納米微晶纖維素棕櫚油的Pickering乳化液的制備及體外消化行為

周敬陽,李術芝,蘇 倩,郭 楊,段松梅,趙凱旋,馬云昊,王穩航

(天津科技大學新農村發展研究院,天津科技大學食品工程與生物技術學院,天津 300457)

Pickering乳化是指由納米或微米級固體顆粒吸附于油/水界面,形成物理屏障阻止液滴聚結而穩定液滴[1],在食品領域備受關注,主要集中于在乳制品、冰淇淋等方面的應用[2]。一般認為,某一維尺寸小于100 nm的纖維素統稱為納米纖維素,其依靠其分子內和分子間氫鍵及范德華力維持自組裝的原纖維形態和超分子結構[3]。納米纖維素根據其來源、制備方法以及形態尺寸等,一般可分為納米微晶纖維素(NCC)、納米微纖維素(NCF),以及細菌纖維素,其中以納米微晶纖維素研究較為成熟。NCC一般由酸水解的方法制得,該類型的納米纖維素結晶度高,結晶體完整度好[4]。其與天然纖維素以及微晶纖維素相比,具有許多優良性能,具有比表面積大、親水性優、生物可降解性好[5]、可持續再生性強和化學性質穩定性強等優勢[6]。同時,由于其表面含有大量羥基,具有較強的表面化學反應特性,能夠形成同時具有親水基和親油基的表面活性劑[7]。其中,納米纖維素作為一種性質優良的生物納米粒子,在Pickering乳化中具有優越的理化特性、生物相容性、成本低等特點,目前在包裝材料、功能食品等領域已經引起廣泛關注[8]。

目前,普通的乳化劑制備出來的乳化液,由于自身的熱力學不平衡特性,存在穩定性差的缺點,尤其是隨著時間增長,乳化液存在穩定性顯著降低等問題[9-10]。NCC作為一種良好的Pickering乳化劑,在界面可形成一層不可逆的吸附層,在乳化液方面具有特殊的穩定性。Zoppe等[11]利用以苧麻纖維為原料制備的NCC,形成了在四個月的觀察期內具有強穩定性的Pickering乳液。Wen等[12]研究了NCC-D-檸檬烯的Pickering乳化液的制備,并證明了乳化液的高穩定性。Sèbe等[13]使用乙酸乙酯對NCC進行改性,獲得了良好的O/W 型Pickering乳液。棕櫚油具有價格低、產量高、強抗氧化性以及耐高溫耐煎炸等優點,可有效延長油脂食品的貨架期[14]。以棕櫚油為乳化對象,NCC為乳化穩定劑的Pickering乳液有望能夠在食品中得到應用。目前國內外對乳化液的體外消化主要集中在常規乳化液方面。有研究表明,胡蘿卜素-玉米油乳化液在經過口腔、胃、小腸時,乳化液液滴不斷增大,脂肪消化的速率也隨著乳化液原始尺寸的減小而增加[15]。Pickering乳化作為一種新型的乳化技術,其乳化原理與傳統表面活性劑乳化完全不同,預期NCC穩定的Pickering乳液對脂肪的腸道消化會有重要影響,而這一情況目前未知。

本實驗利用NCC制備Pickering乳液,并研究酸解時間對理化性質的影響,以獲得 Pickering乳化影響的內因,通過改變外界條件、體外模擬脂肪消化實驗研究NCC乳化穩定性,以期在食品工業中獲得應用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

微晶纖維素 食品級,天津諾奧科技發展有限公司;棕櫚油(熔點5 ℃) 天津聚龍糧油有限公司;豬膽鹽 生化試劑,天津市西瑪試劑公司;胰脂肪酶 生化試劑,美國Sigma公司;羅丹明B 分析純，天津市西瑪試劑公司;油酸 生化試劑,美國Bio-Rad實驗室;氫氧化鈉 分析純,天津市江天化工技術有限公司;番紅 優級純,美國Sigma公司;Nile red 優級純,美國Sigma公司;其余試劑均為國產分析純。

TG328A型分析天平 上海天平儀器廠;DL22型自動滴定儀 Mettler Toledo,U.S.;SB25-120型超聲波清洗器 寧波新芝生物科技股份有限公司;SZ-97型自動三重純水蒸餾器 上海亞榮生化儀器廠;TCS SP2型激光共聚焦顯微鏡 日本尼康公司;ZHWY-100C型新型迷你型恒溫培養振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司;JY92-ⅡDN型超聲波細胞破碎儀 寧波新藝超聲設備有限公司;BT-9300S激光粒度分布儀 丹東市百特儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.2 酸解時間對納米微晶纖維素-Pickering乳化液穩定性的影響

1.2.2.1 納米微晶纖維素-Pickering乳化液的制備 取上述不同酸解時間制得含量為1%的NCC水溶膠的五組樣品分別與棕櫚油以7∶3的體積比混合,利用超聲波細胞破碎儀進行超聲乳化。工作參數為:超聲3 s,間隙3 s,功率為450 W,總時間3 min。然后使用離心機在3000×g下,離心5 min。

1.2.2.2 乳化液的分層觀察 對離心后的NCC乳化液的分層情況進行觀察,并根據刻度值比較,直觀反映乳化液的穩定性。

1.2.2.3 納米微晶纖維素相對含量的測定 對水層進行納米微晶纖維素相對含量測定,因為NCC為不溶性多糖,無法直接進行硫酸-苯酚實驗。因此先將水層進行酸解,具體操作過程:將超純水與乳化液亞層混勻后,以1∶4的體積比加入濃硫酸,室溫下酸解1 h,然后按照硫酸-苯酚法進行滴定[17]。

1.2.2.4 乳化液粒徑檢測 利用激光粒度分布儀對離心后的乳化層進行測定,用移液槍取少量乳化層液滴,超聲分散后(工作參數為:超聲3 s,間隙3 s,功率為450 W,總時間3 min)加入微樣品池中,測定粒徑和多分散系數。自動測試三次,保存結果。

1.2.2.5 顯微結構觀察 利用共聚焦顯微鏡(CLSM),在明場模式下對乳化層液滴進行顯微觀察,制樣過程盡量減少氣泡生成。

1.2.2.6 熒光染色觀察 利用共聚焦顯微鏡,在暗場模式下觀察。具體操作過程:選用Nile red(標記棕櫚油)、番紅(標記NCC)作為熒光染色劑。染色劑溶液的配制:稱量0.001 g Nile red溶解于10 mL 1,2-丙二醇中;稱量0.01 g番紅在10 mL 超純水中。測定乳化液時,取剛離心完的乳化液層進行雙染,染色液與乳化液之間的比例為1∶10,振蕩搖勻,放置1 h后,在100倍的油鏡下觀察。樣品分別在405、543 nm的發射波長下進行掃描,用1024×1024的像素記錄圖像,以上操作都是在室溫避光條件下進行。

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1.2.3 NCC-Pickering乳化液的體外消化行為

1.2.3.1 樣品制備 NCC乳化液的制備:用移液管分別移取的0、0.5%和1%的NCC 7 mL加入到50 mL的圓底離心管中,再用移液管添加3 mL棕櫚油,在28 ℃的條件下,使用超聲波細胞破碎儀,超聲3 s,間隙3 s,總時間3 min,功率450 W進行微乳化。

模擬胃液的制備:將2 g NaCl和7 mL HCl(37%)稀釋至1000 mL,用1.0 mol/L鹽酸將pH調成1.2。

模擬腸液的制備:6.8 g 39 mmol/L磷酸氫二鉀稀釋至1000 mL,加入8.775 g 150 mmol/L NaCl和4.41 g 30 mmol/L CaCl2,加入豬膽鹽,pH維持在7.5,再加入胰脂肪酶。

1.2.3.2 模擬消化過程 模擬胃-腸消化實驗:乳化液與模擬胃液以1∶1進行混合,混合物pH維持在1.6以下,搖床搖液(設定條件37 ℃、95 r/min、1 h)。之后,將混合液pH調成7.5,并將混合液與模擬腸液以1∶1進行混合,搖床搖液(設定條件37 ℃、80 r/min、2 h)。實驗結束后對游離脂肪酸的釋放量進行滴定。

模擬腸消化實驗:用超純水將乳化液稀釋一倍,將pH調成7.5,并與模擬腸液以1∶1進行混合,搖床搖液(設定條件37 ℃、80 r/min、2 h)。實驗結束后對游離脂肪酸的釋放量進行滴定。

不同時間的模擬腸消化實驗:實驗方法與模擬腸液相同,時間設定為0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 h。

1.2.3.3 指標的測定 游離脂肪酸的測定:選用pH自動滴定儀,用0.05 mol/L的NaOH滴定,滴定終點設為7.5,記錄消耗NaOH的體積。

游離脂肪酸釋放量(μmol/L)=[c×(V1-V0)×103]/V

式(1)

式中:c為NaOH溶液的濃度(0.05 mol/L);V1、V0分別為測定時和0 min時消耗的NaOH溶液體積/mL;V為棕櫚油的體積V。

1.3 統計分析

2 結果與討論

2.1 不同酸解時間下制備的NCC的Pickering乳化性

2.1.1 乳化液的乳化效果 乳化液經過離心分層之后可以直觀地觀察到,乳化液呈典型的Pickering乳化特點,即為油層(上層)、乳化層(中層)和水層(下層)。NCC的酸解時間為1.5～3.0 h時,隨著酸解時間的增長,乳化層逐漸增加,油層高度逐漸減小,即乳化效果逐漸增強,然而酸解時間3.0～3.5 h時,乳化效果明顯變差。

圖1 不同酸解時間的NCC乳化液離心分層情況Fig.1 The centrifuged emulsions stabilized by NCCs prepared with different acid hydrolysis time

水層中含有一定量的NCC,通過測定其相對含量,可推算出乳化層中NCC的相對含量,乳化層中NCC相對含量越高,其乳化效果就越好。通過硫酸-苯酚法進行了測定[17],酸解時間為1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h的NCC制備的乳化液樣品,其水層吸光度值如圖2所示。由圖2可知,隨著酸解時間從1.5 h增長到3.0 h,水層中NCC的含量逐漸減少,即乳化層中NCC的含量逐漸增多,而酸解時間為3.0～3.5 h時的NCC形成的乳化液水層卻出現了吸光度值上升的現象,即乳化層中NCC含量下降。這與由直觀觀察得出來的結果相吻合,更進一步地說明,在酸解時間為3.0 h時的NCC能夠形成乳化效果最好的乳化液。

圖2 不同酸解時間下制備的NCC-棕櫚油乳化液水層的吸光度Fig.2 Absorbance of aqueous layers of palm oil emulsions stabilized by NCC with different acid hydrolysis time

2.1.2 乳化液的粒徑分析 本實驗對乳化層中的液滴分別進行了粒度儀和顯微鏡觀察測定,粒度儀測定結果如圖3和表1所示。結果表明,5個樣品的乳化液滴尺寸主要集中分布于1～10 μm左右。從圖3中和表1中可知,酸解時間為2.0、2.5、3.0 h的NCC形成的乳化液粒徑更均勻且粒徑更小,酸解時間1.5、3.5 h的NCC形成的乳化液的粒徑在10 μm以上較多。在顯微鏡下觀察結果如圖4所示,(a)～(e)分別代表酸解時間為1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h的NCC所形成的乳化液,可以看出乳化液滴同樣的尺寸在10 μm以下居多,在10 μm以上較少。對于乳化液來說,穩定粒子的尺寸大小比乳滴的粒徑要小很多,才能得到穩定乳液,而且穩定粒子尺寸越小,乳滴的粒徑也越小,穩定性越強,這說明酸解時間為2.0、2.5、3.0 h的NCC所形成的乳化液在粒徑方面明顯優于酸解時間為1.5、3.5 h的NCC所形成的乳化液。

圖3 不同酸解時間下制備的NCC-棕櫚油乳化層液滴尺寸分布Fig.3 Droplet size distribution of palm oil emulsion layer stabilized by NCC with different acid hydrolysis time

圖4 不同酸水解時間下制備的NCC-棕櫚油乳化層液滴的顯微照片Fig.4 Microscopic photographs of palm oil droplets in emulsion layer stabilized by NCC with different acid hydrolysis time

在酸解時間為1.5～3.0 h的NCC,隨著酸解時間的增長,制備出的NCC的乳化效果逐漸增強,即NCC的Pickering乳化性能逐漸增強,但是繼續酸解,酸解時間為3.5 h的NCC的乳化效果突然減弱。結合NCC的表征性質及Pickering乳化特點進行分析:不同酸解時間制備的NCC在Pickering乳化效果上表現出來的差異,主要是由于尺寸效應、電荷效應、晶格完整性等綜合內在因素的影響。Chang等[18]研究指出,隨著酸解時間的增長,纖維素的粒徑會顯著降低。Beck-Candanedo S等[19]研究指出,酸解時間增長會縮短納米纖維素晶體。明悅等[20]研究指出,酸解時間為2～3 h時,NCC晶格完整,酸解時間4～5 h時,NCC晶格被破壞。Aldulaimi等[21]研究指出,隨著酸解時間的增長,NCC的含量逐漸增多,但達到一定時間后,NCC會有一部分被酸解為葡萄糖。以上的研究都說明,硫酸水解微晶纖維素會使其粒徑減小到納米級別、表面電荷增多、穩定性增強、Pickering乳化性能增強,但是過度的酸水解會使其晶格退化,引入過多的磺基基團導致熱穩定性變差,從而破壞NCC所形成的空間網絡結構。綜上所述,該研究確定在利用硫酸水解NCC時,酸解時間確定為3.0 h。

2.1.3 乳化液的微觀構象 為了進一步確定NCC與棕櫚油在乳化液中的分布情況及形成機理,本實驗選取酸解時間3.0 h的NCC制備的乳化液的乳化層,用共聚焦顯微鏡進行觀察,并用Nile red和番紅進行雙染,結果如圖5所示。由圖5可知,紅色區域為棕櫚油,藍色區域為NCC,紅色區域被藍色區域緊密包裹,說明NCC將油包裹完全。短納米晶體會形成一個密集的組織,長的納米晶體會形成一個相互聯系的網絡結構,將油滴緊密包裹起來,并阻止油滴聚集形成穩定的乳化液。

圖5 雙染NCC-棕櫚油乳化液的共聚焦顯微鏡掃描圖像Fig.5 Confocal laser scanning micrograph of oil droplets stabilized by NCC

2.2 兩種模擬脂肪消化過程的比較

選取含量分別為0、0.5%、1.0%的酸解時間3.0 h的NCC形成的乳化液經過兩種方式:模擬胃-腸消化(2 h/2 h)和單純的模擬腸道消化(2 h)。由圖6可以看出,經過模擬胃液消化過程后,整體的乳化油滴釋放的游離脂肪酸量有所降低,消化速率減慢;同時,在兩種不同的消化過程中,都是隨著乳化液中NCC含量的升高,消化速率有所增高。

圖6 兩種消化模式下NCC-棕櫚油乳化液的消化動力學Fig.6 Digestion kinetics of NCC-palm oil emulsion in two digestive modes

Carrillo等[22]研究指出,隨著納米纖維素的逐漸增多,乳化液的粘度會逐漸增高、液滴會逐漸小,與此同時,乳化液的穩定性也得到了很大的提升。由此推斷出:NCC乳化液的穩定性越好,其消化速率越快。另外,經過胃消化后,脂肪的分解速率整體下降,這應該是乳化液在含有胃蛋白酶的模擬胃液中消化以后,再進入含有胰蛋白酶的模擬腸液后,會加速凝結而造成的結果。Ngai等[23]的研究表明,在模擬胃消化過程中,加入較低pH的模擬胃液,隨著pH的逐漸變小,乳化液的液滴逐漸變大,乳化液也變得越來越不穩定,使部分的油包水結構造成一定程度的破壞。Dupin等[24]的研究也表明,在低的pH下,乳化液會有一定程度的溶脹,造成乳化液穩定性的下降。Binks等[25]在研究納米復合凝膠的水包油型乳化液進行時發現,隨著pH的不斷降低,乳化液會不斷的發生溶脹現象,低于一定值時,會變得非常不穩定。由此推斷,乳化液經過模擬胃液再經過模擬腸液后,消化速率降低的主要原因很有可能是pH的降低造成了乳化液穩定性的降低,在pH較低的胃液中經過一定時間的消化之后,造成乳化液滴更加不穩定,與未經模擬胃液消化的乳化液相比穩定性下降,結構被破壞,從而引起整體消化速率的降低。

2.3 模擬腸消化模型實驗

為了進一步研究NCC-棕櫚油乳化液的體外消化過程,詳細分析了不同時間內NCC乳化液的腸液消化實驗。實驗結果如圖7所示,NCC含量分別為0、0.5%、1%的乳化液經過模擬腸道消化特定時間后游離脂肪酸的釋放量。

從時間來看,隨著消化的進行,游離脂肪酸的釋放速率逐漸減慢。分析可能原因為:游離脂肪酸的增加,使得pH降低,產生的游離脂肪酸增多,并吸附在油水界面,阻止了脂肪酶與界面的接觸,甘油酸酯的水解作用也會受到抑制[26];隨著消化過程的進行,發生溶脹現象甚至出現破乳的情況;隨著反應時間的增加,乳化液液滴逐漸變大[27],從而引起相對表面積的逐漸變小,反應速率不斷降低;隨著反應不斷進行,底物的濃度越來越低,與酶的接觸面積越來越小,導致反應速率不斷降低。Sarkar等[28]的研究指出,乳化液進入小腸腔后,由于膽汁和胰汁的聯合作用，對乳化液的物理化學形式造成了顯著的影響。多糖可以吸附到乳化液液滴的表面以形成多層結構,并且通過靜電相互作用,增加界面層的厚度[29],從而防止脂肪酶/輔助脂肪酶吸附到液滴表面[30]。

從NCC不同含量來看,可以清晰地看到每組都呈現出相同的規律,隨著NCC含量的增加,脂肪的消化速率加快,進一步驗證了一定時間內隨著NCC含量的增加,乳化液穩定性越好,脂肪的消化速率越好。由圖7可知,1%的NCC形成的乳化液在腸液消化2 h時的游離脂肪酸釋放量為830 μmol/L,同樣條件下,棕櫚油對照組的游離脂肪酸釋放量為480 μmol/L。NCC含量越高,游離脂肪酸釋放量越高,表明NCC乳化有助于脂肪的消化。隨著時間的增加,乳化液的穩定性不斷降低,從而引起了消化速率的不斷降低。有研究表明[31],不同的納米纖維素對脂肪消化的干擾作用不同,其中某些納米纖維素如納米微纖纖維素(CNF)可以作為一種潛在的食品添加劑或補充劑,用于降低脂肪的消化，以助于體重調節和肥胖控制。應該說，納米纖維素的形態、尺寸以及與食品基質的相互作用導致了納米纖維素的脂肪消化干預行為,但相關機制仍需進一步研究。

圖7 NCC-棕櫚油乳化液在模擬腸液中的消化動力學Fig.7 Digestion kinetics of NCC-palm oil emulsion in mimic intestinal juice situation

3 結論

結果表明,不同酸解時間的NCC能夠制備出良好的水包油型Pickering乳液,酸解時間為3.0 h時,制備出的納米微晶纖維素乳化效果最好。在體外消化行為的研究中:隨著NCC含量的不斷增加,乳化液穩定性逐漸增強,自由脂肪酸的釋放量越高。胃腸消化時,進入腸液后,乳化液的穩定性下降,從而引起消化速率的下降。單獨的腸液消化下,NCC含量升高,乳化液消化加快,同時隨著消化的進行,乳化液的穩定性逐漸降低,表明納米微晶纖維素是一種良好的Picking乳化的穩定劑,乳化液在胃腸消化中穩定性降低。本文對Pickering乳液的胃腸道體外消化性進行了初步的探究,但對胃腸道的體內實驗沒有涉及,下一步還需對利用動物實驗來研究Pickering乳液的消化特性以及對胃腸系統性能的具體影響,以更好地拓展Pickering乳化液在功能食品領域的應用。