黑米與歐洲越橘花色苷抗氧化活性比較研究

常世敏,李乾麗,謝嬋媛,劉貴巧,李衛霞,蔡如玉,李紅民,苑博華,*,安曉東

(1.河北工程大學生命科學與食品工程學院,河北邯鄲 056021; 2.河北省植物天然色素產業技術研究院,河北邯鄲 057250；3.晨光生物科技集團股份有限公司,河北邯鄲 057250; 4.河北工程大學醫學院,河北邯鄲 056002)

黑米色素屬于花色苷類化合物,其主要成分為矢車菊素-3-葡萄糖苷[1]。黑米花色苷是一種天然食用色素,廣泛應用于食品、醫藥、化妝品等行業,其具有良好的抗氧化、抗炎癥、抗腫瘤及防止體內過氧化等生理功能[2-4],有研究表明黑米花色苷具有降血脂、抗氧化和改善缺鐵性貧血等功效[5-8]。

歐洲越橘因富含花色苷而成為國內外研究的熱點,研究證明歐洲越橘花色苷主要成分為矢車菊葡萄糖苷[9],具有清除自由基、抗炎癥、提高免疫力、延緩衰老及抗癌等多種生理功效[10-14],因此被開發成各種保健品,但其價格昂貴,尋求歐洲越橘花色苷的替代品成為研究者關注的焦點。

與歐洲越橘相比,黑米資源豐富,成本低廉,但是目前關于歐洲越橘花色苷與黑米花色苷抗氧化性能的比較研究未見報道。本研究旨在通過比較黑米花色苷和歐洲越橘花色苷總還原能力以及清除超氧陰離子自由基、羥自由基、過氧化氫、DPPH·和ABTS+·的能力,為開發具有較強抗氧化能力且價格低廉的黑米產品提供有效理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

歐洲越橘花色苷(粉末) 南京澤朗醫藥科技有限公司;黑米花色苷(粉末) 晨光生物科技集團股份有限公司提供;無水乙醇、30%過氧化氫、抗壞血酸、硫代巴比妥酸、Tris等 均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、2-D-脫氧核糖 美國Sigma公司。

UV-2100紫外可見分光光度計 美國尤尼柯儀器有限公司;BPG-9100BH電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司;KQ-50DE超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 花色苷含量的測定 以矢車菊-3-葡萄糖苷為標準品,參考相關文獻[1]方法,采用紫外分光光度計法測定色價,準確稱取0.15～0.2 g樣品(精確至0.0002 g),用乙醇-鹽酸溶液溶解,轉移至100 mL容量瓶中,加乙醇-鹽酸溶液定容至刻度,搖勻。取此樣液置于1 cm比色皿中,以乙醇-鹽酸溶液做空白對照,用分光光度計在535 nm測定吸光度,按下式計算色價:

根據線性方程C=0.1021E+0.2137(r=0.9953),計算出樣品花色苷含量。

式中:E為色價;C為樣品中花色苷含量(g/100 g)。

1.2.2 色素提取物基本成分含量的測定 蛋白質測定采用GB 5009.5-2016,總糖的測定采用苯酚-硫酸法[15],脂肪的測定采用GB 5009.6-2016,水分的測定采用GB 5009.3-2016,灰分的測定采用GB 5009.4-2010。

1.2.3 總還原能力的測定 參考相關文獻[16]方法并稍作修改。在2.5 mL磷酸鹽緩沖溶液(pH6.6)中,加入1 mL不同濃度的色素溶液和2.5 mL 1%鐵氰化鉀,混勻,50 ℃恒溫20 min,快速冷卻,加入1 mL 10%二氯乙酸(TCA),混勻,取2.5 mL 混合液加2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1% FeCl3,混勻,靜置30 min,在700 nm 處測定吸光值,吸光值越大,說明色素樣品的還原能力越強。平行測定3次。

1.2.4 清除超氧陰離子自由基能力的測定 采用鄰苯三酚自氧化法[17],取4.5 mL的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.2)與4.2 mL去離子水混勻后在25 ℃水浴中保溫20 min,然后加入1 mL樣品溶液和0.4 mL的鄰苯三酚(3.0 mmol/L),混合后迅速搖勻,25 ℃水浴中保溫5 min。然后加入0.1 mL 18.75% HCl終止反應,在320 nm測定A。平行測定3次,計算清除率及IC50值。計算公式:

清除率(%)=(1-A/A0)×100

1.2.5 清除羥自由基能力的測定 參考相關文獻[18]方法并稍作修改。每支試管分別加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)1.2 mL、50 mmol/L 2-D-脫氧核糖、1 mmol/L Na2EDTA、50 mmol/L FeCl3、50 mmol/L H2O2、1.8 mmol/L抗壞血酸各0.15 mL,與0.5 mL不同濃度樣品溶液混合,50 ℃水浴20 min,加10%三氯乙酸 0.75 mL、0.5%硫代巴比妥酸0.45 mL,105 ℃加熱15 min后迅速冷卻至室溫。532 nm處測定吸光度值A。空白組不加2-D-脫氧核糖,對照組蒸餾水代替樣品,分別測定A空白和A對照。平行測定3次,計算清除率及IC50值。計算公式:

清除率(%)=[1-(A-A空白)/A對照]×100

1.2.6 清除過氧化氫能力的測定 參考相關文獻[19]方法并稍作修改。以0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH7.4),配制80 mmol/L的H2O2,以不加樣品溶液的H2O2溶液為對照,在230 nm處測定A對照,取2 mL不同濃度的樣品溶液與1.2 mL 80 mmol/L的H2O2混合均勻,室溫靜置10 min后,測定其在230 nm處的吸光值A,不加H2O2的樣品溶液作為A空白。每個樣品平行測定3次,計算清除率及半數抑制率IC50值。計算公式:

清除率(%)=[1-(A-A空白)/A對照]×100

1.2.7 清除DPPH自由基能力的測定 參考相關文獻[20]方法并稍作修改。用40%乙醇配成100 μg/mL樣品溶液,通過預試驗確定各樣品的最大加樣量:取50 μg/mL DPPH溶液2 mL,加入少量樣品液,加樣時,先少后多漸加,邊加邊混合,并觀察溶液的褪色情況,當溶液顏色基本褪去時,記下樣品的加樣量;取DPPH溶液2 mL加入試管中,加無水乙醇1 mL,充分混合,519 nm處測A0值;取DPPH溶液2 mL加入試管中,根據最大加樣量,各樣品分別選取6個加樣量,無水乙醇補足1 mL,混合,暗處靜置30 min后,519 nm測A值。平行測定3次,計算清除率及IC50值。計算公式:

清除率(%)=(1-A/A0)×100

1.2.8 清除ABTS自由基能力的測定 參考相關文獻[20]方法并稍作修改。將等體積比的7 mmol/L ABTS溶液與2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液混合均勻,放置黑暗處過夜反應,得到ABTS儲存液。將儲存液稀釋30～40倍,在734 nm檢測,使其吸光值達到0.700±0.002,成為ABTS工作液。取2.4 mL ABTS工作液與0.6 mL樣品溶液混合均勻,靜置6 min,在734 nm處測定吸光度值A;對照組95%乙醇代替樣品,測得吸光度值A0。平行測定3次,計算清除率及IC50值。計算公式:

清除率(%)=(1-A/A0)×100

1.3 數據分析

用Microsoft Excel 2010軟件進行數據處理,方差分析及IC50值的計算;用Origin 8.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 黑米與歐洲越橘色素提取物基本成分組成

黑米與歐洲越橘色素提取物的基本成分如表1所示,兩者的蛋白質、脂肪、總糖、水分、灰分以及花色苷含量均有顯著差異(p<0.05),兩種色素提取物主要由多糖及花色苷組成,其中黑米色素提取物花色苷含量為13.07%,歐洲越橘色素提取物花色苷含量為24.57%。

表1 黑米、歐洲越橘色素提取物基本成分組成(%)Table 1 Basic compositions of pigments from black rice,Europe bilberry(%)

2.2 黑米與歐洲越橘花色苷總還原能力比較

總還原能力的測定可以作為抗氧化活性的重要指標,不同質量濃度黑米與歐洲越橘花色苷的總還原能力結果如圖1所示。在10～35 μg/mL范圍內,歐洲越橘、黑米花色苷及抗壞血酸的總還原能力與濃度之間均呈現一定的量效關系,隨著濃度升高,其總還原能力顯著增加(p<0.05)。在濃度為35 μg/mL時,花色苷的總還原能力最強,黑米花色苷、歐洲越橘花色苷及抗壞血酸的吸光度值分別為1.13、0.56、0.31。綜上所述,表明總還原能力大小順序為黑米花色苷>歐洲越橘花色苷>抗壞血酸。劉榮等[21]研究了篤斯越橘花色苷總還原能力,實驗結果表明樣品與抗壞血酸的總還原能力在0～0.25 mg/mL范圍內呈正相關,與本實驗結果相似,但篤斯越橘花色苷總還原能力略低于抗壞血酸。

圖1 黑米花色苷、歐洲越橘與抗壞血酸的總還原能力Fig.1 Total reducing power of anthocyanins from black rice, Europe bilberry and ascorbic acid

2.3 黑米與歐洲越橘花色苷對超氧陰離子自由基清除能力比較

圖2 黑米花色苷、歐洲越橘與抗壞血酸的超氧陰離子自由基清除率Fig.2 Superoxide anion radical scavenging rate of anthocyanins from black rice, Europe bilberry and ascorbic acid

2.4 黑米與歐洲越橘花色苷對羥自由基清除能力比較

羥自由基具有極強的得電子能力,因此具有極強的氧化能力,抗氧化劑通過清除羥自由基抑制其氧化反應,從而表現其抗氧化能力。抗壞血酸對羥自由基的清除能力如圖3所示,當濃度為100～500 μg/mL時,其清除羥自由基的能力隨著濃度的升高而逐漸增大,根據清除率曲線計算抗壞血酸IC50值為0.52 mg/mL。黑米花色苷與歐洲越橘花色苷對羥自由基的清除能力如圖4所示,當濃度為20～100 μg/mL時,黑米花色苷和歐洲越橘花色苷清除羥自由基的能力與濃度存在一定的量效關系,即隨著濃度的升高而逐漸增大,根據清除率曲線計算黑米花色苷清除羥自由基的IC50為2.14 mg/mL,歐洲越橘花色苷IC50為1.02 mg/mL,經方差分析二者清除羥自由基能力無顯著性差異(p>0.05)。綜上所述,抗壞血酸清除羥自由基能力顯著高于歐洲越橘花色苷及黑米花色苷。雷月等[22]測定藍靛果花色苷粗制品和精制品清除羥自由基的IC50值分別為41.35±1.95、33.19±2.35 μg/mL,均高于抗壞血酸的IC50值7.1±0.55 μg/mL,表明其對羥自由基清除能力較抗壞血酸弱,與本實驗結果相似。

圖3 抗壞血酸的羥自由基清除率Fig.3 Hydroxyl radical scavenging rate of ascorbic acid

圖4 黑米和歐洲越橘花色苷的羥自由基清除率Fig.4 Hydroxylradical scavenging rate of anthocyanins from black rice and Europe bilberry

2.5 黑米與歐洲越橘花色苷對過氧化氫清除能力比較

抗壞血酸清除H2O2的能力如圖5所示,當濃度為40～140 μg/mL時,抗壞血酸清除H2O2的能力與其濃度成一定的量效關系,即隨著濃度的升高而逐漸增大,根據清除率曲線計算可得抗壞血酸的清除H2O2的IC50為72.44 μg/mL。歐洲越橘及黑米花色苷清除H2O2的能力如圖6所示,當濃度為2～12 μg/mL時,歐洲越橘及黑米花色苷清除H2O2的能力均隨著濃度的升高而逐漸增大,根據清除率曲線計算可得歐洲越橘和黑米花色苷的清除H2O2的IC50分別為5.01和2.82 μg/mL,經方差分析二者清除H2O2能力無顯著性差異(p>0.05),可見黑米花色苷與歐洲越橘花色苷清除H2O2的能力相當。表明H2O2清除能力大小順序依次為:黑米花色苷>歐洲越橘花色苷>抗壞血酸。劉榮等[21]對篤斯越橘花色苷清除H2O2清除能力的研究表明,樣品與抗壞血酸的對H2O2清除率同樣與質量濃度呈正相關,與本實驗結果相似,但濃度0.5 mg/mL時,篤斯越橘H2O2清除率低于抗壞血酸,分別為72.98%和93.73%。

圖5 抗壞血酸的H2O2清除率Fig.5 H2O2 scavenging rate of ascorbic acid

2.6 黑米與歐洲越橘花色苷對DPPH自由基清除能力比較

如圖7所示,在各測試濃度范圍內,抗壞血酸、歐洲越橘花色苷和黑米花色苷清除DPPH自由基的能力均隨著濃度的增加逐漸增大,之后趨于穩定,根據清除率曲線計算可以得到清除抗壞血酸、歐洲越橘花色苷和黑米花色苷DPPH自由基的IC50分別為2.66、2.58和0.88 μg/mL,因此清除DPPH自由基的能力大小順序依次為:黑米花色苷>歐洲越橘花色苷≈抗壞血酸,可見黑米花色苷對DPPH自由基清除效果顯著優于抗壞血酸和歐洲越橘。郝杰[23]研究表明黑米花色苷提取物DPPH清除活性在0～200 μg/mL濃度范圍內隨著提取物濃度的增加而顯著增強,但其IC50為53.51±0.87 μg/mL與抗壞血酸的45.60±0.31 μg/mL相近。劉榮等[21]對篤斯越橘花色苷清除DPPH自由基的研究表明,樣品與抗壞血酸的對DPPH自由基清除率同樣與質量濃度呈正相關,濃度0.10 mg/mL時,二者DPPH自由基清除率相近,分別為82.80和75.13%。同樣,陸卿卿[24]從藍莓中提取的花色苷對DPPH自由基的清除率隨著濃度的增加而增強,其對DPPH自由基的IC50為43.81 μg/mL,抗壞血酸的IC50為42.08 μg/mL,二者對DPPH自由基的清除率相近,均與本實驗結果相似。

圖7 黑米花色苷、歐洲越橘與抗壞血酸的DPPH自由基清除率Fig.7 DPPH radical scavenging rate of anthocyanins from black rice,Europe bilberry and ascorbic acid

2.7 黑米與歐洲越橘花色苷對ABTS+·清除能力比較

歐洲越橘花色苷與抗壞血酸、黑米花色苷的ABTS自由基清除率如圖8～圖9所示,歐洲越橘花色苷清除ABTS自由基的能力顯著高于陽性對照抗壞血酸,根據清除率曲線計算可得清除ABTS+·的IC50分別為:黑米花色苷0.75 μg/mL;歐洲越橘花色苷1.95 μg/mL;抗壞血酸6.92 μg/mL。故清除ABTS+·的能力大小順序依次為:黑米花色苷>歐洲越橘花色苷>抗壞血酸。郝杰[23]的實驗結果顯示，黑米花色苷提取物在0～50 μg/mL濃度范圍內隨著提取物濃度的增加,其ABTS+·清除活性顯著增強,但與抗壞血酸的ABTS+·清除活性相近,IC50分別為(13.09±0.11)和(12.83±0.03) μg/mL。這可能與黑米品種不同有關，也可能與黑米花色苷提取物的純度及含量有關。

圖8 歐洲越橘花色苷和抗壞血酸的ABTS自由基清除率Fig.8 ABTS radical scavenging rate of anthocyanins from black rice and ascorbic acid

圖9 黑米花色苷的ABTS自由基清除率Fig.9 ABTS radical scavenging rate of anthocyanins from Europe bilberry

3 結論與討論

黑米花色苷具有很好的抗氧化性,在一定質量濃度范圍內,清除自由基的能力與其質量濃度呈正相關性,其抗氧化能力隨濃度的增大而升高。黑米花色苷清除DPPH·、過氧化氫、ABTS+·及總還原能力顯著(p<0.05)高于市售的歐洲越橘花色苷和陽性對照抗壞血酸,其清除DPPH自由基的IC50值為0.88 μg/mL,清除H2O2的IC50值為2.82 mg/mL,清除ABTS+·的IC50值為0.75 μg/mL。兩種花色苷清除羥自由基及超氧陰離子自由基的能力均低于陽性對照,但黑米花色苷素清除超氧陰離子自由基能力高于歐洲越橘花色苷,清除羥自由基能力與歐洲越橘花色苷相當,這可能由于歐洲越橘花色苷與黑米花色苷的組成成分不同所致,寶麗[25]分析歐洲越橘花色苷提取物中15種花色苷類成分,其中飛燕草花色苷占15.24%,矢車菊花色苷占11.4%,夏效東等[26]研究表明黑米提取物中主要含矢車菊花色苷和芍藥花色苷,分別為25.7%和1.7%。因此下一步需要根據黑米與歐洲越橘花色苷的組成成分及含量,進一步闡明其抗氧化性的差異及作用機制。