菱角殼分級萃取物對腫瘤細胞增殖及凋亡的影響

范艷慧,代 鈺,單恬恬,易 陽,3,王宏勛,3,王麗梅,3,*

(1.武漢輕工大學生物與制藥工程學院,湖北武漢 430023; 2.武漢食品化妝品檢驗所,湖北武漢 430023; 3.湖北省生鮮食品工程技術研究中心,湖北武漢 430023)

菱(Trapasp.)又名菱角、水菱角、風菱,是一年生浮水或半挺水草本植物。迄今已有3000多年的栽培歷史,在我國長江流域亞熱帶地區分布最多[1-2]。成熟菱角按角的有無和種類劃分為不同品種,如無角的南湖菱(TrapaacornisNakano)、二角菱(T.bispinosaRoxb)和四角菱(T.quadrispinosa)。

菱角營養豐富,藥用價值也非常高,歷代醫家視菱為“養生之果”、藥膳佳品。《本草綱目》載:菱能補脾胃,強股膝,安中補五臟、解丹石毒、補中延年、健力益氣,菱粉粥有益胃腸,可解內熱[3-4]。近年對菱角的化學成分也進行了較廣泛的研究,表明菱角中含有生物堿、黃酮類、多酚類、多糖類等成分[5-10];菱角提取物有抗腫瘤[11-13]、抗氧化[14-17]、抗感染[18-20]、降血糖[21-22],尤其在抗癌方面的研究成果顯著。目前有關菱角殼的研究報道并不多，而關于菱角殼萃取方面的研究更是寥寥無幾。陳百泉等[23]將南湖菱殼提取液分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,乙酸乙酯部位和正丁醇部位采用色譜法分離得到9個化合物,從乙酸乙酯萃取液中分離得到的單體化合物齊墩果酸、熊果酸具有明顯降糖作用。康文藝等[24]將南湖菱殼醇提取液分別用乙酸乙酯、石油醚、正丁醇萃取,研究各萃取部位對急性肝損傷小鼠的治療作用,結果表明乙酸乙酯部位提取物和正丁醇部位提取物均能顯著降低肝損傷小鼠血清中的GPT、GOD含量及小鼠肝組織中MDA含量,并能顯著提高SOD活力,可以用來制備保肝護肝藥物。林秋生[25]采用不同極性溶劑萃取后發現,多酚和黃酮類物質主要富集到乙酸乙酯相,皂苷類物質富集到氯仿和石油醚相,乙酸乙酯相和氯仿相顯示出較強的抑制胃癌SGC7901細胞生長的效果。

腫瘤是威脅人類健康的重大疾病,目前普遍認為惡性腫瘤化學治療藥物引起腫瘤退縮的機制在于促進腫瘤細胞死亡和阻止其增殖,而細胞死亡既可以通過壞死又可通過凋亡的形式進行[26]。與壞死不同,凋亡的細胞維持完整的細胞膜結構和功能,細胞解體后形成凋亡小體,不引起周圍組織炎癥反應[27],細胞凋亡成為惡性腫瘤化療的新目標。本研究通過比較菱角殼不同萃取物對腫瘤細胞的生長抑制作用和促腫瘤細胞凋亡的能力,旨在尋找抗腫瘤活性較強的部位,為深入研究菱角殼的抗腫瘤作用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人胃癌細胞SGC-7901、人肝癌細胞Hep G2 百奧斯生物公司;無水乙醇、正丁醇、乙酸乙酯 國藥集團化學試劑有限公司;DMEM高糖、PBS Hyclone公司;0.25%胰酶溶液 杭州吉諾生物公司;胎牛血清、雙抗 杭州四季青生物工程公司;CCK-8 試劑 南京恩晶生物科技有限公司;細胞凋亡檢測試劑盒 索寶來生物技術有限公司;菱角殼 武漢飛揚生物技術有限公司;蘆丁標準品、沒食子酸標準品 上海源葉生物科技有限公司。

HR1848料理機 荷蘭皇家飛利浦公司;RE-3000A旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 上海科爾儀器設備有限公司;SB-5200DTN數控超聲波清洗器 寧波新芝生物科技股份有限公司;YXQ-50SII立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博訊實業有限公司;SCHP-80 CO2培養箱 常州恒德儀器有限制造公司;Sunrise酶標儀 美國 thermo;AXTD5A臺式低速離心機 鹽城市安信實驗儀器有限公司;SCIENT2-12N冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菱角殼醇提物分級萃取物的制備 參照侯莉莉[28]的制備工藝稍作修改,將晾干的菱角殼磨碎,按料液比1∶10 g/mL加入70%乙醇,60 ℃恒溫水浴加熱30 min,50 ℃超聲提取45 min,60 ℃再水浴加熱30 min,抽濾收集提取液,旋蒸濃縮,冷凍干燥得到菱角殼醇提物。

將醇提物加50 mL蒸餾水溶解,分別用等體積飽和的正丁醇和乙酸乙酯反復萃取三次。將正丁醇萃取物和乙酸乙酯萃取物分別在60 ℃旋轉蒸發濃縮干燥。

1.2.2 萃取物總黃酮與總多酚含量測定

1.2.2.1 樣品中總黃酮含量的測定 采用AlCl3-乙酸鉀比色法[29]。配制濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL的蘆丁標準溶液。取2 mL待測液與0.2 mL 5%的亞硝酸鈉溶液混合,反應6 min之后加入0.2 mL 10%三氯化鋁溶液,充分混勻反應5 min之后加入0.6 mL 1 mol/L氫氧化鈉溶液,待反應液充分混勻,15 min后于波長510 nm處測定不同濃度梯度蘆丁標準液吸光度,繪制標準曲線。線性回歸方程為:y=11.151x-0.0104(R2=0.9993)。將萃取物配制成一定濃度待測液按上述步驟測量吸光度,重復測定三次,代入標準曲線計算總黃酮含量。

1.2.2.2 樣品中多酚含量的測定 采用Folin酚法[30]。配制濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的沒食子酸標準溶液。取0.5 mL標準溶液與0.4 mL福林酚試劑與7.5 mL水充分混勻,反應5 min之后加入10%碳酸鈉溶液1.6 mL,待反應液充分混勻后于室溫下避光反應2 h,于765 nm波長處測定其吸光度,繪制標準曲線。得到線性回歸方程為:y=1.333x+0.0223(R2=0.9991)。將萃取物配置成一定濃度待測液按上述步驟測量吸光度,重復測定三次,代入標準曲線計算總多酚含量。

1.2.3 菱角殼萃取物抑制腫瘤細胞生長的測定

第一步，教師對本節教學的重點和難點及學生在自主學習過程中存在的共性問題，通過講授、討論等方法進行有針對性教學。

1.2.3.1 細胞復蘇 將肝癌和胃癌細胞從-80 ℃冰箱中取出,放在溫度為37 ℃的水浴鍋內溫育,使細胞迅速解凍。將細胞轉移到無菌的細胞房中。將細胞置于離心機中,1500 r/min離心5～10 min。棄掉上清液,收集細胞沉淀。加入4 mL新鮮的DMEM完全培養基重懸細胞。將重懸后的細胞懸浮液轉移到無菌的細胞培養瓶中。將細胞放置在37 ℃、5.0% CO2培養箱中培養48 h。

1.2.3.2 細胞傳代 當細胞鋪滿培養瓶的80%～90%時就要進行細胞傳代。棄掉培養瓶中上層的培養基,加2 mL PBS潤洗細胞兩次。加入1 mL胰酶消化細胞1 min,按照1∶1的傳代比例,加入8 mL新鮮的DMEM完全培養基,重懸細胞。吸取4 mL細胞懸浮液,轉移到新的無菌的培養瓶中繼續培養,待細胞長至對數生長期時進行細胞活力測定。

1.2.3.3 細胞活力測定 收集1.2.3.2對數生長期的細胞,將重懸的細胞懸浮液轉移到96孔板中,每個孔種植100 μL,數量為1×104個細胞。將種植在96孔板里的細胞放置在細胞培養箱,37 ℃,5.0%濃度的CO2,培養24 h。加入100 μL不同濃度的萃取物處理細胞24、48 h。每孔加入10 μL CCK-8,繼續在細胞培養箱孵育細胞3 h。將96孔板放置在酶標儀中,選擇450 nm的波長檢測。增殖抑制率如下,并計算IC50值。

抑制率(%)=[(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100

式中:As:實驗孔(含有細胞的培養基、cck-8、待測物質)吸光度;Ac:對照孔(含有細胞的培養基、cck-8、沒有待測物質)吸光度;Ab:空白孔(不含細胞和待測物質的培養基、cck-8)吸光度。

1.2.4 菱角殼萃取物促腫瘤細胞凋亡的檢測 取上步對數生長期的細胞,調整細胞密度為1×105個/mL,將細胞懸液轉移至6孔細胞培養板中,每孔種植2 mL細胞懸液置于細胞培養箱中培養24 h;每孔分別加入2 mL濃度為25、50、100、200和400 μg/mL的菱角殼萃取物溶液,放在細胞培養箱內繼續培養24 h;分別收集細胞,每管樣品中加入500 μL 1×binding buffer,5 μL Annexin V-FITC 染料,5 μL PI染料,室溫避光孵育15 min;在激發光488 nm,F1通道發射光488～525 nm,F2通道發射光550 nm處,雙通道檢測細胞凋亡。

1.3 數據處理與分析

所有實驗重復3次,取平均值進行統計分析,數據以X±S的形式記錄。數據的統計學分析采用SPSS數據處理軟件進行配對樣本t檢驗。

2 結果與分析

2.1 菱角殼萃取物總黃酮與總多酚含量

由表1可以看出,菱角殼萃取物中黃酮和多酚主要富集在乙酸乙酯相中,乙酸乙酯萃取物黃酮和多酚含量分別為(335.10±0.004)、(723.10±0.022) mg/g。這與林秋生[25]研究報道的不同極性溶劑萃取后多酚和黃酮類物質主要富集到乙酸乙酯相的結果一致。

2.2 菱角殼萃取物對腫瘤細胞增殖的影響

2.2.1 菱角殼萃取物對人胃癌細胞SGC-7901增殖的影響 如表2所示,正丁醇萃取物在低濃度25～50 μg/mL時,SGC-7901細胞出現促增長的現象,萃取物在小劑量濃度下未達到抑制細胞增殖的作用,反而起到促進增殖的作用,隨著濃度的增大正丁醇萃取物呈現出較好的抑制細胞增殖效果。這與嚴興耘等[31]研究發現低濃度的槲皮素明顯促進結腸癌HT-29細胞增殖,高濃度的槲皮素明顯抑制細胞增殖這一現象相似。乙酸乙酯萃取物隨著濃度的增加,對胃癌細胞SGC-7901抑制率增加,處理時間越長,抑制率越高,呈現一定劑量效應和時間效應。乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物作用胃癌細胞48 h,最高抑制率均達到80%以上。

表2 菱角殼萃取物對胃癌細胞SGC-7901增殖抑制作用Table 2 Effects of water chestnut extract on proliferation of gastric cancer cell line SGC-7901

2.2.2 菱角殼萃取物對人胃癌SGC-7901細胞增殖的 IC50如表3,兩種萃取物作用胃癌細胞24 h,乙酸乙酯萃取物的IC50值為208.51 μg/mL,正丁醇萃取物的IC50值為177.68 μg/mL;作用時間為48 h,乙酸乙酯萃取物的IC50值56.83 μg/mL,正丁醇萃取物的IC50值為69.41 μg/mL。其原因可能是胃癌細胞對正丁醇萃取物中所含主要成分較敏感,在較短的時間內可以抑制細胞的增殖,而隨著作用時間的增加,乙酸乙酯萃取物的抑制效果較好,這可能與乙酸乙酯萃取物中黃銅和多酚的含量較高有關。

表3 菱角殼萃取物作用不同時間抑制胃癌SGC-7901細胞增殖的IC50(μg/mL)Table 3 IC50 of inhibition of gastric cancer SGC-7901 cell proliferation by water chestnut extract at different times(μg/mL)

2.2.3 菱角殼萃取物對人肝癌Hep G2細胞增殖的影響 由表4可以看出,兩種菱角殼萃取物作用肝癌細胞Hep G2,肝癌細胞活力受到明顯抑制,呈現一定劑量效應和時間效應。400 μg/mL的

表4 菱角殼萃取物對肝癌細胞Hep G2增殖抑制作用Table 4 Inhibition of hepatocellular carcinoma cell Hep G2 proliferation by water chestnut shell extract

乙酸乙酯、正丁醇萃取物處理肝癌細胞48 h,其抑制率均達到90%以上。同一濃度相同作用時間,乙酸乙酯萃取物對肝癌細胞的抑制率要高于正丁醇萃取物對肝癌細胞的抑制率。武蕊娟等[32]從藥用植物馬甲子葉醇提物中通過體外抗Hep G2細胞實驗發現乙酸乙酯萃取部位具有較好抗腫瘤活性。

2.2.4 菱角殼萃取物對肝癌Hep G2細胞增殖的IC50從表5可以看出,不同萃取物對肝癌細胞的作用效果不同,且隨著作用時間的增加,它們的IC50值逐漸減小。乙酸乙酯萃取物作用肝癌Hep G2細胞48 h后,IC50值為 64.07 μg/mL,R2=0.87;正丁醇萃取物作用肝癌Hep G2細胞 48 h 后,IC50值為106.70 μg/mL,R2=0.90。Hep G2細胞對乙酸乙酯萃取物耐受程度更低,在較低濃度處理時即可抑制半數細胞的增殖。

表5 菱角殼萃取物作用不同時間抑制肝癌Hep G2細胞增殖的IC50(μg/mL)Table 5 IC50 of inhibition of Hep G2 cells by water(μg/mL)at different times

2.3 菱角殼萃取物對腫瘤細胞凋亡的影響

2.3.1 菱角殼萃取物對人胃癌SGC-7901細胞凋亡的影響 如圖1和圖2所示,菱角殼萃取物處理24 h,在25、50 μg/mL濃度時,胃癌細胞SGC-7901沒有發生明顯凋亡,隨著萃取物濃度的增加,胃癌細胞凋亡率呈上升趨勢。400 μg/mL的乙酸乙酯萃取物誘導24 h,31.01%的胃癌SGC-7901細胞發生明顯凋亡,9.24%為早期凋亡,21.77%為晚期凋亡。400 μg/mL的正丁醇萃取物誘導24 h,有21.65%的胃癌SGC-7901細胞發生明顯凋亡,7.47%為早期凋亡,14.18%為晚期凋亡。牛鳳蘭等[33]研究發現菱角殼提取物可以抑制胃癌細胞的增殖。通過不同萃取物作用胃癌細胞發現低濃度的萃取物對胃癌細胞凋亡作用不明顯,高濃度的萃取物可以促進胃癌細胞的凋亡,同一濃度相同作用時間,乙酸乙酯萃取物比正丁醇萃取物更能促進胃癌SGC-7901細胞發生凋亡。

圖1 正丁醇萃取物促進胃癌SGC-7901細胞的凋亡Fig.1 n-butanol extract promotes apoptosis of gastric cancer SGC-7901 cells

圖2 乙酸乙酯萃取物促進胃癌SGC-7901細胞的凋亡Fig.2 Ethyl acetate extract promotes apoptosis of gastric cancer SGC-7901 cells

2.3.2 菱角殼萃取物對人肝癌Hep G2細胞凋亡的影響 如圖3和圖4所示在25～200 μg/mL的濃度范圍內兩種萃取物對肝癌細胞的凋亡無明顯的促進作用。400 μg/mL的正丁醇萃取物誘導24 h,33.34%的肝癌Hep G2細胞發生明顯凋亡,其中19.96%為早期凋亡,13.38%為晚期凋亡。400 μg/mL的乙酸乙酯萃取物誘導24 h,45.57%的肝癌Hep G2細胞發生明顯凋亡,20.85%為早期凋亡,24.72%為晚期凋亡。低濃度的萃取物對肝癌細胞凋亡作用不明顯,同一濃度相同作用時間,乙酸乙酯萃取物促肝癌Hep G2細胞凋亡的效果較好。謝艷茹等[34]研究發現菱角提取物能誘導肝癌SMMC-7721 細胞凋亡,但關于菱角殼萃取物對肝癌細胞凋亡的研究尚未見其他報道。

圖3 正丁醇萃取物促進肝癌Hep G2細胞的凋亡Fig.3 n-butanol extract promotes apoptosis in hepatoma Hep G2 cells

圖4 乙酸乙酯萃取物促進肝癌Hep G2細胞的凋亡Fig.4 Ethyl acetate extract promotes apoptosis in Hep G2 cells

3 結論

本實驗通過萃取得到菱角殼乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物,測得菱角殼乙酸乙酯萃取物中黃酮和多酚的含量分別為(335.10±0.004)、(723.10±0.022) mg/g。采用CCK-8法檢測兩種菱角殼萃取物對SGC-7901、Hep G2細胞增殖的影響,結果表明菱角殼乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物均能抑制腫瘤細胞的增殖,呈濃度和劑量依賴性。乙酸乙酯萃取物對胃癌細胞的抑制效果最好,其IC50值最小。流式細胞術檢測不同濃度的菱角殼萃取物對細胞凋亡率的影響。乙酸乙酯、正丁醇萃取物濃度為400 μg/mL時,肝癌細胞凋亡率分別為45.57%、33.34%;胃癌細胞凋亡率分別為31.01%、21.65%。菱角殼乙酸乙酯萃取物促肝癌細胞凋亡效果較明顯。

綜上所述,菱角殼萃取物可以有效抑制肝癌和胃癌細胞增殖,乙酸乙酯萃取物促肝癌Hep G2細胞凋亡效果較好。為菱角殼的深加工及菱角殼萃取物抗癌作用機理的研究提供了一定的理論基礎。