發酵的工藝條件進行的研究,而發酵后產品的風味成分及相關生理活性改變等方面的報導還較少。

本文以枸杞干果為原料,選用保加利亞乳桿菌(L.bulgaricus,簡稱L.b)、嗜熱鏈球菌(S.thermophilus,簡稱S.t)為微生物菌種對枸杞果榨汁進行發酵,研究了具有枸杞特有風味的乳酸菌飲料的發酵工藝條件,以便充分保存枸杞的有效成分和營養功效,滿足消費者的口味和健康需求,同時對乳酸菌發酵過程中的枸杞汁生理成分及風味物質變化進行了探討,確定其營養與風味的變化趨勢,為枸杞發酵汁飲料的功能開發提供數據參考,同時為枸杞相關產品的工業化生產提供理論依據,對提高水果附加值等均具有重要現實意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

寧杞1號枸杞果實 寧夏農林科學院枸杞研究所提供;保加利亞乳桿菌(L.bulgaricus,簡稱L.b)、嗜熱鏈球菌(S.thermophilus,簡稱S.t) 天津科技大學菌種保藏中心;氫氧化鈉 天津市化學試劑廠;葡萄糖 天津市大茂化學試劑廠;考馬斯亮藍G-250、3,5-二硝基水楊酸 國藥集團化學試劑有限公司。

JYL-C010榨汁機 青島九陽世家電器有限公司;TU-1810紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;MP522精密酸度計 上海三信儀表廠;PAL-1糖度計 日本愛拓公司;GCMS-QP2010Ultral氣質聯用儀 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸菌菌懸液的制備 在無菌環境下,將保藏的菌粉接種于固體培養基上活化2次后,挑取平板上單菌落接種于MRS液體培養基中,37 ℃下培養24 h后,在4000 r/min條件下離心20 min,棄上清保留菌體。將菌體用無菌生理鹽水清洗3次后,與無菌生理鹽水混合,配制成濃度為1×108CFU/mL的菌懸液。

1.2.2 發酵工藝 工藝流程:

工藝要點:

前處理:剔除壞果、雜質,選取大小一致、色澤飽滿、無機械損傷的干枸杞。

浸泡:冷水浸泡3 h。

打漿:將浸泡過的枸杞以一定量的料液比在榨汁機中打漿,使之成為枸杞液。

殺菌:90～95 ℃,30 s瞬時殺菌。

接種:將培養好的L.b、S.t菌按照1∶1體積混合后,在無菌操作下接種于枸杞液中。

發酵:選擇合適的接種量添加到枸杞液中,在37 ℃條件下發酵。

1.2.3 單因素實驗 通過預實驗,確定以料液比、發酵時間、接種量為三個主要影響因素,以感官評價值為測試指標,確定發酵因素水平。

料液比:L.b、S.t按1∶1體積混合后,以3%接種量分別加入到料液比為4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1和14∶1 (g/100 mL)的枸杞液中,在37 ℃條件下恒溫發酵24 h后,測定不同料液比的產酸量與感官評價值。

發酵時間:L.b、S.t按1∶1 (V/V)混合后,以3%接種量加入到料液比為8∶1 g/100 mL的枸杞液中,在37 ℃條件下分別發酵4、8、12、16、20、24、28、32、36、40 h后,測定不同發酵時間的產酸量與感官評價值。

接種量:將L.b、S.t按1∶1體積混合后分別以1%、2%、3%、4%、5%和6%的接種量加入到料液比8∶100 g/mL的枸杞液中,在37 ℃條件恒溫發酵24 h后,測定不同接種量的產酸量與感官評分值。

1.2.4 正交試驗 以料液比、發酵時間、接種量為影響因素,采用正交試驗優化枸杞榨汁的發酵工藝,以感官評分值為指標,確定最佳發酵條件,因素和水平設置見表1。

表1 枸杞發酵工藝的試驗因素水平表Table 1 Factors and levels for fermentation process of Lycium barbarum

1.2.5 感官評分 選取食品學院無飲食偏好的師生共9人組成評價小組,對發酵液的口感、外觀、色澤、風味賦分,按照表2對發酵汁進行感官評定,每個測試樣品的感官評分數據去掉最高和最低評分后取算術平均值。

表2 枸杞發酵液的感官評定表Table 2 Sensory evaluation of the fermented broth of Lycium barbarum

1.2.6 枸杞液發酵過程中理化指標分析 采用正交試驗確定的最佳發酵條件對枸杞進行發酵,在37 ℃條件下每隔4 h測定以下指標:活菌數:參照GB4789.35-2016方法[8]進行;pH:利用酸度計測定;可滴定酸測定:按照GB/T12456-2008《食品中總酸的測定》測定[9];還原糖含量:利用3,5-二硝基水楊酸法測定[10];可溶性固形物:利用糖度計測定;可溶性蛋白:利用考馬斯亮藍G-250法測定[11]。

1.2.7 風味物質的測定 參照固相微萃取的方法,以GC-MS聯用儀測定發酵后的風味物質[12]。樣品以Rtx-5MS萃取頭于60 ℃吸附萃取40 min,進樣口解吸15 min。GC/MS-QP2010聯用質譜檢測,進樣口溫度250 ℃,進樣方式:分流,分流比:10∶1,載氣為He,純度99.99%。全掃描范圍30～550 m/z,溶劑延遲時間1.5 min。檢測結果在NIST譜庫檢索,將匹配度大于80%的化合物作為暫定結果,查閱資料進行結果比對,以確定最終檢測結果。

1.3 數據處理

試驗采用Excel、SPSS 25.0及GraphPad Prism 7軟件對數據進行統計。

2 結果與分析

2.1 乳酸發酵枸杞工藝

2.1.1 單因素實驗結果 接種量料液比和發酵時間的單因素實驗結果見圖1～圖3,各因素對感官評分值均具有顯著性影響(p<0.05)。當料液比為8∶1 g/100 mL時,發酵液的感官評分值最佳(圖1),乳酸菌發酵枸杞液的最適時間為24 h(圖2),枸杞發酵液的感官評分值在接種量為3%時達最佳(圖3)。

圖1 料液比對發酵液感官品質的影響結果Fig.1 Effects of material liquid ratio on sensory quality of fermentation broth 注:不同小寫字母代表差異顯著,p<0.05,圖2～圖3同。

圖2 發酵時間對發酵液感官品質的影響結果Fig.2 Effects of fermentation time on sensory quality of the fermented broth

圖3 接種量對發酵液感官品質的影響結果Fig.3 Effects of inoculum on sensory quality of fermentation broth

2.1.2 正交優化結果 以枸杞發酵后的感官評分為指標,確定了影響枸杞發酵液的感官品質因素順序為:發酵時間>接種量>料液比,最佳發酵條件為A2B2C3,即枸杞發酵飲料的工藝條件為接種量4%,料液比8∶1 g/100 mL,發酵時間24 h(表3),該條件下感官評分值為81分。

表3 枸杞發酵工藝的正交試驗結果Table 3 Orthogonal test results of fermented Lycium barbarum

對上述工藝條件進行驗證性發酵,結果確定發酵液口感酸甜,有枸杞特有的風味,感官評分為81分,與正交試驗結果相符。

對感官評分進行方差分析(表4)可知,發酵時間對枸杞發酵液感官評分的影響具有極顯著性差異(p<0.01),料液比和接種量對枸杞發酵液感官評分有顯著性影響(p<0.05)。

表4 感官評分方差分析Table 4 Variance analysis of sensory scores

2.2 乳酸發酵枸杞過程中理化指標的變化

2.2.1 乳酸菌數量的動態 發酵液中的菌體數量在0～20 h內迅速增加(圖4),這可能是由于乳酸菌利用發酵液中的可發酵糖等充足的營養物質進行繁殖和代謝的結果[13]。20 h后,活菌菌數上升趨勢減慢,乳酸菌緩慢生長,進入穩定期。發酵28 h后,發酵液中的活菌數開始緩慢減少;發酵28～40 h內,發酵液中活菌數減少的速度呈慢-快-慢的趨勢,這可能由于發酵飲料中營養物質消耗過多,產酸過多抑制了菌種的繁殖,菌種進入衰退期。

圖4 發酵過程中活菌數變化曲線Fig.4 Change curve of viable cell count during fermentation

2.2.2 發酵液酸度的變化 由圖5可以看出,隨發酵時間的不斷進行,發酵液中pH逐漸降低,可能是乳酸菌利用自身酶類物質使枸杞液中的碳水化合物和脂肪降解成有機酸或者脂肪酸[14]。當pH降至3.6(36 h)左右時,pH趨于穩定狀態,這是因為發酵液中代謝產物積累,營養物質大量消耗。

圖5 發酵過程中pH的變化Fig.5 Changes in pH during fermentation

2.2.3 發酵過程中可滴定酸的變化 酸度是衡量枸杞發酵飲料品質的重要指標。如圖6在乳酸菌發酵枸杞榨汁的過程中,在發酵24 h前,發酵液中可滴定酸快速增加,24 h時枸杞液的酸度達到62.60 °T。由于乳酸菌在發酵過程中利用枸杞中的單糖、多糖等碳水化合物產生乳酸、乙酸等[15],這些有機酸既提高了枸杞發酵飲料的營養物質,又形成了枸杞發酵飲料的風味,還具有一定的抑菌效果,對枸杞發酵飲料的生產具有重要影響。

圖6 發酵過程中可滴定酸的變化Fig.6 Changes of titratable acid during fermentation

2.2.4 發酵過程中還原糖的變化 枸杞液初始還原糖含量為2.790 mg/mL,發酵時間8 h內還原糖的含量變化趨勢緩慢(如圖7)。8 h后隨著發酵的進行,枸杞液中的還原糖含量迅速降低,這可能是因為乳酸菌利用枸杞液中的單醣,轉化為低分子的乳酸或乙酸。發酵28 h后,枸杞液中的還原糖降低到0.267 mg/mL,隨后變化趨于平緩,說明還原糖已經基本被消耗。

圖7 發酵過程中還原糖含量的變化Fig.7 Change of reducing sugar content during fermentation

2.2.5 發酵過程中可溶性固形物的變化 從圖8可以看出,在0～8 h內枸杞發酵液中的可溶性固形物逐漸增加,這是由于發酵過程中枸杞中的內部物質溶出,使得可溶性固形物增多。在8～20 h中枸杞發酵液中的可溶性固形物快速減少,因為乳酸菌在繁殖過程中大量消耗碳水化合物。在20～32 h中枸杞發酵液中的可溶性固形物緩慢減少,這是因為乳酸菌的增殖進入平穩期。在32～40 h中枸杞發酵液中的可溶性固形物含量逐漸趨于平穩,這是因為乳酸菌的增殖進入衰退期。

圖8 發酵過程中可溶性固形物的變化Fig.8 Changes of soluble solids during fermentation

2.2.6 發酵過程中可溶性蛋白含量的變化 在乳酸菌發酵枸杞液過程中,時間對發酵液中的可溶性蛋白含量有明顯影響(如圖9)。由圖9可知,在0～24 h內枸杞發酵液中的可溶性蛋白含量明顯增多,這是由于在發酵過程中,菌體會產生蛋白酶,在蛋白酶的作用下發酵液中的蛋白含量逐漸升高。發酵24 h后枸杞發酵液中蛋白含量迅速降低,這是由于可溶性蛋白會逐漸分解為具有多種香氣的氨基酸,以維持乳酸菌自身的生長。

圖9 發酵過程中可溶性蛋白質含量的變化Fig.9 Changes in soluble protein content during fermentation

2.3 發酵前后枸杞飲料中風味物質分析

香氣成分是檢測發酵飲料風味的主要指標，本實驗使用GC-MS技術分離鑒定枸杞液發酵前后的揮發性成分。圖10～圖11分別為枸杞液發酵前后香氣成分總離子流圖，鑒定結果見表5。從表5可知,未發酵枸杞液中分析出32種成分,包括1種酯類、12種醛類、8種酮類、11種醇類共4類物質;發酵后的枸杞液中分析出63種化合物,主要的揮發物質包括12種酯類、16種醛類、15種酮類、13種醇類、4種酸類、芳香雜環類3種共6類物質。未發酵的枸杞液中,醇類、醛類、酮類物質相對含量高,對未發酵枸杞的風味貢獻大。如壬醛有明顯的油脂氣味和甜橙氣息,己醛具有天然的水果香氣及青草、油脂氣味。1-戊烯-3-醇、己醇、1-辛醇、1-壬醇、3-甲基-1-丁醇賦予枸杞一種令人愉快的氣味,如1-戊烯-3-醇是存在于橙子、草莓、番茄等水果中的一種果香。酮類使未發酵枸杞飲料表現出獨特的風味,如2,3-丁二酮會有濃郁的奶油香味。

圖10 枸杞未發酵液的香氣成分總離子流圖Fig.10 Total ion currents of aroma components of unfermented beverage of Lycium barbarum

圖11 枸杞發酵液的香氣成分總離子流圖Fig.11 Total ion currents of aroma components of fermented beverage of Lycium barbarum

表5 枸杞發酵前后揮發性物質GC-MS分析結果Table 5 GC-MS analysis of volatile components of Lycium barbarum before and after fermentation

續表

發酵后的枸杞液中,醇類、酯類物質相對含量較高。與發酵前相比,發酵后的枸杞液中,醇類物質種類和含量均有改變,正己醇成為枸杞發酵液的主要風味物質,具有果子香氣。酯類物質含量明顯增加,酯類物質具有成熟果香味或堅果味,對發酵液的整體風味具有促進作用,不同的酸和醇結合產生多種類具有不同香味的酯類,也是香氣成分的主要組成。酮類、醛類物質相對含量明顯下降,醛類是枸杞發酵液中的主要風味成分,給枸杞液帶來獨特的花香味。新增少量酸類、芳香雜環類物質,酸類物質可以使產品具有酸味感。呋喃類化合物具有水果香、焦糖香、烤香味,也是發酵產品的重要風味物質。

綜合上述,經發酵后的枸杞揮發性化合物的種類明顯增多,說明發酵過程中增加了枸杞發酵液的風味。

注：-代表在未發酵枸杞液中未檢出。

3 結論

本研究通過單因素及正交實驗優化實驗研究了乳酸菌發酵枸杞的工藝,確定了選用保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌為菌種時的發酵工藝:接種量4%,料液比8∶1 g/100 mL、發酵時間24 h。該工藝下乳酸菌發酵枸杞過程中可滴定酸逐漸上升，pH及還原糖含量不斷下降，活菌數、可溶性固形物含量、可溶性蛋白含量呈先升后降的趨勢。通過發酵,產生了新的香氣成分,枸杞發酵液中酯類成分明顯增加,另外還發現了3種芳香雜環類物質,因此,枸杞發酵液中呈香物質的明顯增多,可能是其風味更為獨特的原因。

枸杞汁經乳酸菌發酵后其活菌數增加,風味大大改善,這類食品往往由一般的營養食品發展成為具有特殊效果的功能性食品,因而對其功能成分和風味物質的變化進行深入研究,對于增加枸杞果實的綜合利用有重要意義。