發(fā)酵牛肉調(diào)味基料替代亞硝酸鹽在紅腸中的應(yīng)用

樊曉盼,劉靜靜,李春萌,梁麗雅,吳晨燕,馬儷珍2,,*

(1.天津農(nóng)學(xué)院工程技術(shù)學(xué)院,天津 300384; 2.天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心,天津 300384；3.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院,天津 300384)

熱反應(yīng)調(diào)味基料是利用氨基酸、多肽等蛋白質(zhì)水解物與還原糖、脂類等在一定條件下加熱發(fā)生美拉德反應(yīng)生成的風(fēng)味物質(zhì)(Maillard reaction products,MRPs)。從20世紀(jì)中葉起,香料界就開始采用美拉德反應(yīng)技術(shù)合成增香調(diào)味品。20世紀(jì)50年代,英國Morton采用美拉德反應(yīng)技術(shù)成功制備出肉味香精并申請專利,開創(chuàng)了肉類香料的快速發(fā)展并實現(xiàn)了商業(yè)化生產(chǎn)[1];Beak等[2]選用不同的商業(yè)酶水解小龍蝦加工過程中的廢棄下腳料,制得富有自然香氣的調(diào)味產(chǎn)品。劉丹等[3]通過優(yōu)化美拉德反應(yīng)工藝條件制備出肉香味渾厚的兔肉香精，并將其微膠囊化,拓寬了國內(nèi)肉類香精的市場。劉金凱等[4]以氨基酸和還原糖為原料經(jīng)美拉德反應(yīng)制得肉味濃烈、香氣柔和的羊肉味調(diào)味基料。呂玉[5]模擬反應(yīng)體系制備出有明顯牛肉特征味的牛肉香精。目前關(guān)于肉味調(diào)味基料的研究主要集中于酶解過程和美拉德熱反應(yīng)階段工藝參數(shù)的優(yōu)化[6-7]。

食品工業(yè)領(lǐng)域廣泛使用的抗氧化劑BHA、BHT、TBHQ等由于可能具有致癌性,一些歐美國家已禁止使用[8]。而經(jīng)美拉德反應(yīng)制成的調(diào)味基料所包含的類黑精、還原酮類及一系列含硫、含氮揮發(fā)性雜環(huán)化合物具有一定的抗氧化性,能夠被用來替代酚類食用抗氧化劑[9]。本實驗室前期在傳統(tǒng)調(diào)味基料的制備工藝基礎(chǔ)上增加了微生物發(fā)酵環(huán)節(jié)制成發(fā)酵牛肉調(diào)味基料(Fermented beef flavor,FBF),FBF由于經(jīng)過微生物發(fā)酵，被賦予了特殊的發(fā)酵香氣,經(jīng)檢測,FBF具有較強(qiáng)的抑菌性(對大腸桿菌的抑菌圈達(dá)到22 mm)和抗氧化性(總抗氧化能力為6.17 U/mL,抗超氧陰離子為2212.17 U/L,抑制羥自由基能力為3069.80 U/mL,自由基清除率為94.73%)。此外,有文獻(xiàn)報道[10],微生物發(fā)酵法可替代肉制品中的亞硝酸鹽的呈色作用。某些乳酸菌和其他微生物可在不添加亞硝酸鹽的條件下,在模擬肉體系中將高鐵肌紅蛋白(Met-Mb)轉(zhuǎn)化,生成具有紅色的肌紅蛋白衍生物—氧合肌紅蛋白(MbO2)或亞硝基肌紅蛋白(NO-Mb)等,替代亞硝酸鹽起呈色作用。

由此課題組提出假設(shè),FBF在滿足提高肉制品風(fēng)味的前提下,也許可以替代亞硝酸鹽的發(fā)色、抑菌和提高風(fēng)味的作用,從而可以替代或者部分替代亞硝酸鹽，從而大大提高產(chǎn)品的安全性。本試驗將不同比例的FBF應(yīng)用于紅腸的加工中,對成品進(jìn)行感官評定，并測定其在貯藏過程中的品質(zhì)及微生物多樣性變化情況,進(jìn)而考察其替代亞硝酸鹽的作用效果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛骨肉末 冷凍牛胴體電鋸分割時留下的肉末(骨肉比為3∶7),天津掛月食品有限公司;薩科THM-17(木糖葡萄球菌+戊糖片球菌) 上海昊岳實業(yè)有限公司;風(fēng)味蛋白酶(500 LAPU/g)、蛋白酶(1.5 AU/g) 丹麥諾維信公司;新鮮牛前肩肉、豬通肌、豬背膘 天津市康寧肉制品有限公司;白砂糖、葡萄糖、食鹽、淀粉、料酒、大蒜、雞蛋、白胡椒粉、NaNO2、抗壞血酸鈉、復(fù)合磷酸鹽等 均為食品級，天津紅旗農(nóng)貿(mào)市場;2-硫代巴比妥酸、三氯乙酸、EDTA、三氯甲烷、鹽酸、硼酸、氧化鎂、甲基紅、溴甲酚綠、95%乙醇等 均為分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

SX-500高壓蒸汽滅菌鍋 日本TOMY有限公司;THZ-98AB型恒溫振蕩器 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;Friocell 22恒溫恒濕培養(yǎng)箱 艾力特國際貿(mào)易有限公司;XZ-5L灌腸機(jī) 廣州旭眾食品機(jī)械有限公司;BS 224S電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;UV-180紫外分光光度計 日本島津公司;CM-5色差儀 日本KONICA MINOLTA公司;ST40R冷凍離心機(jī) 德國Theromo Scientific;BJ-MM12絞肉機(jī) 廣東省韶關(guān)北江機(jī)電廠;FA2高速剪切乳化分散機(jī) 上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 FBF的制備 以牛骨肉末為原料,經(jīng)熱-壓浸提、酶解、發(fā)酵后，添加葡萄糖、木糖和氨基酸制成FBF[11]。

1.2.2 紅腸制作 設(shè)計5組紅腸,5組紅腸的原輔料配方完全一致(見表1),具體分組為:既不添加亞硝酸鹽又不添加FBF的陰性對照組(Negative control,NC)、添加亞硝酸鹽的陽性對照組(Positive control,PC),分別添加2%、6%和10%FBF的樣品組。紅腸加工時,按照表1的配方,在牛肉、豬瘦肉中分別加入腌制劑,攪拌均勻,腌制12 h(4 ℃),然后加入其他輔料真空攪拌后灌腸,再經(jīng)烤制、蒸煮和煙熏等工序制成紅腸,冷卻后真空包裝,對成品進(jìn)行感官評價,然后貯藏于20 ℃條件下,分別在第0、5、10、15、20、25和30 d測定其紅度a*值、脂肪氧化值(TBARs),并根據(jù)理化指標(biāo)變化情況,選擇部分樣品進(jìn)行微生物多樣性分析。

表1 試驗設(shè)計Table 1 Design of the test

1.3 指標(biāo)測定方法

1.3.1 感官評價 感官評定小組由10 名經(jīng)過培訓(xùn)的食品專業(yè)人員組成(男女各半,年齡23～45歲)。感官評定之前,所有評定人員需在感官評定室待1 h以適應(yīng)環(huán)境。此外,為了減少樣品間的影響,評價每個樣品前需要用清水漱口。具體評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

1.3.2 紅度a*值的測定 將絞碎后的均勻樣品平鋪于比色皿內(nèi),確保測定表面平整,以標(biāo)準(zhǔn)白板為標(biāo)準(zhǔn)對樣品紅度a*值進(jìn)行測定。

1.3.3 TBARs值的測定 取5.0 g切碎的樣品,加15 mL 7.5%的TCA溶液,勻漿,過濾,取濾液2.5 mL,加入等體積的0.02 mol/L 2-硫代巴比妥酸,沸水浴40 min,迅速冷卻,加入3 mL氯仿,混勻,2 ℃、2000×g條件下離心10 min,取上清液,532 nm波長處測吸光度,按照以下公式計算:

式中:A-吸光度;V-樣品體積;M-丙二醛的分子量72.063;ε-摩爾吸光系數(shù)156;l-光程1(cm),光學(xué)路徑長度;m-樣品質(zhì)量(g)。

1.3.4 微生物多樣性分析 由于2% FBF添加量的紅腸抗氧化效果較好,所以分別選擇PC組、NC組、2% FBF組(記為F),在貯藏期第0、15、30 d,參考朱迎春等[12]的方法對樣品進(jìn)行微生物多樣性分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用Microsoft Excel 2003計算各指標(biāo)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差,用Statistix 8.1中Turkey test程序?qū)?shù)據(jù)差異顯著性(p<0.05)進(jìn)行分析,用Sigmaplot 10.0進(jìn)行繪圖。試驗重復(fù)進(jìn)行3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理組紅腸成品的感官評定結(jié)果

表3為5組紅腸成品的感官評價結(jié)果。與NC組(產(chǎn)品呈現(xiàn)暗褐色)相比,其余4組(PC組和2% FBF、6% FBF、10% FBF)的各項感官評價指標(biāo)均明顯較高。PC組由于添加了亞硝酸鹽,而亞硝酸鹽具有促進(jìn)發(fā)色、抑菌、抗氧化和提高風(fēng)味的作用,所以PC組的紅腸色澤誘人,且具有良好的風(fēng)味,但聞起來香氣不濃郁;添加2%和6% FBF后,紅腸香氣有明顯改善,濃郁而飽滿,但添加量為10%時,則會表現(xiàn)出香氣刺鼻的不良現(xiàn)象,且產(chǎn)品肉質(zhì)松散,口感粗糙。這是因為FBF添加量越大,紅腸中脂肪含量越高,添加10%的FBFH組脂肪含量高于其他組,脂肪對產(chǎn)品的滋味具有重要貢獻(xiàn)作用,但并非越高越好,尤其是人體對其的感官評價，脂肪含量過高,反而消費者不易接受。試驗發(fā)現(xiàn),凡是添加FBF的紅腸,均表現(xiàn)出淡紅色,與PC組相當(dāng),明顯好于NC組。

表3 紅腸感官評價結(jié)果Table 3 Result of sensory evaluation of sausage

2.2 不同處理組紅腸在貯藏期間紅度值的變化

5組紅腸貯藏過程中的紅度值如圖1所示。從圖1中可看出,NC組的紅度值顯著低于PC組和3個試驗組(p<0.05),而后四組之間則無顯著差異,紅度值處于8.49～10.99之間。亞硝酸鹽是肉制品加工過程中常用的發(fā)色劑,在一定的酸性條件下,亞硝酸鹽能夠生成亞硝酸,亞硝酸不穩(wěn)定,繼續(xù)分解產(chǎn)生NO,NO與肌紅蛋白反應(yīng)生成鮮艷的、亮紅色的亞硝基肌紅蛋白,因此PC組紅度值較高。試驗組是添加了FBF,有研究表明,乳酸菌具有產(chǎn)NO的能力,可將高鐵肌紅蛋白轉(zhuǎn)化為亞硝基肌紅蛋白。Moller等[13]在含有高鐵肌紅蛋白的MRS瓊脂培養(yǎng)基中接種商業(yè)用發(fā)酵劑中的戊糖片球菌,結(jié)果發(fā)現(xiàn),高鐵肌紅蛋白可被轉(zhuǎn)化為氧合肌紅蛋白,使肉呈鮮紅色。葡萄球菌由于其能夠產(chǎn)生蛋白酶和脂酶,分解蛋白質(zhì)和脂類物質(zhì)形成特殊的風(fēng)味而廣泛應(yīng)用于傳統(tǒng)肉制品中。Morita等[14]研究發(fā)現(xiàn)，從肉塊中分離的肉葡萄菌(Staphylococcuscarnosus)和溶酪葡萄球菌(Staphylococcuscaseolyticus)在培養(yǎng)基和肉基質(zhì)中均可將棕色的高鐵肌紅蛋白轉(zhuǎn)化為紅色的肌紅蛋白衍生物。本試驗所添加的FBF是添加薩科THM-17(木糖葡萄球菌+戊糖片球菌)發(fā)酵制成,具有轉(zhuǎn)化高鐵肌紅蛋白的能力,因此能夠提高紅腸的紅度值。

圖1 5組紅腸貯藏過程中紅度值的變化Fig.1 Changes of a* value of five sausage during the storage process

2.3 5組紅腸在貯藏期間TBARs值的變化

5組紅腸貯藏過程中的TBARs值如圖2所示。從圖2中可看出,5組紅腸的脂肪氧化程度整體呈上升趨勢,PC組的TBARs值始終較低,這是因為亞硝酸鹽具有較強(qiáng)的抗氧化性。添加2%和6% FBF制成的紅腸TBARs值在0～5 d與NC組差異不顯著(p>0.05),貯藏中后期始終低于NC組,雖然整體高于PC組(p<0.05),且在貯藏過程中TBARs值始終低于1.0 mg/kg,這說明FBF具有一定的抗氧化性,具有應(yīng)用于紅腸中替代亞硝酸鹽抗氧化性的潛力。而添加6% FBF制成的紅腸TBARs值反而高于2% FBF組,10%FBF制成的紅腸TBARs值甚至高于NC組,出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是FBF中本身含有一定量的脂肪,在貯藏過程中,其自身的脂肪也會發(fā)生氧化變質(zhì),因此TBARs值較高,進(jìn)而導(dǎo)致紅腸味評分低于其他組(見表3)。

圖2 5組紅腸貯藏過程中TBARs值的變化Fig.2 Changes of TBARs of fivesausage during the storage process

2.4 3組紅腸在貯藏期間的菌相變化

2.4.1 紅腸貯藏過程中微生物的多樣性分析 表4為經(jīng)過最低序列數(shù)抽平分析的Alpha多樣性指數(shù)表。通過單樣品的Alpha多樣性分析可以反映微生物群落的豐富度和多樣性。Chao1和Observed species指菌種豐富度指數(shù),指數(shù)越大,表明微生物群落豐富度越高。Shannon指數(shù)用來估算樣品中微生物多樣性,Shannon值越大,說明群落多樣性越高[15]。

表4 樣品Alpha多樣性指數(shù)表Table 4 Alpha diversity metrics of different samples

由表4可知,3組新鮮紅腸(NC0、PC0和F0)的Chaos1指數(shù)、Observed species和Shannon指數(shù)均較高,說明新鮮紅腸具有豐富的細(xì)菌群落,群落多樣性較高。隨著貯藏時間的延長,添加FBF的試驗F組的細(xì)菌豐富度和多樣性呈逐漸下降趨勢,并且較NC組下降趨勢更為明顯,這說明本試驗添加的FBF具有一定的抑菌性,能夠抑制某些微生物的生長。而PC組在貯藏到15 d時微生物群落豐富度和多樣性均有所下降,這是因為亞硝酸鹽抑菌性較強(qiáng),能夠抑制肉毒梭狀芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、產(chǎn)氣莢膜桿菌(Clostridiumperingens)等致病菌[15]的生長。而貯藏到30 d時,群落豐富度和多樣性又有所提高,是由于在這個過程中,產(chǎn)品已經(jīng)腐敗變質(zhì),蛋白質(zhì)和脂肪發(fā)生降解而產(chǎn)生一些低分子堿性化合物,使得產(chǎn)品pH提高,為某些能夠分解蛋白和脂肪的微生物如金黃色葡萄球菌提供條件[16],某些之前受到抑制的微生物又有所增長,從而導(dǎo)致樣品的微生物群落豐富度和多樣性隨之提高。

2.4.2 紅腸貯藏過程中基于門水平的微生物群落結(jié)構(gòu)分析 3組紅腸在貯藏過程中基于門水平的微生物群落結(jié)構(gòu)如圖3所示,從圖3中可看出,所有紅腸樣品的微生物群落主要由3個門構(gòu)成,分別為:Firmicutes(厚壁菌門)、Proteobacteria(變形菌門)和Cyanobacteria(藍(lán)藻門)。對于新鮮樣品即貯藏0 d來說,NC組中厚壁菌門所占比例最高,占到66.48%,且隨著貯藏到15 d時,其相對含量達(dá)到92.06%,此時產(chǎn)品已經(jīng)腐敗;而PC組和試驗F組在0 d時群落結(jié)構(gòu)組成相似,厚壁菌門所占比例較低,分別為4.39%和8.46%,隨著貯藏時間的延長,其豐度呈顯著上升趨勢,PC組從4.39%上升到89.86%,F組從8.46%上升到90.43%。相同貯藏時間點,F組的厚壁菌門含量始終高于PC組,而明顯低于NC組(除30 d外),貯藏到30 d時兩組樣品均已腐敗,此時厚壁菌門所占比例最高,且與NC組樣品腐敗時(NC15)的微生物群落結(jié)構(gòu)相似,說明厚壁菌門是導(dǎo)致紅腸變質(zhì)的優(yōu)勢腐敗菌,試驗F組添加的FBF對其有一定的抑制作用,從而延長產(chǎn)品的保質(zhì)期,達(dá)到跟添加亞硝酸鹽組相當(dāng)?shù)男Ч?/p>

圖3 基于門水平的微生物群落結(jié)構(gòu)變化Fig.3 Changes of microbial community structure based on the phylum level

2.4.3 紅腸貯藏過程中基于屬水平的微生物群落結(jié)構(gòu)分析 表5是3組紅腸貯藏期間基于屬水平的微生物群落結(jié)構(gòu)分布情況,用來直觀反映樣品在貯藏過程中的群落結(jié)構(gòu)動態(tài)變化。經(jīng)鑒定,本試驗9個樣品均有6個屬的細(xì)菌豐度較高。新鮮NC組紅腸樣品(NC0)中芽孢桿菌屬(Bacillus)豐度達(dá)到63.97%,占主導(dǎo)地位,其次是葡萄球菌屬(Staphylococcus),豐度為1.47%,其他菌屬豐度不高,但種類豐富。貯藏到15 d時(NC15),Bacillus豐度降至18.65%,Staphylococcus豐度增長到70.89%,結(jié)合理化檢測結(jié)果(圖2)和感官評價(樣品表面發(fā)黏,有明顯酸敗味),說明貯藏到15 d時,NC組樣品已腐敗變質(zhì),Staphylococcus是導(dǎo)致產(chǎn)品變質(zhì)的優(yōu)勢腐敗菌屬。當(dāng)樣品繼續(xù)貯藏至30 d時(NC30),Staphylococcus的豐度降低(27.53%),乳球菌屬(Lactococcus)和魏斯氏菌屬(Weissella)的豐度分別達(dá)到20.48%和25.12%,說明當(dāng)樣品腐敗之后,蛋白、脂肪等一些物質(zhì)降解形成的體系,為其他菌屬的成長提供了豐富的營養(yǎng)源。

表5 基于屬水平的微生物群落結(jié)構(gòu)(%)Table 5 Microbial community structure based on the genus level(%)

新鮮PC組紅腸樣品(PC0)中各菌屬相對豐度差異不明顯,最高為Staphylococcus(1.54%),貯藏到15 d時,樣品(PC15)中克雷伯菌屬(Klebsiella)和Staphylococcus占優(yōu)勢地位,豐度分別達(dá)到62.37%和15.84%,當(dāng)貯藏到30 d時樣品(PC30)已明顯腐敗,腐敗狀態(tài)時厭氧芽孢桿菌屬(Clostridiumsensustricto)和Staphylococcus的豐度較高,分別為38.51%和35.01%,說明Clostridiumsensustricto和Staphylococcus是紅腸貯藏后期的優(yōu)勢腐敗菌屬。

F組紅腸樣品在貯藏前期的微生物群落結(jié)構(gòu)與PC組樣品基本相似。新鮮樣品(F0)各菌屬豐度均不高,隨著貯藏到15 d(F15)時,Staphylococcus豐度急劇上升為48.63%,其次是Bacillus,占到17.30%,Klebsiella占到10.69%,而到貯藏終點時(F30),Staphylococcus豐度為41.13%,Weissella的豐度為34.66%,二者總豐度達(dá)到75.79%,成為導(dǎo)致紅腸腐敗的優(yōu)勢腐敗菌屬,這一結(jié)果為我們后期進(jìn)一步研究調(diào)味基料的抑菌性提供了思路,可以從這幾種優(yōu)勢腐敗菌為切入點,尋找對其有抑制作用的菌株，應(yīng)用于FBF的制備。

3 小結(jié)

在紅腸中添加一定比例的FBF能夠提高產(chǎn)品香氣,使產(chǎn)品肉香飽滿,風(fēng)味獨特。添加FBF制成的紅腸在貯藏期間紅度值顯著高于NC組(p<0.05),而與PC組色澤差異不顯著;添加2%和6%FBF制成的紅腸貯藏中后期的TBARs值顯著低于NC組的TBARs值(p<0.05);從微生物多樣性結(jié)果來看,添加FBF的紅腸與PC組紅腸微生物群落結(jié)構(gòu)相似,到腐敗狀態(tài)時葡萄球菌均成為其優(yōu)勢腐敗菌屬,說明本試驗添加的FBF對其有一定的抑制作用,能夠延長產(chǎn)品貨架期,有望成為肉制品加工過程中的一類天然腌制劑。