紅棗色素與棗多糖的協同抗氧化作用

李 帆,邢珂慧,邵佩蘭,魯倩茹,黃鳳玲

(寧夏大學農學院,寧夏銀川 750021)

天然植物活性成分復雜,其強抗氧化活性與各組分之間的相互作用密切相關。研究表明,兩種或多種抗氧化劑混合后具有比單一抗氧化劑更強的抗氧化活性[8],因此研究天然抗氧化劑間的協同抗氧化作用逐漸成為國內外研究熱點[9]。如樊梓鸞等[10]研究發現,黑木耳多糖與漿果多酚復配可提高清除·OH、ABTS+·和DPPH·能力和還原力;艾志錄等[11]研究表明,棗多糖與棗黃酮復配在清除·OH、DPPH·、ABTS+·和總抗氧化能力呈現抗氧化正協同效應。Marinova E等[12]研究顯示,VE和楊梅酮存在協同抗氧化作用。目前對紅棗色素、棗多糖的生理活性已進行了較深入的研究,但對于紅棗色素與棗多糖的相互作用研究鮮見報道。本文通過研究紅棗色素、棗多糖及復配后的協同抗氧化活性,以期為開發紅棗抗氧化性功能產品、復合天然抗氧化劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

棗多糖(含糖量60%) 山西玉寧生物科技有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 美國Sigma公司;2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷、鐵氰化鉀、鉬酸銨、鹽酸萘乙二胺、對氨基苯磺酸 均為國產分析純。

UV-2802紫外可見分光光度計 日本UNIC公司;5417R臺式離心機 德國Eppendorf公司;RE-52AA型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠;FD-4中型冷凍干燥器 北京博醫康實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 紅棗色素及復配液的制備 紅棗色素的制備:以棗皮為原料,采用0.4 mol/L NaOH溶液以料液比1∶20 (g/mL)于75 ℃提取1 h,經過濾、離心、濃縮、冷凍干燥、LX-60大孔樹脂純化,得到紅棗色素，其色價為23.01[5]。

稱取等質量的紅棗色素與棗多糖配制成不同濃度的復配液。

1.2.2 復配液抗氧化活性的測定

1.2.2.1 DPPH·清除能力的測定 分別取0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mg/mL紅棗色素、棗多糖、復配液(紅棗色素與棗多糖質量比1∶1)4.0 mL,加入0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液2.0 mL,搖勻,25 ℃水浴20 min,于517 nm處測定吸光度A1;取體積分數95%乙醇溶液代替DPPH乙醇溶液測定吸光度A2;取蒸餾水代替樣品溶液做空白對照測定吸光度A3,計算清除率[13]。

DPPH·清除率(%)=[(A3-A1+A2)/A3]×100

1.2.2.2 ABTS+·清除能力的測定 取7 mmol/L ABTS溶液5.0 mL,加140 mmol/L過硫酸鉀88 μL,室溫下暗處反應12～16 h,形成ABTS+自由基儲備液。在734 nm處,用體積分數70%乙醇稀釋ABTS+·儲備液至吸光度為(0.70±0.02),備用。分別取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL紅棗色素、棗多糖、復配液0.1 mL,加ABTS+溶液3.9 mL,混勻,室溫下反應6 min,于734 nm處測定吸光度A1。吸取70%乙醇溶液0.1 mL代替樣品液,測定吸光度A2,計算清除率[14]。

ABTS+·清除率(%)=[(A2-A1)/A2]×100

1.2.2.3 ·OH清除能力的測定 分別取0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mg/mL紅棗色素、棗多糖、復配液1.0 mL,加入9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液0.5 mL、9 mmol/L硫酸亞鐵溶液0.5 mL和8 mmol/L過氧化氫溶液5.0 mL,搖勻,于510 nm處測定吸光度A1;取0.5 mL蒸餾水代替硫酸亞鐵溶液測定吸光度A2;取蒸餾水代替樣品溶液做空白對照測定吸光度A3,計算清除率[15]。

·OH清除率(%)=[(A3-A1+A2)/A3]×100

1.2.2.5 還原力的測定 分別取0.6、1.2、1.8、2.4、3.0 mg/mL紅棗色素、棗多糖、復配液1.0 mL,加入0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH6.6)和1%鐵氰化鉀溶液各1.0 mL,混勻,50 ℃水浴20 min,加入10%三氯乙酸溶液1.0 mL,混勻,靜置10 min,加蒸餾水2.0 mL和0.1%三氯化鐵溶液1.0 mL,混勻,靜置20 min,于700 nm處測定待測液的吸光度[17]。

1.2.3 等輻射分析法研究紅棗色素與棗多糖的相互作用 選擇紅棗色素和棗多糖以質量比1∶1復配測定抗氧化活性,計算清除率及半數清除濃度IC50mix。將棗多糖、紅棗色素的IC50及其95%可信限分別標繪在X、Y軸上,將IC50值相連為相加線,可信限分別相連后作出相加線95%可信限。如果藥物合用后濃度落在相加線上或95%可信限內,表示兩藥作用為相加;如落在相加線效應線的可信限左側,則為協同;落在右側,則為拮抗[18]。

1.2.4 統計學分析 對藥物之間相互作用進行統計學分析[19-21]。計算IC50add。

IC50add=IC50A/(PA+RPB)

式中：IC50add為兩種物質復配后理論半數清除濃度;R為 A、B兩種抗氧化劑單獨使用時的效價比,即R=IC50A/IC50B;IC50A、IC50B分別為A、B兩種抗氧化劑單獨作用時的IC50值;PA、PB分別為抗氧化劑A、B在復配組中所占的比例。兩種物質復配后,實驗測得半數清除濃度為IC50mix,采用t檢驗比較IC50add和IC50mix,若IC50mixIC50add,表明具有拮抗作用。

計算相互作用指數(γ)、協同率,評價協同或拮抗作用的程度。

γ=IC50Amix/IC50A+IC50Bmix/IC50B

協同率(%)=(IC50add-IC50mix)/IC50add×100

若γ<1,表示相互作用為協同作用,γ值越小說明協同作用越強;若γ>1,表示相互作用為拮抗作用;若γ=1表示相互作用為相加[22]。

1.3 數據分析

采用SPSS 20.0和Origin 8.0軟件分析試驗數據。測定結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 紅棗色素與棗多糖復配清除DPPH·的能力

DPPH是一種穩定的氮中心的自由基,可與抗氧化劑反應檢測其抗氧化能力[23]。隨試驗濃度的增加,紅棗色素、棗多糖、復配液清除DPPH·能力均呈一定濃度依賴性(圖1),紅棗色素與棗多糖復配液超過0.6 mg/mL時,清除DPPH·能力優于紅棗色素、棗多糖單獨使用,在1.5 mg/mL時,復配的清除率(64.29%±3.99%)明顯高于紅棗色素(41.64%±2.31%)、棗多糖(55.12%±4.30%)單獨使用,且存在顯著差異(p<0.05)。紅棗色素與棗多糖協同清除DPPH·能力等輻射分析顯示,紅棗色素與棗多糖復配清除DPPH·的IC50落在相加線及95%可信限的左側(圖2),IC50mix值為(0.79±0.02) mg/mL,明顯小于IC50add值(1.70±0.11) mg/mL(p<0.05),γ=0.463<1,協同率為53.53%±2.14%,表明紅棗色素與棗多糖在清除DPPH·存在較強的協同作用。黃酮類化合物中有大量活性酚羥基，可與自由基反應形成穩定的半醌式自由基結構[24];棗多糖分子上帶有還原性半縮醛羥基,能與氧化劑發生氧化還原反應,起抗氧化作用[25]?？寡趸镔|間的協同抗氧化作用與抗氧化物質本身的抗氧化能力、有效濃度等有關。紅棗色素、棗多糖自身具有較強的抗氧化能力,復配后各活性成分含量增加,有效地提高了整個體系的抗氧化能力[26-27]。

圖1 紅棗色素與棗多糖清除DPPH·的能力Fig.1 DPPH free radical scavenging capacity of pigments and polysaccharides from jujube

圖2 紅棗色素與棗多糖復配清除DPPH·能力的等輻射分析圖Fig.2 Isobolographic plot of jujube pigments combined with jujube polysaccharides on scavenging DPPH free radicals ability注:“?”代表實驗 IC50mix 值,下同。

2.2 紅棗色素與棗多糖復配清除ABTS+·的能力

ABTS+·廣泛用于測定生物樣品的總抗氧化能力[28]。紅棗色素、棗多糖在0.4～2.0 mg/mL范圍內有較強的清除ABTS+·能力(圖3)。質量濃度為0.8 mg/mL時,復配液清除能力(38.80%±6.58%)強于同濃度下紅棗色素(36.60%±4.04%)、棗多糖(29.66%±0.88%)單獨使用。且在質量濃度1.2 mg/mL后,復配液與紅棗色素、棗多糖清除ABTS+·能力存在顯著差異(p<0.05)。紅棗色素與棗多糖協同清除ABTS+·能力等輻射分析(圖4)顯示,復配后的IC50落在相加線及95%可信限的左側,IC50mix值(1.12±0.05) mg/mL小于IC50add值(2.92±0.5) mg/mL(p<0.05),γ=0.383<1,協同率為61.64%±2.26%,表明紅棗色素與棗多糖復配后能有效協同清除ABTS+·。多酚類物質能減弱氧化酶的活性,間接清除自由基[29];多糖通過提高抗氧化酶活性起到抗氧化的作用[30]。紅棗色素與棗多糖復配使用的抗氧化活性強于單獨使用,推測原因可能是兩種抗氧化劑混合使用降低反應中的氧含量,抑制了酶的活性,避免了酚類物質等活性物質的降解,增強了其抗氧化性[10]。

圖3 紅棗色素與棗多糖清除ABTS+·的能力Fig.3 ABTS+ free radical scavenging capacity of pigments and polysaccharides from jujube

圖4 紅棗色素與棗多糖復配清除ABTS+·能力的等輻射分析圖Fig.4 Isobolographic plot of jujube pigments combined with jujube polysaccharides on scavenging ABTS+ free radicals ability

2.3 紅棗色素與棗多糖復配清除·OH的能力

·OH化學性質活潑,毒性大,可使細胞突變或壞死,造成機體氧化損傷[31]。清除·OH能力隨紅棗色素棗多糖濃度增加而增強(圖5),紅棗色素與棗多糖復配后(0.6～1.5 mg/mL)清除能力高于同質量濃度下紅棗色素、棗多糖單獨使用;在1.2 mg/mL后,紅棗色素與棗多糖復配的清除率(47.49%±1.41%)顯著高于紅棗色素(39.88%±4.06%)、棗多糖(35.81%±1.91%)單獨使用(p<0.05)。等輻射分析顯示(圖6),紅棗色素與棗多糖復配清除·OH的IC50落在相加線及95%可信限的左側,IC50mix值(1.62±0.03) mg/mL小于IC50add值(11.35±1.35) mg/mL(p<0.05),γ=0.143<1,協同率為85.73%±3.69%,表明紅棗色素與棗多糖復配存在協同抗氧化作用。Fe2+/H2O2體系通過Fenton反應(Fe2++H2O2·Fe3+++OH-)產生·OH[32]。多酚類物質和多糖均具有羥基結構,其通過與誘導氧化的Fe2+絡合,阻止金屬離子產生羥自由基,間接清除自由基[29]。兩種抗氧化劑復配使用,偶聯作用降低了紅棗色素與棗多糖間的電位落差,抗氧化劑油水分配系數互為補充,每種抗氧化劑充分發揮抗氧化活性,產生了更強的抗氧化性[30]。

圖5 紅棗色素與棗多糖清除·OH的能力Fig.5 Hydroxyl free radical scavenging capacity of pigments and polysaccharides from jujube

圖6 紅棗色素與棗多糖復配清除·OH能力的等輻射分析圖Fig.6 Isobolographic plot of jujube pigments combined with jujube polysaccharides on scavenging hydroxyl radicals ability

2.4 紅棗色素與棗多糖復配清除的能力

圖7 紅棗色素與棗多糖清除的能力Fig.7 Superoxide anion free radical scavenging capacity of pigments and polysaccharides from jujube

圖8 紅棗色素與棗多糖復配清除能力的等輻射分析圖Fig.8 Isobolographic plot of jujube pigment combined with jujube polysaccharides on scavenging superoxide anion free radicals ability

2.5 紅棗色素與棗多糖復配的還原力

還原力是抗氧化物質通過自身還原作用,給出電子清除自由基,還原力越強,抗氧化活性越強[35]。在0.6～1.8 mg/mL范圍內,隨濃度增加,紅棗色素、棗多糖還原力遞增(圖9),紅棗色素與棗多糖復配后還原力優于紅棗色素、棗多糖單獨使用,且質量濃度達到3.0 mg/mL時,復配液的還原力(1.00±0.02)是棗多糖(0.22±0.04)的5倍,顯著高于紅棗色素、棗多糖單獨使用(p<0.05)。等輻射分析(圖10)顯示,紅棗色素與棗多糖協同還原力的IC50落在相加線及95%可信限的左側,IC50mix值(1.24±0.04) mg/mL小于IC50add值(9.57±1.77) mg/mL(p<0.05),γ=0.130<1,協同率為87.04%±4.31%,說明紅棗色素與棗多糖復配有較強的協同效果。

圖9 紅棗色素與棗多糖的還原力Fig.9 The reducing power of pigments and polysaccharides from jujube

圖10 紅棗色素與棗多糖復配還原力的等輻射分析圖Fig.10 Isobolographic plot of jujube pigments combined with jujube polysaccharides on reducing power

3 結論