樺褐孔菌多糖的乙酰化修飾及其抗氧化活性

邵珠領,吳艷麗,張 宇,*,王宇亮,趙 宏,趙芷萌

(1.黑龍江省新藥創制與藥效毒理評價重點實驗室,佳木斯大學藥學院,黑龍江佳木斯 154007; 2.生命科學與環境科學研究中心,哈爾濱商業大學,黑龍江哈爾濱 150070)

樺褐孔菌Inonotusobliquus(Fr.)Pilat屬擔子菌亞門層菌綱銹革孔菌目銹革菌科褐臥孔菌屬[1]。樺褐孔菌主要分布在北半球北緯 40～50°的地區,如北美(北部)、芬蘭、波蘭、俄羅斯(西西伯利亞、遠東部分地區、堪察加半島)、日本北海道等國家和地區[2]。我國樺褐孔菌主要分布在吉林長白山地區、黑龍江大小興安嶺以及內蒙古等地[3]。樺褐孔菌具有降血糖、降血脂、免疫調節、抗腫瘤、抗輻射、抗氧化、抗寄生蟲等多種藥理活性,而其大部分生物活性與其中的多糖成分密切相關[4]。

多糖結構的化學修飾主要是利用多糖分子中的羥基、羧基、氨基等活性基團進行化學反應以引入新的基團,如硫酸基、磷酸基、羧甲基、烷基等[5]。多糖的乙酰化是一種重要的多糖修飾方法。乙酰基的引入使分子的伸展狀態發生變化,導致多糖極性基團暴露,增加了多糖在水中的溶解性,同時乙酰基的數量和位置對多糖活性也有顯著影響[6]。真菌多糖的生物活性與其結構密切相關,經化學修飾后,可能會提高多糖抗氧化、降血糖等作用[7-8]。楊春瑜等研究發現,對黑木耳多糖進行乙酰化修飾后,其抗氧化活性增加[9]。李淑琴等研究表明,乙酰化烏龍茶多糖溶解性增強,還原活性顯著提高[10]。目前的文獻對研究樺褐孔菌多糖的研究主要集中在提取分離等方面[11-12],關于其乙酰化修飾及其修飾后活性的研究還未見報道。

因此,本文以乙酸酐作為酰化試劑，對提取純化后的樺褐孔菌多糖進行乙酰化修飾，并評價其抗氧化活性,為樺褐孔菌多糖抗氧化活性的構效關系研究和資源開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樺褐孔菌 購自黑龍江省佳木斯市亮子河山特產店；苯酚、氫氧化鈉、濃鹽酸、鹽酸羥胺、三氯化鐵、無水乙酸鈉、三氯甲烷、正丁醇、濃硫酸、乙酸酐、無水乙醇 均為國產分析純;葡萄糖、氯化乙酰膽堿 購自阿拉丁生化科技股份有限公司;透析袋Mw3000 購自源葉生物科技有限公司。

FDU-1200冷凍干燥機 日本東京理化;RE-2000A旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠;DL-5-B 低速多管離心機 上海安亭科學儀器廠;765紫外可見分光光度計 上海儀電科學儀器股份有限公司;DBS100 自動餾分收集器 上海嘉鵬科技有限公司;Vortex-1/2 渦旋混合器 上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樺褐孔菌多糖的提取 樺褐孔菌菌體粉碎后過80目篩,25 ℃條件下用95%乙醇浸泡1 d,減壓過濾,濾餅(半徑:7 cm,高:3 cm)50 ℃烘干24 h后備用。

取一定量烘干后的樺褐孔菌濾餅加入5倍體積的雙蒸水95 ℃浸提3 h[11],過八層紗布保留濾液,濾渣重復提取一次,合并濾液,減壓濃縮。濃縮液加入一定量的乙醇,使乙醇濃度達到80%,充分攪拌后放入4 ℃冰箱中醇沉12 h。25 ℃,4000 r/min離心10 min,收集沉淀,依次用無水乙醇、丙酮、乙醚各洗滌沉淀3次,130 Pa 45 ℃真空干燥12 h后得到樺褐孔菌粗多糖。按照以下公式來計算樺褐孔菌多糖的得率。

1.2.2 樺褐孔菌多糖的純化 取真空干燥后的樺褐孔菌粗多糖適量,使用雙蒸水配制成10%多糖溶液,按體積比1∶4加入Sevag試劑,充分振蕩30 min后靜置4 h。4000 r/min 25 ℃離心15 min,棄去下層蛋白,重復上述操作,紫外掃描檢測,直至樺褐孔菌多糖溶液在260和280 nm波長處無明顯紫外吸收,表示溶液中游離蛋白質類雜質已除盡。將脫蛋白后的多糖溶液55 ℃條件下減壓濃縮至原溶液1/3后冷凍干燥,得到樺褐孔菌粗多糖。

取5 g脫蛋白的樺褐孔菌粗多糖溶于10 mL雙蒸水中,4000 r/min 25 ℃離心15 min后,取上清液在已準備好的AB-8大孔樹脂柱上進行上樣。吸附24 h后用雙蒸水進行洗脫,自動餾分收集器收集洗脫液,采用苯酚-硫酸法在490 nm波長(紫外可見分光光度計)隔管檢測吸光度,合并洗脫液。洗脫液55 ℃條件下減壓濃縮至原溶液1/3后透析(44 mm),冷凍干燥得到純化后的樺褐孔菌純化多糖。純化后的樺褐孔菌多糖以D-葡萄糖為標準品,采用苯酚-硫酸法測定其總糖含量。

1.2.3 樺褐孔菌多糖的乙酰化修飾 取0.5 g樺褐孔菌純化多糖溶于10 mL三蒸水中,用3%的氫氧化鈉調節溶液pH至11.0。30 ℃油浴下,分別交替加入氫氧化鈉溶液和乙酸酐各1 mL,控制反應溶液pH在7.0～11.0,直至加完乙酸酐。30 ℃條件下維持攪拌3 h(pH=8)。反應結束后,用1 mol/L鹽酸中和反應溶液(pH=7),將反應液置于自來水中透析48 h,三蒸水中透析24 h。將透析液減壓濃縮,冷凍干燥后得到乙酰化樺褐孔菌多糖[13]。另取兩份相同量的樺褐孔菌純化多糖,加入乙酸酐的量分別為2、3 mL,其余實驗條件不變。

1.2.4 傅里葉紅外光譜分析 取純化樺褐孔菌多糖與加入1 mL乙酸酐乙酰化后得到的樺褐孔菌多糖各2 mg,采用溴化鉀壓片法,使用傅里葉紅外光譜儀在400～4000 cm-1范圍內進行光譜掃描。

1.2.5 乙酰基取代度的測定

1.2.5.1 標準曲線的繪制 用0.001 mol/L醋酸鈉溶液將氯化乙酰膽堿標準品配制成濃度為1.064 mg/mL的溶液。精密移取氯化乙酰膽堿標準溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL置于試管中,加水至1 mL,加入2 mL堿性羥胺溶液,渦旋混合器混合均勻,于25 ℃放置4 min,加入1 mL 4 mol/L鹽酸(pH為1.2±0.2),加入1 mL 0.37 mol/L三氯化鐵-鹽酸溶液,搖勻后在540 nm波長測定其吸光度。同步做上述各個標準系列溶液的空白對照,先加入鹽酸后加入堿性羥胺,其余步驟與上述相同。

1.2.5.2 取代度測定 取樺褐孔菌多糖乙酰化溶液1 mL按照標準溶液的操作方法進行測定。根據標準曲線得到乙酰化樺褐孔菌多糖的乙酰基質量M1,按照以下公式計算出三個不同取代度的乙酰化樺褐孔菌多糖的取代度[14]。

乙酰基百分含量(W,%)=M1/M2×100

式中：M1-乙酰化樺褐孔菌多糖中乙酰基的質量(mg);M2-乙酰化樺褐孔菌多糖的質量(mg);162-葡萄糖相對分子質量;43-乙酰基相對分子質量;1-氫原子相對原子質量。

1.2.6 體外抗氧化活性研究

1.2.6.1 DPPH自由基清除率的測定 取3種不同取代度,不同濃度的樺褐孔菌乙酰化多糖及純化后樺褐孔菌多糖樣品溶液3 mL,加入新鮮配制的DPPH-乙醇溶液1 mL,渦旋混合器混合10秒,25 ℃水浴避光反應30 min,在517 nm處測定吸光度;以VC為陽性對照,同時測定空白組(樣品不加DPPH)和陽性對照組樣品吸光度。按如下公式計算對DPPH自由基清除率。

DPPH·清除率(%)=1-(A1-A2)/A0)×100

式中:A0-無樣品溶液吸光度值；A1-樣品溶液的吸光度值;A2-無DPPH樣品溶液的吸光度值。

式中:A0-Tris-HCI溶液吸光值;A1-不加樣品的Tris-HCI和鄰苯三酚溶液的吸光度;A2-樣品溶液的吸光度。

1.2.6.3 羥基自由基清除率的測定 在試管中依次加入不同濃度、不同取代度的三種乙酰化樺褐孔菌多糖及樺褐孔菌多糖樣品溶液1 mL、0.75 mmol/L鄰菲羅啉溶液1 mL、0.75 mmol/L硫酸亞鐵1 mL、0.01%雙氧水1 mL、0.15 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)1.5 mL混勻,室溫靜置10 min,37 ℃加熱1 h,在536 nm波長處測吸光度。蒸餾水和VC分別作為空白對照和陽性對照,按以下公式來計算羥自由基(·OH)的清除率(%)。

·OH清除率(%)=(A1-A0)/(A2-A0)×100

式中:A0-空白組樣品溶液吸光值;A1-樣品溶液吸光度值;A2-對照品溶液的吸光度(雙氧水和樣品溶液用蒸餾水來代替)。

1.3 數據分析

以上實驗均平行進行3次,所得數據經SPSS 19.0 處理,使用Duncan’s檢驗分析顯著性,p<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 樺褐孔菌多糖的制備及純化

脫蛋白后的樺褐孔菌多糖使用蒸餾水配制成1 mg/mL溶液,紫外掃描后結果如圖1所示,在260和280 nm處無明顯紫外吸收,表明脫蛋白后的樺褐孔菌多糖已基本除去蛋白類雜質。考馬斯亮藍法測定脫蛋白后的樺褐孔菌多糖的蛋白含量為3.24%±1.23%。因為已經使用Sevag法除去蛋白類物質,檢測到的可能是與多糖結合的蛋白類雜質。醇沉后的樺褐孔菌多糖,經真空冷凍干燥后,計算樺褐孔菌粗多糖提取率為13.2%。經AB-8純化的洗脫曲線(圖2),收集Fr.1部分,減壓濃縮、冷凍干燥后得樺褐孔菌純化多糖。

圖1 樺褐孔菌多糖純化處理后紫外掃描圖譜Fig.1 The ultraviolet spectra of Inonotus obliquuspolysaccharides solution after purification

圖2 樺褐孔菌多糖經AB-8純化洗脫曲線Fig.2 Purification and elution curve of Inonotus obliquus polysaccharides by AB-8

2.2 樺褐孔菌多糖與乙酰化樺褐孔菌多糖的紅外光譜分析結果

如圖3所示,與樺褐孔菌多糖的IR圖譜相比,乙酰化樺褐孔菌多糖在1713.66 cm-1波長處出現C=O雙鍵伸縮振動峰,1230.41 cm-1波長處有酯基的C-O的伸縮振動,這表明樣品的乙酰化是成功的[15]。乙酰化多糖在3400.00 cm-1左右的-OH吸收有所減弱,推測可能是因為部分糖鏈在修飾的過程中被水解。

圖3 樺褐孔菌多糖(A)與乙酰化樺褐孔菌多糖(B)的紅外譜圖Fig.3 IR spectrum of Inonotus obliquus polysaccharides and acetylated Inonotus obolquus polysaccharides

2.3 乙酰化樺褐孔菌多糖取代度測定結果

氯化乙酰膽堿標準品乙酰基濃度與其吸光度標準曲線見圖4。樺褐孔菌乙酰化修飾的乙酰基含量與取代度如表1所示,純化后樺褐孔菌多糖中總糖含量為82.1%,不含乙酰基,經乙酰化修飾后,隨著乙酰化試劑體積的增加,總糖含量減少,乙酰基含量增加,取代度也逐步提高。加入乙酸酐體積1、2、3 mL時,乙酰基含量分別為15.43、17.22、22.36 μg/mL;取代度分別為0.2810、0.3136、0.4072。

圖4 氯化乙酰膽堿標準曲線Fig.4 The standard curve of acetylcholine chloride

表1 樺褐孔菌多糖乙酰化修飾的乙酰基含量與取代度Table 1 Acetyl content and substitution degree of acetylated modification of Inonotus obliquus polysaccharides

2.4 乙酰化修飾對樺褐孔菌多糖體外抗氧化活性的影響

2.4.1 DPPH自由基清除率變化 如圖5所示,修飾后的樺褐孔菌多糖DPPH自由基清除率均隨多糖質量濃度增加而增加,并且呈一定的劑量依賴關系。隨著樣品質量濃度的增加,可以觀察到樺褐孔菌多糖和乙酰化樺褐孔菌多糖的清除率隨著樣品質量濃度的增加而增大。并且在質量濃度為5 mg/mL時,3種乙酰化程度不同的樺褐孔菌多糖DPPH清除率分別為71.5%、74.3%、75.4%,取代度越大,清除作用越強,顯著高于樺褐孔菌多糖的清除率60.1%(p<0.05)。說明乙酰化修飾可以增強樺褐孔菌多糖清除DPPH自由基的能力。

圖5 乙酰化樺褐孔菌多糖對DPPH自由基的清除作用Fig.5 DPPH radical scavenging activities of acetylated polysaccharide Ac-IOP注:VC:維生素C;IOP:樺褐孔菌多糖;Ac1-IOP:乙酰化樺褐孔菌多糖1;Ac2-IOP:乙酰化樺褐孔菌多糖2;Ac3-IOP:乙酰化樺褐孔菌多糖3；乙酰化樺褐孔菌多糖1～3的取代度分別為0.2810、0.3136、0.4072；圖6～圖7同。

2.4.2 超氧陰離子清除率變化 由圖6可知,在所選的濃度范圍內,樺褐孔菌多糖與乙酰化樺褐孔菌多糖對超氧陰離子的清除作用均隨著樣品質量濃度的增加而增強。不同取代度的乙酰化樺褐孔菌多糖在質量濃度為5 mg/mL時,分別達到的最大清除率為71.8%、74.9%、78.5%。隨著取代度的增加,清除作用也隨之增強。而樺褐孔菌多糖的最大清除率為61.8%。這表明,對樺褐孔菌多糖進行乙酰化修飾能顯著提高其對超氧陰離子的清除作用(p<0.05)。

圖6 乙酰化樺褐孔菌多糖對超氧陰離子自由基的清除作用 radical scavenging activities of acetylated polysaccharide Ac-IOP

2.4.3 羥基自由基清除率變化 圖7結果表明,在0.5～5 mg/mL濃度范圍內,隨著多糖質量濃度的增加,樺褐孔菌多糖與乙酰化樺褐孔菌多糖對羥基自由基的清除作用增強,樺褐孔菌多糖與不同取代度的乙酰化樺褐孔菌多糖的最大清除率分別為61.5%和74.5%、79.9%、81.1%。說明羥基自由基清除率隨著取代度的增加而增強。這表明對樺褐孔菌進行乙酰化修飾能夠顯著提高其羥基自由基清除能力(p<0.05)。

圖7 乙酰化樺褐孔菌多糖對羥基自由基的清除作用Fig.7 ·OH- radical scavenging activities of acetylated polysaccharide Ac-IOP

乙酰化修飾是常用的一種分子修飾方法,結構修飾逐漸成為多糖構效關系的研究熱點,乙酰化修飾可以改變多糖分子的定向性和橫向次序,從而改變糖鏈的空間排布,改善其活性[16-17]。大量研究表明,乙酰化修飾可以增強多糖的抗凝血、抗腫瘤、免疫調節及抗氧化活性[18-19]。許多多糖在體外本身具有一定的抗氧化活性,經乙酰化修飾后的多糖其清除自由基的能力均有所增加,且還原能力也比原多糖有所提高[20]。實驗表明,隨著乙酰化程度的提高,乙酰化樺褐孔菌多糖的抗氧化活性均有所增強。Yang等人對龍眼果實的果皮中的多糖進行乙酰化修飾研究,發現其抗氧化活性與乙酰基取代度有關[21]。這與本次的實驗結果是一致的。乙酰化樺褐孔菌多糖的抗氧化活性增強,可能是由于引入乙酰基后,使多糖支鏈得到伸展,導致多糖羥基暴露,向外伸展,從而有利于捕捉自由基，提高其抗氧化活性[22]。

3 結論

本實驗在氫氧化鈉的均相體系中,以不同體積的乙酸酐為酰化試劑對樺褐孔菌進行乙酰化修飾,調整反應液的pH在一定的范圍內,獲得3個取代度分別為0.2810、0.3136、0.4072的乙酰化樺褐孔菌多糖。進一步進行體外抗氧化實驗表明，經乙酰化修飾后的樺褐孔菌多糖對DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥基自由基的清除率相對樺褐孔菌多糖都有一定的提高。乙酰化樺褐孔菌多糖的抗氧化活性與乙酰基取代度有關。本研究為樺褐孔菌多糖構效關系研究提供了新的研究方向,為樺褐孔菌的化學修飾提供了重要的參考。