潔凈環境產芽孢桿菌的鑒定及其耐藥性

張苗苗,柴海毅,費國琴,寧喜斌,3,4,5,*

(1.上海海洋大學食品學院,上海 201306; 2.上海諾狄生物科技有限公司,上海 201612; 3.上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心,上海 201306; 4.國家淡水水產品加工技術研發中心(上海),上海 201306; 5.上海海洋大學食品科學與工程國家級實驗教學示范中心,上海 201306)

潔凈室及相關受控環境需要保證空氣中懸浮粒子被控制在合適的級別,以確保完成對污染敏感的有關活動。細菌可能污染工業食品生產潔凈室或制藥潔凈室環境,需要采取有效措施加以控制,以盡量避免對人體的健康危害以及造成的經濟損失[1],因此為達到潔凈室環境標準要求,在潔凈室構建和配備標準化后,持續監測潔凈室微生物的存在狀態十分必要。1881年Koch將固體培養基表面暴露在空氣中一定時間,然后在一定的條件下培養,通過對培養基上可培養的菌落計數[2],引入了空氣采樣的沉降菌檢測方法,現在是GMP標準中用于進行監測控制A級環境的方法之一。近年來對潔凈環境空氣微生物的來源、粒子特征、主要類型、濃度的時空變化及其群落結構的研究也得到越來越多的關注。隨著我國GMP制度的發展,不僅僅是對藥品,對食品生產環境中的控制要求也越來越嚴格。研究發現產芽孢桿菌是潔凈環境污染的重要原因之一[3]。由于芽孢具有厚而含水量低的多層結構,所以折光性強、對染料不易著色,芽孢對熱、干燥、輻射、化學消毒劑和其他理化因素有較強的抵抗力[4-5],所以,產芽孢桿菌在潔凈環境中定殖,將會對潔凈環境安全性造成威脅。

潔凈環境中殺菌可能不充分,Simmons等[6]對美國23家醫院在手動清潔后進行了脈沖氙氣紫外線燈(PX-UV)消毒,通過微生物學驗證,結果顯示手動清洗后的每平板CFU范圍為5.8～34.37,PX-UV消毒后的每平板CFU范圍為0.69～6.43,環境中微生物數量顯著降低,但沒有對PX-UV消毒后的環境中微生物進行鑒定,未能了解污染環境中的微生物類群。呂洪浩等[7]對部分潔凈室沉降菌檢測,發現一般潔凈空氣中以細菌為主,有少量真菌及放線菌,也沒有對相應的微生物控制進一步開展研究。目前對潔凈環境的研究主要是如何檢測環境內微生物數量,判斷是否達到安全標準,但對于微生物的鑒定研究較少[8-10],并且沒有對潔凈環境中,抗逆性較強的微生物控制提出合理的解決方法。本實驗將進行分離純化,對受在控潔凈環境空氣中獲得的沉降菌的芽孢桿菌的特征進行研究,并通過16S rDNA進行同源性比較,探究污染環境的主要芽孢桿菌種類,并用K-B法測其對20種抗生素的耐受性,以期為潔凈環境中芽孢桿菌的安全風險控制提供參考數據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

62株潔凈環境分離菌株 諾狄公司分離自藥廠;胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)、細菌生化鑒定試劑 青島海博生物技術有限公司;TSA無菌預罐裝成品培養基平板(沉降碟)((90 mm) 上海諾狄生物科技有限公司;革蘭氏染色液試劑盒 北京陸橋技術股份有限公司;藥敏試紙片 杭州微生物試劑有限公司;DNA提取試劑盒 天根生化科技(北京)有限公司;孔雀石綠、PCR引物、TAE緩沖液、EB染液等 生工(上海)有限公司。

THZ-300恒溫培養搖床、THZ-300隔水式培養箱9270 上海一恒科技有限公司;ClassⅡBSC生物安全柜 ESCO公司;JA1003電子天平 常州市宏恒電子儀器廠;TGL-16G高速臺式離心機 上海安亭科學儀器廠;PTC-200PCR儀、GelDocXR凝膠成像儀 Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 沉降菌檢測 根據國標醫藥工業潔凈室(區)沉降菌的測試方法(GB/T 16294-2010),對受控環境(細胞房及生物安全柜)和非受控環境(教室、宿舍等)沉降菌進行檢測。根據標準規定,測試前對沉降碟包裝、沉降碟表面進行嚴格消毒,按采樣點布置圖[11]逐個放置,然后由里向外逐個打開沉降碟,使培養基表面暴露在空氣中,暴露時間為4 h。在32 ℃培養箱中培養48 h,進行菌落計數。

1.2.2 菌落菌體形態觀察 挑取沉降碟上微生物在TSA培養基四區劃線進行分離純化,32 ℃培養48 h,觀察菌落、菌體(革蘭氏染色)形態,采用Schaeffer-Fulton氏染色法染色[12],觀察是否有芽孢。

1.2.3 生理生化鑒定 用細菌微量生化鑒定管對產芽孢菌株進行鑒定,包括過氧化氫酶試驗、動力試驗、產酸產氣、V-P 試驗、水解、檸檬酸鹽、卵黃卵磷脂酶、溶菌酶耐性試驗、吲哚試驗,實驗原理及結果參考伯杰氏常見細菌系統鑒定手冊[13]和常見細菌系統鑒定手冊[14]。

1.2.4 16S rDNA基因序列 將產芽孢菌株用TSB液體培養基36 ℃培養12 h,按照細菌總DNA提取試劑盒說明書步驟操作,提取細菌總DNA,即為模板DNA。擴增16S rDNA基因所用引物為細菌16S rDNA通用引物27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。

PCR反應體系(50 μL)包括:2×Taq PCR Mix 25 μL,10 μmol/L的上下游引物各2 μL,模板DNA 1 μL,用20 μL的無菌ddH2O調整為最終反應體系。

PCR反應條件:94 ℃預變性2 min;94 ℃變性1 min,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,共35個循環。通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結果,觀察是否有清晰明亮的條帶,使用瓊脂糖凝膠回收法純化PCR產物后,送交上海生工生物技術工程有限公司進行基因測序。

1.2.5 系統發育樹的構建 將菌株的16S rDNA基因序列在GenBank中進行Blast比對,選擇同源性高于90%的相關菌株的核酸序列,在LPSN下載其16S rDNA基因序列并通過Mega 5.2完成序列比對后,采用鄰接法構建系統發育樹。

1.2.6 產芽孢桿菌耐藥性檢測 將純化后的待測產芽孢桿菌接種于TSB中,32 ℃、120 r/min培養18 h。將菌液8000 r/min,離心2 min后棄去上清液,取種子液調節OD600使得其接種量為1.5×108CFU/mL,用棉拭子吸取菌液,在TSA培養基表面進行涂布,待培養基表面菌液完全晾干后貼上抗生素紙片(抗生素種類如表1),置于32 ℃培養箱中培養48 h,觀察并記錄試驗結果。根據美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)標準[15],測量抑菌圈的直徑,判斷產芽孢桿菌對該抗生素是否具有耐藥性。

表1 實驗所用藥敏紙片Table 1 Drug sensitive paper used in the experiment

2 結果與分析

2.1 不同環境沉降菌的比較

為了了解環境中沉降菌的狀況,本研究選取了上海海洋大學不同潔凈環境進行試驗,結果如表2。

由表2可知,同等受控環境菌落數相似,非受控環境中沉降菌菌落數為22.4～32.4 CFU/平板,檢測結果與環境中人的數量、氣候以及檢驗人員是否受過專業培訓有較大的關系。

表2 不同環境4 h沉降菌數量Table 2 Number of settled bacteria in different environments for 4 h

沉降碟在暴露4 h后,32 ℃培養箱中培養48 h,明顯發現受控度越高,環境中微生物數量越少;不同環境中沉降菌種類亦有較大的差異。非受控環境,菌落數量多,種類復雜,且菌絲蔓延生長,對菌落計數、觀察菌落形態和分離出單菌落都有一定的影響;受控環境沉降碟中微生物數量對比非受控環境明顯減少,可以觀察到明顯的單菌落,存在真菌;高受控環境沉降碟上菌落極少,甚至沒有,呈典型的細菌菌落形態。

2.2 潔凈環境分離菌形態觀察

為實驗研究更具有代表性,除12株(編號S-)分離自上海海洋大學細胞房和生物安全柜受控環境菌株外,實驗還采用62株(編號N-)實驗室保存的來自藥廠潔凈環境的菌株(由上海諾狄生物科技公司分離自藥廠)。在純化培養時,大部分細菌出現明顯的單菌落,但是有部分細菌呈根狀生長,或菌落較大,無法觀察到菌落形態。通過菌落形態和革蘭氏染色結果,將細菌分為5組,米白色和黃色細菌較多,大多數細菌的邊緣整齊,結果如表3所示,根據菌落、菌體形態,產芽孢桿菌主要在第3組和第4組。

表3 可培養細菌的表型特征Table 3 Phenotypic characteristics of culturable bacteria

2.3 生理生化鑒定

對革蘭氏陽性球菌進行兔血漿凝固酶實驗,芽孢桿菌主要是革蘭氏陽性桿菌,對第3組、第4組進行芽孢染色,分離出產芽孢桿菌,所得結果如表4所示。

表4 分離出的沉降菌分布構成Table 4 Separation of sedimentation bacteria distribution

通過74株菌革蘭氏染色結果發現,革蘭氏陽性菌占90.54%,共檢出23株革蘭氏陽性桿菌,對其進行芽孢染色,發現有14株產芽孢,占所有細菌的18.92%,占革蘭氏陽性陽性桿菌60.87%,說明產芽孢桿菌在潔凈環境中作為重要的污染菌存在。

對14株產芽孢細菌進行過氧化氫酶試驗、動力試驗、產酸產氣、V-P試驗、水解、檸檬酸鹽、卵黃卵磷脂酶、溶菌酶耐性試驗、吲哚試驗,其生理生化特性如表5所示。

通過表5發現,分離出菌株生理生化鑒定結果基本滿足芽孢桿菌生物學特征,為16S rDNA測序結果提供驗證。

表5 14株芽孢桿菌生理生化鑒定Table 5 Physiological and biochemical identification of 14 strains of Bacillus

2.4 16S rDNA鑒定結果

PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后結果,得到清晰明亮的單一條帶,且編碼基因大小相近,大約為1200 bp。因此可以初步判定該條帶即為目的基因片段。將純化得到的基因片段送至生工生物工程(上海)有限公司進行測序。

由表6可知,14株產芽孢桿菌分為兩個屬,鑒別出5個不同種,有12株菌屬于芽孢桿菌屬,N-132、N-133為枯草芽孢桿菌;N-16、N-19為蠟樣芽孢桿菌;N-116為巨大芽孢桿菌,N-17蘇云金芽孢桿菌。N-015、N-018兩株屬于類芽孢桿菌屬,為解葡聚糖類芽孢桿菌,潔凈環境產芽孢菌株存在多樣性。

表6 16S rDNA鑒定結果Table 6 16S rDNA identification results

由圖3系統發育樹可知,N-015、N-018屬于同一分支,是類芽孢桿菌屬;S-13、S-20、N-06、N-016、N-11、N-16、N-17、N-19、N-115、N-116、N-132、N-133聚集于系統發育同一分支,其中,S-20、N-11、N-132、N-133、N-016同源性較近,N-16、N-17、N-19、N-115、N-06同源性較近。N-116與Bacillusmegateriumstrain SCSIO 43708,S-13與BacillussolaniDSS-STR-5同源性為100%,判斷N-116與Bacillusmegateriumstrain SCSIO 43708屬于同一種,S-13與BacillussolaniDSS-STR-5屬于同一種。

圖3 以潔凈環境產芽孢桿菌16S rDNA基因序列構建的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree constructed with the spore-forming strains based on 16S rDNA gene sequence

2.5 耐藥性研究

14株產芽孢桿菌耐藥性如表7所示,不同來源的分離菌株對20種常見的抗生素呈現出不同程度的耐藥性,其中,僅菌株N-016不存在耐藥性;潔凈環境分離的14株芽孢桿菌的耐藥率為92.86%。N-06、N-018、N-19、N-133對3類或3類以上抗菌藥物同時呈現耐藥的細菌多重耐藥率為21.4%。

表7 14株產芽孢桿菌耐藥性檢測Table 7 Detection of drug resistance of 14 strains of Bacillus

由表7分析,14株芽孢桿菌主要對青霉素類和頭孢菌素類抗生素產生耐藥性,青霉素類和頭孢菌素類抗生素同屬于β-內酰胺類抗生素,在這14株產芽孢桿菌中,其中12株對青霉素不敏感,對青霉素耐藥率達85.71%。

3 結論

本實驗通過對74株不同受控潔凈環境(藥廠、超凈臺、細胞房)沉降菌檢測,經過革蘭氏染色發現革蘭氏陽性菌占90.54%,共檢出23株革蘭氏陽性桿菌,有14株產芽孢,占所有細菌的18.92%,2株為類芽孢桿菌屬,12株為芽孢桿菌屬,為枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌;潔凈環境空氣來源的芽孢桿菌分離菌株92.86%具有耐藥性,其中部分菌株表現出多重耐藥性。

研究表明,潔凈環境受產芽孢桿菌污染風險性較高,且潔凈環境中產芽孢桿菌菌株存在多樣性,同時發現其對β-內酰胺類抗生素具有較高的耐藥性。實驗結果為潔凈環境中產芽孢菌株污染風險控制提供參考。