基于自組裝技術的EGCG多層乳液的制備及其微膠囊化

左小博,孔俊豪,蘇小琴,譚 蓉,楊秀芳

(中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院/浙江省茶資源跨界應用技術重點實驗室,浙江杭州 310016)

茶多酚是茶葉中多酚類物質及其衍生物的總稱,具有抗氧化、清除自由基、抑菌消炎等諸多功效[1]。茶多酚中又以兒茶素類為主,約占茶多酚總量的60～80%[2-3]。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)作為一種重要兒茶素單體,從發現至今一直備受關注[4]。EGCG不僅是茶葉品質呈現的主要化學成分,更是一種天然抗氧化劑、防腐劑,在食品、醫藥、日化等領域具有廣闊應用前景。然而EGCG穩定性差,在潮濕、光照、高溫等條件下易發生氧化、縮合等反應，影響了其功能特性[5]。針對EGCG易氧化降解的難題,微膠囊包埋技術被認為是提高其穩定性的可行途徑[6-7]。以麥芽糊精、阿拉伯膠和殼聚糖等壁材為載體，通過噴霧干燥包封兒茶素制備的微膠囊,在不同存儲條件下,與未包封的兒茶素相比其穩定性有顯著改善[8-9]。

然而,基于傳統方法制備的微膠囊,在大小和囊壁厚度方面還無法準確控制,且多層包埋效果欠佳[10-11]。層層自組裝(LBL,layer-by-layer self-assembly)是基于溶液中異相電荷的自由相互作用,逐層交替疊加形成多層組裝結構的新型技術。報道稱[12-13],采用層層自組裝技術制備天然活性成分微膠囊,能夠提高產品品質穩定性,同時具有條件溫和、可實現多層包埋、成品物化特征可控等優勢[14]。如黃晶等[15]以乳液納米微粒為核心利用層層自組裝制備了百里香精油微膠囊,其包埋率可達80.23%。林傳舟等[16]則通過靜電層層自組裝并結合噴霧干燥制備了亞麻籽油微膠囊,結果表明多層包埋微膠囊可明顯提高亞麻籽油的氧化穩定性。

本研究采用層層自組裝技術包載EGCG,從固態和液態兩個方面對EGCG進行穩態化研究,形成穩態體系及微膠囊化產品。旨在通過單因素及正交試驗優化工藝參數,制備粒徑均一、穩定性較好的EGCG微膠囊產品,拓展茶多酚穩態化技術,豐富和擴大茶多酚產品形式和應用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

EGCG 純度98%,中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院;CS2型辛烯基琥珀酸淀粉鈉(SSOS) 蘇州高峰科技有限公司;有機油茶籽油 浙江久晟油茶科技股份有限公司，食用一級;阿拉伯樹膠 上海阿拉丁生化科技股份有限公司，醫藥級(粉末);其它化學試劑 均為分析純。

AE 500S-H實驗室數顯剪切乳化機 上海昂尼儀器儀表有限公司;TU-1901紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;HH-6數顯恒溫水浴鍋 常州朗越儀器制造有限公司;YC-015實驗型噴霧干燥器機 上海雅程儀器設備有限公司;XH-C旋渦混合器 金壇市醫療儀器廠;APV1000高壓均質機 丹麥APV公司;LD-IIB低速大容量多管離心機 無錫市瑞江分析儀器有限公司;TFM-700V四波段倒置熒光顯微鏡 上海團結儀器有限公司;SBC-12離子濺射儀 北京中科科儀股份有限公司;Phenom Pro高分辨臺式掃描電鏡 荷蘭Phenom飛納有限公司;DSC 204 F1 Phoenix差示掃描量熱儀 耐馳科學儀器商貿(上海)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 EGCG單層乳液制備及工藝優化 按固液比1∶8 (g/g)將SSOS溶于蒸餾水,以1000 r/min在水浴60 ℃下攪拌1 h,以質量比SSOS∶EGCG=5∶3 (g/g)加入EGCG并溶解,500 r/min攪拌過夜,使其充分水化后制成水相。按一定水油相質量比將茶葉籽油加入水相,60 ℃恒溫水浴攪拌10 min,10000 r/min高速剪切2.5 min,30 MPa均質3次得EGCG單層乳液。

以離心穩定性為考察指標,通過單因素實驗分析SSOS添加量(g)、水相油相比(g/g)、剪切速率(r/min)、剪切時間(min)等因素對體系離心穩定性的影響。固定因素為:SSOS淀粉添加量50 g、水相油相比10∶1、剪切速率9000 r/min、剪切時間3 min。單個因素的變化梯度為:SSOS淀粉添加量(50、70、90、110 g)、水相油相比(12∶1、10∶1、8∶1、4∶1 g/g)、剪切時間(2.5、3、3.5、4.0 min)、剪切速率(8000、9000、10000、11000 r/min)。

結合單因素實驗結果,以離心穩定性系數為考察指標,通過正交試驗優化乳液制備參數。正交組合設計水平見表1。

表1 正交組合設計水平表Table 1 Orthogonal combination design level table

1.2.2 EGCG多層乳液制備 按質量比4∶3將單層乳液與阿拉伯膠溶液混合,以阿拉伯膠濃度10%,10000 r/min剪切時間3 min為固定因素,經30 MPa均質3次得EGCG多層乳液[17]。以離心穩定性為指標,根據單層乳液制備工藝影響因素分析結果,分析阿拉伯膠濃度(5、10、15、20%)、剪切速率(8000、9000、10000、11000 r/min)、剪切時間(2.5、3、3.5、4.0 min)等因素對多層乳液離心穩定性的影響。

1.2.3 離心穩定性測定 參考文獻[18]方法進行測定。將待測液稀釋100倍,于4500 r/min離心15 min,分別取離心后下層溶液及離心前樣品,于波長500 nm處測定吸光度。離心穩定系數Ke按下式計算:

式中:A1為離心前樣品吸光度;A2為離心后下層溶液吸光度。

1.2.4 EGCG乳液微觀形態觀察 以EGCG多層乳液為研究對象,并結合離心穩定性分析結果,通過光學顯微鏡分析阿拉伯膠濃度(5%、10%、15%)及剪切速率(9000、10000、11000 r/min)對體系微觀形態的影響。

1.2.5 EGCG微膠囊制備 以優化工藝制備EGCG多層乳液,通過噴霧干燥(進料速率1500 mL/h,進風溫度229 ℃、出風溫度75 ℃)制備EGCG微膠囊。

1.2.6 微膠囊水分含量及包封率測定 水分含量測定參照GB 5009.3-2016 《食品安全國家標準食品中水分的測定》中直接干燥法進行測定[19]。

微膠囊包封率測定參照Wang、煙利亞等人的方法[20-21]。包封率計算公式如下:

1.2.7 EGCG微膠囊熱力學性質 稱取制備好的微膠囊樣品10 mg于DSC測量池中,以空DSC測量池作參比,掃描溫度從30～225 ℃,升溫速率為5 ℃/min,達到225 ℃后恒溫5 min,之后以2 ℃/min的速率降溫至30 ℃。利用儀器配套分析軟件從熱流曲線分析得到熱力學參數。

1.2.8 EGCG微膠囊微觀形貌觀察 通過掃描電鏡(SEM)觀察樣品微觀形貌。將樣品用導電膠帶固定于樣品臺上,經離子濺射儀噴金處理后,裝入掃描電鏡觀察室,在5～15 kV下觀察拍照。

1.3 數據處理

每組實驗重復三次測定,結果以平均值±標準偏差(means±SD)表示。采用Microsoft Office Excel 2007及SPSS 19.0對所得數據分析,并用Duncan新復極差分析結果差異顯著性水平(p<0.05)。應用OriginPro 9.0.0軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 EGCG單層乳液制備的單因素實驗結果

2.1.1 SSOS添加量對體系離心穩定性的影響 SSOS添加量對單層乳液離心穩定性的影響如圖1所示。由圖1可知,SSOS添加量在50～90 g的范圍內時,離心穩定系數Ke隨SSOS添加量增加而減小(p<0.05),表明體系穩定性增強。在實驗范圍內,SSOS添加90 g時Ke為0.19,具有較佳離心穩定性。

圖1 SSOS添加量對單層乳液離心穩定性的影響Fig.1 Effect of SSOS addition on centrifugal stability of single-layer emulsion

2.1.2 水相油相比對乳液離心穩定性的影響 水油相比對體系離心穩定性的影響如圖2所示。由圖2可知,在水相油相比12∶1～8∶1范圍內,Ke隨水相油相比減小而減小(p<0.05)。在實驗范圍內,水相油相比8∶1時,Ke達0.24，具有較佳離心穩定性。

圖2 水相油相比對單層乳液離心穩定性的影響Fig.2 Effect of water-oil ratio on centrifugal stability of single-layer emulsion

2.1.3 剪切時間對體系離心穩定性的影響 剪切時間對單層乳液離心穩定性影響如圖3所示。由圖3可知,隨著剪切時間增加,Ke顯著降低(p<0.05)。基于預實驗結果和能耗及長時高速剪切操作性考慮,實驗范圍內,剪切4 min已達到較佳離心穩定性。

圖3 剪切時間對單層乳液離心穩定性的影響Fig.3 Effect of shear time on centrifugal stability of single-layer emulsion

2.1.4 剪切速率對體系離心穩定性的影響 剪切速率對單層乳液離心穩定性的影響如圖4所示。由圖4可知,隨著剪切速率的增加,Ke逐漸降低(p<0.05)。基于預實驗結果和能耗及長時高速剪切操作性考慮,在實驗范圍內,11000 r/min時已達到較佳離心穩定性。

圖4 剪切速率對單層乳液離心穩定性的影響Fig.4 Effect of shear rate on centrifugal stability of single-layer emulsion

2.2 EGCG單層乳液制備的正交試驗結果

在單因素實驗結果分析基礎上,以SSOS添加量(g)、油相添加量(g)、剪切速率(r/min)、剪切時間(min)為自變量,以Ke為考察指標,做L9(3)4正交試驗,并對結果進行方差和極差分析,結果見表2。

表2 體系離心穩定性正交試驗結果分析Table 2 Results for orthogonal test of centrifugal stability of emulsion

由表2知,各因素對離心穩定系數的影響順序依次為:C(剪切速率)>A(SSOS添加量)>B(水相油相比)>D(剪切時間)。制備工藝最優組合為:A1B2C1D1,即SSOS添加量70.0 g、水相油相比8∶1,剪切速率9000 r/min,剪切時間3 min。根據正交優化所得配方進行平行驗證實驗,結果表明按最優工藝制得的單層乳液Ke為0.138±0.011,說明工藝選擇合理、可行性高。

2.3 EGCG多層乳液制備的影響因素

不同因素對EGCG多層乳液離心穩定性的影響見圖5。由圖5可知,離心穩定性隨阿拉伯膠濃度的增加先增后減。這可能是由于阿拉伯膠濃度的增加,增大了油水雙相界面乳化成分吸附量,使液滴間空間位阻和靜電排斥力增強,起到穩定體系的作用[22]。之后,隨著阿拉伯膠濃度進一步增大,體系黏度增加,水相中存在過量游離乳化劑分子,造成由排空效應引起的顆粒團聚,使體系穩定性下降[23]。分析實驗結果,選擇15%阿拉伯膠濃度作為多層乳液制備的條件。

圖5 不同因素對EGCG多層乳液離心穩定性的影響Fig.5 Effect of different factors on the centrifugal stability of EGCG polydisperse注:A、B、C分別表示:阿拉伯膠濃度、剪切時間、剪切速率對EGCG多層乳液離心穩定性的影響。

剪切速率及剪切時間對多層乳液離心穩定性影響呈相似趨勢,隨著速率及時間增加,體系離心穩定性逐漸增加,但到一定趨勢后保持穩定。剪切速率11000 r/min時具有最佳離心穩定性,但與9000 r/min相比離心穩定性增加幅度有限(p>0.05),綜合考慮實驗選擇9000 r/min 剪切3 min作為較優條件制備EGCG多層乳液。

2.4 EGCG穩態乳液微觀形態觀察

多層乳液離心穩定性結果中,阿拉伯膠濃度及剪切速率對穩定性變化有較大影響,而當剪切時間從3 min增加至4 min時離心穩定性未有顯著性變化(p>0.05),預實驗也發現剪切時間對乳液微觀形態影響較小。分析主要因素對EGCG多層乳液體系微觀形態的影響及規律,結果如圖6所示。

由于阿拉伯膠含有一定量蛋白質,使其能夠在油水界面吸附并形成一層穩定的膜。阿拉伯半乳聚糖蛋白中的蛋白鏈與親油層吸附,而阿拉伯半乳聚糖則與親水層結合[23]。由圖6可知,隨著阿拉伯膠濃度增大,分散系中乳化液滴粒徑逐步增大,粒徑趨于不統一,隨著阿拉伯膠濃度進一步增加,不同粒徑液滴之間出現相互粘附,有聚集成簇的趨勢。這可能是由于阿拉伯膠濃度增加過程中,部分未被吸附的小顆粒分子吸附在乳液表面形成濃度差,造成體系的排空效應,導致膠團顆粒相互聚集[23-24]。此外,由圖6可知,高速剪切處理能明顯改變乳液體系中液滴分布狀態,使界面聚合過程中的液滴粒徑更加趨于均一,提高乳液穩定性。

圖6 阿拉伯膠濃度及剪切速率對EGCG乳液微觀形態的影響Fig.6 Effect of gum arabic concentration and shear rate on the microscopic morphology of EGCG emulsion 注:阿拉伯膠濃度:A1:5%,A2:10%,A3:15%;剪切速率:B1:9000 r/min,B2:10000 r/min,B3:11000 r/min。

2.5 EGCG微膠囊熱力學性質

從圖7的DSC熱流曲線可看出,EGCG在110.2±5.2 ℃時出現吸熱峰,其原因可能是由于內部差向異構的轉變,而在216.5±3.8 ℃時出現強的吸熱峰,主要是對應于EGCG的熔融溫度,此時有相變發生[25-26]。相比之下,EGCG微膠囊在63.5±2.2 ℃左右時出現吸熱峰,推測可能是由于樣品含水量高,內部結合水蒸發導致的吸熱造成的,而在較高溫度下,EGCG微膠囊的熱流曲線相對穩定,表明熱力學穩定性較好[27]。水分含量測定結果也顯示，微膠囊樣品水分含量達8.2%±0.1%。實驗還發現,EGCG樣品未檢測到回溫曲線,而EGCG微膠囊化后存在回溫曲線,也說明微膠囊化一定程度提高了EGCG熱力學穩定性。

圖7 EGCG和EGCG微膠囊的DSC熱流分析Fig.7 DSC heat flow curves of EGCG and EGCG microcapsules

2.6 EGCG微膠囊產品微觀形態

對優化配方制備的EGCG微膠囊,通過SEM觀察樣品微觀形貌及表面形態,見圖8。

圖8 EGCG微膠囊化前后掃描電鏡圖像Fig.8 Scanning electron microscopy of EGCG before and after the microencapsulation 注:A:EGCG(A1:5000×;A2:2500×); B:EGGC微膠囊(B1:5000×;B2:5000×)。

從圖8可見,EGCG在包埋前呈堆積的層塊狀結構,結構分布不規則。微膠囊后,產品包埋率達53.5%±0.5%，所得產物均勻性良好,其直徑為1～10 μm,呈表面褶皺和凹痕的橢球狀,包埋效果較好,部分產物呈表面光滑的圓球狀。凹痕和干癟是噴霧干燥產品存在的特征,可能是由于干燥時水分快速散失造成[28]。微膠囊顆粒表面的凹痕增大了比表面積,有利于壁芯成分的緩釋[29]。

3 結論

EGCG乳液體系較佳的制備參數為:SSOS添加70.0 g、水相油相比8∶1 (g/g),9000 r/min剪切時間3 min后30 MPa均質3次,然后按質量比4∶3(單層乳液:阿拉伯膠溶液)與15%阿拉伯膠水溶液混合,9000 r/min剪切3 min,30 MPa均質3次即得。經噴霧干燥制備的EGCG微膠囊化產品均勻性良好,粒徑保持在1～10 μm,包封率達53.5%±0.5%、水分含量8.2%±0.1%,部分呈雙層包埋結構,一定程度提高了產品穩定性。本研究為提高EGCG產品穩定性,更好發揮EGCG的功效價值具有參考意義。