銀耳多糖的降解、磷酸酯化修飾及其抗氧化活性

陳 鵬,顏 軍,梁 立,劉 嵬,茍小軍,何 鋼

(藥食同源植物資源開發四川省高校重點實驗室,四川抗菌素工業研究所,成都大學,四川成都 610052)

銀耳(Tremellafuciformis)是銀耳科銀耳屬食用菌,具有滋陰潤肺、開胃健脾的功效[1],現代醫學研究表明,多糖是銀耳的主要活性成分,具有抗氧化、降血脂、抑菌等多種生物活性[2,3]。多糖的糖苷鍵種類、連接方式以及空間結構會影響多糖的抗氧化、降血脂、免疫等生物活性[4]。由于多糖的結構復雜,解析較為困難,多糖的構、效關系研究進展緩慢,常見的方法是將多糖進行部分降解,解析活性結構單元,以及對多糖進行結構修飾[5]。

常用的多糖的結構修飾方法有甲基化、乙酰化、硫酸酯化、磷酸酯化等方法[6,7]。磷酸酯化修飾是指使多糖的羥基被磷酸酯基團取代,已有研究表明,多糖磷酸酯化能夠增強多糖的部分生物活性[8]。如龍眼多糖磷酸酯化修飾后,能夠增強其抗腫瘤、抗菌活性[9];南瓜多糖磷酸酯化修飾后,增強了南瓜多糖的抗氧化活性[10]。銀耳多糖具有諸多生物活性,已有研究表明,銀耳多糖硫酸酯化、羧甲基化、乙酰化修飾能夠改善溶解性和增強活性,而磷酸酯化修飾研究報道較少。銀耳多糖相對分子質量大、溶解性差[11],難以直接進行磷酸酯化修飾。有研究表明,多糖經部分降解后,溶解性會隨著分子量的降低而增強[12,13],因此可將銀耳多糖進行部分降解,將獲得的低分子量銀耳多糖再進行磷酸酯化修飾。

本文為以雙氧水-VC體系對銀耳多糖(Tremellapolysaccharide,TP)進行氧化降解,得到降解銀耳多糖(DegradedTremellapolysaccharide,DTP),采用三氯氧磷和吡啶對其進行磷酸酯化修飾,并測定修飾后的銀耳多糖(Phosphate degradedTremellapolysaccharide,PDTP)的抗氧化活性,旨在為后續深入研究銀耳多糖的構效關系提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

銀耳子實體:通江銀耳 通江裕德源公司;乙醇、氯仿、正丁醇、三氯氧磷、磷酸二甲酯、硫酸、硝酸、雙氧水、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、鉬酸銨、硫酸亞鐵、水楊酸 均為市售分析純;KBr 光譜純 成都市科龍化工試劑廠;葡聚糖(DextranT-10,40、70、500、2000)透析袋(3000 Da) 北京索萊寶科技有限公司。

L-2000液相色譜儀 日立科學儀器有限公司;紫外可見光分光光度儀 尤尼柯儀器有限公司;傅里葉紅外光譜儀 賽默飛公司;CT15RT型高速臺式冷凍離心機 上海天美科學儀器有限公司；GL-21M型高速冷凍離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司;FD-1C-55型凍干機 北京博醫康實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 銀耳多糖的制備 參考文獻[14]方法,稱取100 g干燥銀耳粉,料液比1∶30 g/mL,提取溫度100 ℃,提取時間4 h,提取液8000 r/min離心10 min,取上清液濃縮,加入4倍體積無水乙醇過夜沉淀。8000 r/min離心10 min,收集多糖沉淀,加入100 mL蒸餾水復溶,8000 r/min離心10 min,除去沉淀,上清液用Sevage試劑除蛋白質等雜質,直到溶液在蛋白質最大吸收波長280 nm和核酸最大吸收波長254 nm處無吸收為止,透析48 h,將銀耳多糖溶液于-40 ℃真空冷凍干燥24 h,得到銀耳多糖(TP)。

1.2.2 銀耳多糖的氧化降解 參考Duan K等的方法[15],稱取1 g銀耳多糖于500 mL錐形瓶中,加100 mL蒸餾水使其溶解,加入100 mL VC溶液(10 mmol/L)、300 mL H2O2溶液(10 mmol/L),反應2 h。將反應液透析24 h,透析液7000 r/min離心10 min,將上清液于-40 ℃真空冷凍干燥24 h,獲得低分子量銀耳多糖樣品(DTP)。

1.2.3 銀耳多糖分子量測定 采用高效凝膠滲透色譜法(High performance gel permeation chromatography,HPGPC)測定。色譜條件:色譜柱為YMC PACK-Diol 200 ?(300 mm×8.0 mm ID,5 μm,20 nm),流動相為蒸餾水;流速0.8 mL/min,柱溫30 ℃;檢測器為示差折光檢測器;進樣量20 μL。

將降解前后的多糖樣品及葡聚糖標準品配制成5 mg/mL溶液,分別進樣分析,求得線性方程。將降解前后多糖樣品的保留時間代入線性方程,計算多糖的相對分子質量。

1.2.4 磷酸酯化銀耳多糖的制備 按照文獻[9]中的方法,稱取20 mg低分子量銀耳多糖于圓底燒瓶中,加蒸餾水5 mL、吡啶10 mL,冰浴下用6 mol/L氫氧化鈉溶液,調節pH至12。緩慢滴加三氯氧磷10 mL、磷酸三甲酯3 mL,隨后45 ℃水浴反應4 h,反應結束后,用4 mol/L鹽酸溶液調節pH至7,蒸餾水透析48 h,于-40 ℃真空冷凍干燥24 h,得到磷酸酯化銀耳多糖(PDTP)。

1.2.5 磷酸酯化銀耳多糖取代度的測定 移取不同濃度的磷標準溶液10 mL,依次加入鉬酸銨溶液4 mL和0.05 mol/L VC溶液2 mL。置于100 ℃水浴加熱10 min,隨后冷卻至室溫,以空白溶液為對照,于824 nm測吸光度值。以磷濃度為橫坐標,吸光度值為縱坐標,繪制磷標準曲線[16]。

取20 mg酯化銀耳多糖倒入消化瓶內,加入1.5 mL硫酸-硝酸混合溶液,逐漸加熱,待溶液變得澄清后,加入4.5 mL蒸餾水,調節pH至7,并按上述磷標準溶液處理方法進行處理,最后測得吸光度代入線性回歸方程,求得磷酸酯化多糖的磷含量。

式中,M為樣品中的磷含量(%)。

1.2.6 銀耳多糖水溶解度的測定 采用高速離心法[17]測定銀耳多糖的水溶解度,稱取60 mg DP、DTP、PDTP,加入1 mL蒸餾水溶解,15000 r/min離心10 min,移除上清液,將底部沉淀烘干至恒重,兩次重量之差即為銀耳多糖水溶解度。

1.2.7 銀耳多糖紅外光譜分析 稱取磷酸酯化修飾前后的銀耳多糖各5 mg,加入5 mg KBr研磨均勻,隨后取2 mg粉末壓片并進行紅外光譜分析,掃描范圍為400～4000 cm-1。

1.2.8 銀耳多糖抗氧化活性的測定

1.2.8.1 銀耳多糖羥自由基清除能力的測定 分別取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mg/mL TP、PDTP和DTP溶液各1.0 mL,加入FeSO4溶液2.0 mL、水楊酸-乙醇1.5 mL、H2O20.1 mL,混勻后,37 ℃反應30 min,于510 nm處測量吸光度值。以1.0 mL蒸餾水代替多糖溶液作為空白對照[18]。

羥自由基清除率(%)=[(A0-As)/A0]×100

式中,A0為空白管的吸光度,As為加入樣品后的吸光度。

1.2.8.2 銀耳多糖DPPH自由基清除能力的測定 分別取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mg/mL TP、PDTP和DTP溶液各0.1 mL,加入3.9 mL 0.1 mmol/L DPPH(95%乙醇配制)溶液,渦旋混勻,避光37 ℃反應30 min,離心10 min;取0.1 mL純水,加入3.9 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液混勻作空白對照。混勻后暗處反應30 min,于517 nm處測定吸光度值[19]。

DPPH自由基清除率(%)=(1-As/A0)×100

式中,A0為空白管的吸光度,As為加入樣品后的吸光度。

1.3 數據處理

采用SPSS 19.0軟件進行數據處理,所有實驗均重復操作3次,實驗結果均表示為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 銀耳多糖的相對分子質量分析

高效凝膠滲透色譜法(High performance gel permeation chromatography,HPGPC)是測定樣品相對分子質量的常用方法,銀耳多糖的相對分子質量圖譜如圖1所示。以標準葡聚糖保留時間為橫坐標,相對分子質量的對數為縱坐標作圖,得線性回歸方程Y=-0.5609X+9.0527,r=0.9722(X為保留時間,Y為分子量對數),將降解前后樣品保留時間代入方程計算,降解前銀耳多糖的相對分子質量范圍為40.27～65.33 kDa,降解產物經透析后獲得一個單一組分,其相對分子量為7.82 kDa。

圖1 銀耳多糖的相對分子質量圖譜Fig.1 Molecular weight chromatogram of Tremella polysaccharide

2.2 銀耳多糖的紅外光譜分析

紅外光譜是表征樣品特征吸收基團的常用手段,銀耳多糖的紅外光譜圖如圖2所示。由圖2可知,3413.10 cm-1處的吸收峰是由多糖的羥基伸縮振動引起的;1670.35 cm-1處的吸收峰是多糖C=O伸縮振動峰,表明銀耳多糖中含有糖醛酸;1088.15 cm-1處的吸收峰是多糖C-O的變角振動吸收峰[20],這幾處吸收峰為銀耳多糖的特征吸收峰。與DTP譜圖相比,1262.22 cm-1處的吸收峰為P=O的特征吸收峰,540.55 cm-1處的吸收峰為磷酸酯鍵的特征吸收峰,表明銀耳多糖磷酸酯化成功。

圖2 銀耳多糖的紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectrum of Tremella polysaccharide

2.3 磷酸酯化銀耳多糖取代度的測定結果

如圖3所示,磷標準曲線方程為Y=0.0517X+0.0073,r=0.9989(X為標準品磷的濃度,Y為吸光度)。在0～10 μg/mL范圍內,濃度與吸光度值線性關系良好。將樣品吸光度值代入曲線,計算后得出樣品的磷含量為0.41%,取代度Ds為0.021。

圖3 磷標準曲線Fig.3 The standard curve of phosphorus

2.4 銀耳多糖水溶解度的測定結果

銀耳多糖水溶解試驗結果見表1。由表1可知,降解前銀耳多糖的溶解度為15.33±1.51 mg/mL,降解后低分子量銀耳多糖的溶解度為30.45±1.23 mg/mL,磷酸酯化修飾后銀耳多糖的溶解度為42.71±1.67 mg/mL,表明氧化降解及磷酸酯化修飾能明顯改善銀耳多糖的水溶解度。

表1 銀耳多糖水溶解度Table 1 The water solubility of Tremella polysaccharide

2.5 銀耳多糖的抗氧化活性研究

2.5.1 銀耳多糖清除羥自由基的能力 多糖組分對羥自由基的清除率結果如圖4所示。由圖4可知,隨著濃度增大,VC和各組分多糖對羥自由基的清除能力逐漸增強,在2.4 mg/mL時,清除效率最高,VC清除率為99.6%,TP清除率為38.23%,DTP清除率為50.34%,PDTP清除率為67.45%。PDTP清除羥自由基的IC50為1.14 mg/mL,DTP清除羥自由基的IC50為2.35 mg/mL,而TP在最大濃度2.4 mg/mL時的清除率仍未達到50%。結果表明,TP、DTP、PDTP對羥自由基的清除效果隨濃度增加逐漸增強。多糖體外清除羥自由基的假設機理是羥自由基奪取銀耳多糖碳鏈上的活潑氫原子,與之結合成水;剩下的碳原子失去氫原子后成為碳自由基,進一步氧化成過氧化自由基,最后分解成無害的物質[21]。高分子量的銀耳多糖鏈之間相互纏繞、結構復雜,可被羥自由基獲取的氫原子數量少,經過氧化降解后多糖鏈有部分斷裂,水溶解度增加,被羥自由基獲取的氫原子數量增加[22,23],因此DTP對羥自由基的清除效果相比TP更好。據報道,黑加侖多糖[24]和龍須菜多糖[25]降解后對羥自由基的清除率顯著提高。對DTP進行磷酸酯化修飾過后,引入的磷酸酯鍵改變了多糖原有的空間結構,PDTP的水溶解度為42.71±1.67 mg/mL,比TP、DTP更高,在反應中可被羥自由基獲取的氫原子數更多,因此PDTP羥自由基的清除效果優于DTP。

圖4 銀耳多糖對羥自由基的清除率Fig.4 Hydroxyl radical scavenging activity of Tremella polysaccharide

2.5.2 銀耳多糖清除DPPH自由基的能力 多糖組分對DPPH自由基的清除率結果如圖5所示。由圖5可知,在0.4～2.4 mg/mL范圍內,VC對DPPH自由基清除率接近100%,三個多糖組分對DPPH自由基的清除能力均有劑量效應,濃度為2.4 mg/mL時,各多糖對DPPH自由基清除率最高,TP為37.15%,DT為65.24%,PDTP為73.77%。PDTP清除DPPH自由基的IC50為0.98 mg/mL,DTP清除DPPH自由基的IC50為2.05 mg/mL,而TP在最大濃度2.4 mg/mL時仍未達到50%清除率。結果表明,各濃度下對DPPH自由基的清除作用,PDTP>DTP>TP。DPPH自由基有單電子,自由基清除劑可與其單電子配對而使得紫外吸收逐漸消失[26]。對銀耳多糖進行降解后,銀耳多糖鏈的結構發生變化,水溶解度增加,DPPH自由基上孤對電子與多糖配對的空間位阻減小,采用三氯氧磷和吡啶體系對其進行磷酸酯化后,DPPH自由基可進一步奪取POCl2基團上的電子[27],因此PDTP在各濃度下對DPPH自由基的清除作用最好。

圖5 銀耳多糖對DPPH自由基的清除率Fig.5 DPPH radical scavenging activity of Tremella polysaccharide

3 結論

本研究中銀耳多糖經雙氧水-VC體系降解透析后,獲得一個單一組分,相對分子質量為7.82 kDa;銀耳多糖的水溶解度為15.33±1.51 mg/mL,經降解后增加到30.45±1.23 mg/mL,表明氧化降解能提高銀耳多糖的水溶解度;磷酸酯化銀耳多糖在1262.22、540.55 cm-1處出現了磷酸酯鍵吸收峰,采用磷鉬藍法測定樣品的取代度為0.021,證明磷酸基團和銀耳多糖結合成酯,修飾后銀耳多糖的水溶解度提高為42.71±1.67 mg/mL。體外抗氧化實驗表明,各濃度下的清除作用PDTP>DTP>TP,表明修飾后的低分子量銀耳多糖對自由基的清除效果良好。本文對銀耳多糖進行降解和磷酸酯化,提高了多糖的水溶解度和抗氧化活性,但其作用機制還有待深入研究,本研究結果可為銀耳多糖的構效關系奠定基礎。