雨生紅球藻和小球藻間的原生質體融合與糖異養融合子篩選

徐曉瑩,史文凱,袁冠華,張文蕾,張 維，*,崔玉琳,劉天中

(1.中國科學院青島生物能源與過程研究所,山東省能源生物遺傳資源重點實驗室,山東青島 266101; 2.中國科學院大學,北京 100049; 3.煙臺市水產研究所,山東煙臺 264003; 4.中國科學院海岸帶研究所,海岸帶生物學與生物資源利用所重點實驗室,山東煙臺 264003)

天然蝦青素是世界上最強的天然抗氧化劑[1],廣泛應用于醫藥健康、水產養殖等行業。雨生紅球藻是生產天然蝦青素的最好生物材料,其含量可達干重的2.0%～5.0%,為自然界中蝦青素含量最高的生物[2-4]。目前,雨生紅球藻已實現規模化的養殖與蝦青素的商業化生產,市場規模已達六億美元,并正在以每年10%的速度快速增長。然而長期以來,雨生紅球藻的養殖一直依賴于光合自養,生產受到地理、天氣等自然環境條件的限制,同時由于雨生紅球藻本身的特性,其生長極其緩慢,遠不及小球藻、螺旋藻等經濟微藻[5-6],因而目前規模化養殖效率不高。

除自養生長外,雨生紅球藻也可以進行異養生長。乙酸(鹽)是目前雨生紅球藻已知的唯一能夠有效利用的底物[7-10]。Hata等[11]和Wan等[12]均將乙酸鹽異養發酵引入雨生紅球藻的細胞培養過程,蝦青素產率分別可達4.4和6.4 mg/L/d,但乙酸鹽對藻細胞生長有明顯的底物抑制,因此要建立基于乙酸鹽的雨生紅球藻異養發酵,必須嚴格控制培養過程中乙酸鹽底物的濃度。在大多數微生物發酵中,葡萄糖是原料最為豐富、應用最廣的有機碳底物。如果雨生紅球藻能夠利用葡萄糖底物進行高密度異養發酵,無疑將大大解決天然蝦青素生產的穩定性、規模化和成本問題,促進天然蝦青素產業的發展。因此向雨生紅球藻中引入葡萄糖代謝途徑以獲得可利用葡萄糖的異養株,成為目前雨生紅球藻技術研發的熱點。

Zaslavskaia等[13]通過向三角褐指藻中引入功能的葡萄糖轉運蛋白基因,成功使三角褐指藻獲得了利用葡萄糖進行異養生長的能力,但在另外的研究如向團藻[14]和細柱藻[15]中引入該基因卻未能使其發揮異養作用。對此有學者認為對于團藻和細柱藻等,藻類細胞本身可能缺失糖代謝過程的關鍵途徑[16-17]。也有研究認為藻類無法異養生長的主要原因在于不完整的三羧酸循環途徑[18],然而細胞內糖代謝途徑涉及的過程復雜,相關的功能基因也非常繁多,到目前為止有關藻類細胞異養功能缺失的代謝機制仍不清楚。對于雨生紅球藻,缺乏相關的基因組學數據,對其代謝途徑的認知也不甚清楚。特別是迄今未建立起穩定的雨生紅球藻遺傳改造技術[19]。因此很難通過同源重組或基因編輯的方法來實現多基因的引入,獲得雨生紅球藻葡萄糖異養株。相反,如果能夠將具有完全糖同化利用能力的微生物(藻)細胞與雨生紅球藻進行細胞融合雜交,有可能使葡萄糖利用的重要或全部基因得以在融合子中表達,從而獲得可利用葡萄糖的雨生紅球藻表型。

在水生浮游綠藻類群中,存在著能夠高效利用葡萄糖進行快速異養生長的物種[20],其中異養小球藻最為典型。蛋白核小球藻利用葡萄糖異養發酵,其細胞密度可在5 d內達到100 g/L的高密度。雨生紅球藻與小球藻同屬于綠藻門,具有一定的親緣關系,因此本研究擬通過原生質體融合的方式進行雨生紅球藻和小球藻間的種間雜交,并通過限制性的糖異養條件篩選具有糖異養生長能力的融合子細胞,該研究的開展有可能為雨生紅球藻以及其它產業化微藻的遺傳改良與異養代謝應用提供一條新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雨生紅球藻HaematococcuspluvialisSCCAP K-0084、NIES144、SAG34-1b 分別購自于丹麥哥本哈根大學SCCAP藻類與原生動物保藏庫、日本NIES微生物菌種庫和德國SAG藻種保藏庫;小球藻ChlorellakessleriSAG 211-11a、ChlorellapyrenoidosaFACHB29、Chlorellasp. FACHB31 分別購自于德國SAG藻種保藏庫和中國科學院淡水藻種庫(FACHB);藻種通過BG11培養基[21]進行傳代培養;D-葡萄糖、D-果糖、乙酸鈉、丙三醇、D-蘋果酸、丁二酸、α-酮戊二酸和檸檬酸 分析純,國藥;酵母提取物 分析純,OXOID;二氯苯基二甲脲(DCMU)分析純,Sigma-Aldrich;2-脫氧-d-葡萄糖(2DG) 99%試劑純,上海生工;蛋白酶K(40 U/mg)、纖維素酶(500 U/mg)、半纖維素酶(200 U/mg) 分子生物學級,索萊寶;葡萄糖醛酸酶(1 kU/mg) Sigma-Aldrich。

PGX-250C光照培養箱 寧波賽福實驗儀器有限公司;BX53顯微鏡 日本Olympus公司;SW-CJ-2D超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司;HWS-12恒溫水浴 上海一恒科技公司;WD-9405A水平搖床 北京市六一儀器廠

1.2 實驗方法

1.2.1 可利用糖底物的篩選與潮霉素抗性鑒定 基于BG11培養基,在其中添加10 μmol/L光合抑制劑二氯苯基二甲脲(DCMU)抑制光合作用,同時分別添加2 g/L的D-葡萄糖、D-果糖、乙酸鈉、丙三醇、D-蘋果酸、丁二酸、α-酮戊二酸或檸檬酸作為碳源底物,培養基中添加1.5 g/L瓊脂制備固體平板。培養中分別將三種雨生紅球藻和三種小球藻細胞涂布于平板上,(25±1) ℃暗處培養,根據克隆的出現與否判斷底物的可利用性。對于細胞潮霉素抗性比較,也是基于BG11培養基,在其中分別添加不同濃度的潮霉素,添加瓊脂制備固體平板,培養中分別將三種雨生紅球藻和三種小球藻細胞涂布于平板上,(25±1) ℃光照培養,根據克隆生長情況判斷細胞耐受能力。

1.2.2 雨生紅球藻的原生質體制備 雨生紅球藻原生質體制備參考Cheng等[22]的方法。將BG11中培養7～10 d的雨生紅球藻細胞以2×103個/mL的細胞密度接種于BYA培養基中,BYA培養基是在BG11基礎上添加2 g/L的乙酸鈉和2 g/L的酵母提取物,培養溫度為(25±1) ℃,連續光照強度為(50±1) μmol/(m2·s),每天定時搖動3次。3～4 d培養后獲得超過85%的雨生紅球藻游動細胞并用于原生質體制備。原生質體的酶處理采用含有0.06%的蛋白酶K、0.05 mol/L Tris-HCl、0.2 mmol/L CaCl2、0.2 mol/L山梨醇/甘露醇的酶解液(pH7.8)處理雨生紅球藻游動細胞2～3 h。

1.2.3 小球藻的原生質體制備 小球藻原生質體的制備采用Rosen等[23]的方法。2500×g轉速下離心5 min收集培養對數期的小球藻細胞,以2-脫氧-d-葡萄糖(2DG)作為預處理劑,將藻細胞置于含有1%(w/v)Glu/2DG(1∶3)的BG11中,于39 ℃下預處理24 h。預處理后用BG11洗滌藻細胞,最后將藻細胞置于含有4%纖維素酶、4%半纖維素酶、5%葡萄糖醛酸酶、8 mmol/L CaCl2、0.3 mol/L山梨醇/甘露醇的酶解液中,控制細胞密度為2×106～3×106個/mL,于29 ℃黑暗環境下酶解24 h。

1.2.4 原生質體制備率的計算 雨生紅球藻游動細胞滲透敏感性高,其原生質體制備率的計算采用Cheng等[22]的方法,以胞外基質(Extracellular matrix,ECM)的去除來統計原生質體釋放效率。ECM的去除是通過顯微觀察并結合血球計數板統計檢測,每個樣品至少3個平行,每個平行至少有200個細胞被統計和分類。酶解前及酶解后無ECM的細胞比例分別為R0和R1,則ECM去除率(%)=(R1-R0)÷(1-R0)×100。

小球藻原生質體制備效率采用Tjahjono等[24]所述的Triton裂解率統計方法,以0.019% Triton X-100作為原生質體裂解劑。將樣品平均分成2份,一份加入Triton X-100使終濃度為0.019%,另一份加入等體積的PBS緩沖液(含0.3 mol/L山梨醇/甘露醇),30 min后分別用血球計數板統計加入Triton X-100的完整細胞數(X1)及加入PBS緩沖液(含0.3 M山梨醇/甘露醇)的完整細胞數(X2),則Triton裂解率(Lysis rate)=(X2-X1)÷X2×100%。

1.2.5 雨生紅球藻與小球藻原生質體融合 原生質體融合采用PEG融合,參考陳波[25]采用的方法。雨生紅球藻與小球藻的原生質體酶解后用重懸于含0.3 mol/L山梨醇/甘露醇的高滲緩沖液中,分別按細胞個數1∶10、1∶5和1∶1的混合細胞懸液,500×g轉速下離心3 min,傾去上清液,向沉淀中加入1 mL原生質體融合液(40%聚乙二醇6000,添加0.6 mol/L山梨醇/甘露醇和50 mmol/L CaCl2-2H2O),輕輕混勻,于30 ℃水浴保溫30 min后,緩慢加入1 mL原生質體清洗液(pH9.0的50 mmol/L甘氨酸緩沖液,添加0.6 mol/L山梨醇/甘露醇和50 mmol/L CaCl2-2H2O),輕輕混勻,10 min后再加入2 mL清洗液(對照組每次加入同等體積的原生質體培養液)。10 min后再加入2 mL原生質體培養液(BG11培養基添加0.3 mol/L山梨醇/甘露醇),離心洗滌,再用原生質體培養液離心洗滌3次,得到雨生紅球藻與小球藻原生質體融合產物。

1.2.6 融合細胞的篩選 融合細胞在原生質體培養液中經過暗處48 h恢復性培養,在限制性糖異養平板條件進行篩選,篩選培養基BG11為基礎,添加10 μmol/L光合抑制劑二氯苯基二甲脲(DCMU)和4 g/L葡萄糖(glu)去除野生型雨生紅球藻細胞,同時添加10 μg/mL的潮霉素(hyg)抑制小球藻細胞的繁殖,加入1.5 g/L瓊脂以制備固體平板。融合后的細胞經過24 h的恢復性培養后,每103個雨生紅球藻形態細胞被均勻涂布在一個固體平板上,平板置于25 ℃培養3～4周。

1.2.7 融合子在含葡萄糖培養基中生長速率的測定 挑選3株經擴大培養后未產生形態分化的融合子以及另外兩個親本藻株,于BG11+4 g/L Glu的培養基中培養,接種密度控制在103個/mL,于散射光處25 ℃培養10 d,通過細胞計數[22]對比生長差異。

1.3 數據處理

實驗中所有數據在EXCEL中進行記錄與方差計算分析,并在SigmaPlot中作圖。

2 結果與分析

2.1 雨生紅球藻與小球藻的異養生長

DCMU是一種光合抑制劑及光形態建成抑制劑,它能抑制從PSⅡ上的Q向PQ的電子傳遞,研究中使用10 μmol/L的DCMU添加能夠有效地抑制小球藻和雨生紅球藻的光合自養生長。對比了3種小球藻和3種雨生紅球藻基于不同碳源底物的異養生長能力,結果如表1中所示。3種小球藻均能夠利用葡萄糖、果糖和乙酸鈉進行異養生長,相比而言C.kessleriSAG211.11a的異養生長能力更強,同時還可以利用甘油、蘋果酸以及琥珀酸進行異養生長。小球藻是目前報道最多的能夠利用不同碳源底物進行異養生長的真核微藻類群[26],大量的報道也表明雨生紅球藻僅可以利用乙酸鹽進行異養生長[9-10],本研究結果同樣發現3種雨生紅球藻均只能利用乙酸鈉進行異養生長,在其它底物下細胞完全不能分裂和繁殖。此外,本研究還發現H.pluvialisK0084藻株具有較強的潮霉素耐受能力(如圖1),在10 μg/mL潮霉素濃度下H.pluvialisK0084能夠在平板上正常形成藻落,而C.kessleriSAG211.11a的生長則受到明顯抑制,這使得研究中可以通過限制性糖異養條件和潮霉素的添加來分別抑制野生型雨生紅球藻和小球藻的生長,非常適合于融合子的篩選過程。因此,本研究選用H.pluvialisK0084和C.kessleriSAG211.11a進行細胞間的原生質體融合研究。

表1 不同碳源底物下雨生紅球藻和小球藻的異養生長能力Table 1 Heterotrophic growth of Haematococcus and Chlorella species based on different carbon resources

圖1 不同濃度潮霉素對H.pluvialis K0084和C.kessleri SAG211.11a的抑制Fig.1 Inhibition of different concentration of hygromycin on H.pluvialis K0084 and C.kessleri SAG211.11a注:hy10、hy20、hy30分別代表潮霉素濃度10、20、30 μg/mL。

2.2 雨生紅球藻的原生質體制備

有研究曾提出,雨生紅球藻游動細胞不具有纖維素化的細胞壁,原生質體外僅有松散的細胞外基質(extracellular matrix,ECM)結構包裹,因而在低滲透壓條件下極易裂解,因此不能使用傳統的滲透壓裂解來評價原生質體得率,并且提出通過利用ECM去除率來衡量原生質體的制備效率[22,27]。表1的結果顯示,雨生紅球藻游動細胞經過蛋白酶處理后,無ECM細胞比例可以提高到75%以上,ECM去除率平均可達72.11%±3.94%,這表明經過酶處理后超過70%的雨生紅球藻細胞以原生質體形態存在,滿足本研究的需要。

表2 雨生紅球藻原生質體制備效率(%)Table 2 Protoplast preparation rate of H. pluvialis(%)

2.3 小球藻原生質體的制備

小球藻不同于雨生紅球藻,其不存在明顯的細胞分化,而且細胞上有明顯的纖維素化細胞壁包裹,因而小球藻的原生質體制備大多以纖維素酶和半纖維素酶等多糖降解酶為主,此外為了提高原生質體釋放效率,以2-脫氧-d-葡萄糖(2DG)作為預處理劑處理24 h[28]。如表3所示,本研究中酶解處理后Triton裂解率達到42.07%±3.73%,這意味著經過酶處理后僅有40%左右的小球藻細胞形成裸露的原生質體。以往的研究中不同學者對于小球藻原生質體制備情況研究各異,但大部分的原生質體制備率都不高于50%[25,28]。這些研究認為,小球藻細胞壁中存在類似次生細胞壁的結構,該部分在酶解過程中較難降解,尤其是一種孢粉素成分的存在導致原生質體釋放效率不高[29]。雖然在小球藻中原生質制備效率受到目前技術條件的限制，無法進一步提高,但是由于本研究中可以通過添加潮霉素抑制未融合的小球藻細胞生長,因此這一結果仍然可以滿足研究需要。

表3 小球藻原生質體制備效率Table 3 Protoplast preparation rate of C. kessleri

2.4 雨生紅球藻與小球藻原生質體融合

原生質體的融合主要有物理和化學融合兩種方式,以往藻類細胞融合研究中大部分都采用的是PEG介導的化學融合的方式,這種方式操作過程簡單,設備依賴性低,易于操作[25]。在本研究中融合過程首先利用40% PEG處理實現細胞間的聚集,之后再加入高鈣、高pH的融合洗滌液促進原生質體間的融合。由于雨生紅球藻細胞同小球藻間存在明顯的細胞個體大小差異,因而本研究將雨生紅球藻與小球藻分別按1∶1、1∶5和1∶10的細胞個數比例進行混合后,再同時進行細胞間的融合,以獲取最佳的細胞融合與篩選條件。在3種融合條件下,雨生紅球藻周圍都會有小球藻附著,而且均觀察到各種典型的兩兩融合狀態,之間并未存在任何明顯差異。如圖2A中所示,可以觀察到兩種原生質體間彼此靠近,同時未去壁的雨生紅球藻細胞由于細胞壁的障礙,阻止了原生質體的融合;此外,在融合過程中也經常發生多個小球藻原生質體同單個雨生紅球藻原生質體聚集和靠近的現象(圖2B),這時一些互相靠近的原生質體間隔膜(細胞膜)逐漸消失,原生質體逐漸發生融合(圖2C)。因此,本過程完全實現了雨生紅球藻和小球藻間的融合與雜交。

圖2 雨生紅球藻和小球藻間的細胞融合觀察Fig.2 Micrographs of cell fusion between H.pluvialis and C.kessleri注:A～C均為1∶1融合條件的結果。

2.5 糖異養細胞的篩選

以往的原生質體融合研究中,通常通過單細胞顯微操作,將融合細胞分離后再進行表型鑒定與選育,這種方式完全依賴于個人的操作,能夠篩選和鑒定的融合子克隆數量非常有限[25],因此本研究采用限制性糖異養條件進行篩選,針對整合融合后的細胞樣品,選育具有糖異養生長能力的雨生紅球藻融合子克隆。由于雨生紅球藻不能利用葡萄糖進行異養生長,在添加光合作用抑制劑DCMU的含糖培養基中,野生型無法生長,通過這一條件可以篩選出能夠進行糖異養生長的雨生紅球藻融合子細胞,但由于小球藻可以在這一條件下快速生長,這會大大影響篩選效率,為此,在該篩選培養條件下還加入了10 μg/mL的潮霉素抑制小球藻的生長。如圖3所示,經過3～4周的篩選性培養在雨生紅球藻對照平板上,完全沒有任何藻落形成,經過顯微鏡檢觀察,涂布后的細胞完全被裂解,或者仍然保持單細胞未分裂增殖狀態,小球藻對照平板上,僅有個別克隆形成,生長受到潮霉素的抑制。對于1∶1、1∶5和1∶10比例下融合細胞樣品,隨著小球藻比例的提高,更多的克隆在平板上形成。通過顯微鑒定發現兩種不同形態的藻落形成(如圖4),一種是藻落明顯且照片中清晰可見的大部分克隆,經過鑒定完全是小球藻形態細胞;另一種是較小且照片中不清晰或完全肉眼不可見的克隆,但經過顯微觀察確定為正常的雨生紅球藻藻落。通過這種顯微鑒定方式,對各個融合條件與對照下的平板進行了顯微統計,結果如表4所示,在1∶1融合條件下,平板上獲得的藻落大部分為雨生紅球藻類型,僅有個別小球藻藻落形成,隨著融合中小球藻細胞比例的提高,在1∶5與1∶10融合條件下出現越來越多的小球藻形態的藻落,此外,在1∶10的融合比例下,大量的小球藻落形成,完全沒有鑒定到雨生紅球藻形態的糖異養克隆,這可能是由于大量小球藻藻落的形成,吸收和利用了大部分平板營養,限制了雨生紅球藻融合子繼續生長,而如果能通過細胞分選技術在融合后進行融合細胞與小球藻的高效分離,有可能大大地提高融合細胞的篩選效率。

圖3 H.pluvialis與C.kessleri不同融合比例下的平板篩選Fig.3 Screening plates from fusion samples with different cell ratios of H.pluvialis and C.kessleri

圖4 融合子篩選性平板上的兩種克隆形態Fig.4 Two microscopic forms of colonies on the fusant-screening plate注:A：雨生紅球藻形態;B：小球藻形態。

細胞比例(Hp∶Ck)總克隆數H. pluvialis克隆數Chlorella克隆數1∶112.3±1.959.3±1.642.9±0.991∶535.13±9.130.25±0.7134.88±9.371∶1086±25.740±086±25.74

2.6 融合子的培養與鑒定

對于融合條件獲得平板,經過顯微克隆形態鑒定后,選取雨生紅球藻形態的融合子克隆,接種到含有BG11培養基的24孔板中培養,經過一段時間培養后,將正常生長的克隆轉移到50 mL三角瓶中繼續擴大培養后進行鑒定觀察。經過擴大培養后的融合子與野生型親本藻株的細胞形態如圖5所示。從顯微照片可以看到,雨生紅球藻融合子細胞在外觀、大小上與野生型雨生紅球藻類似。另外,還可以觀察到某些融合子培養后,形成了類似小球藻形態的克隆,但是其逐漸開始分化(圖5D),分化出的細胞形態類似小球藻,但比小球藻要大,說明某些融合子在遺傳表型上并不穩定。陳波[25]也曾報道,雨生紅球藻和小球藻的融合子細胞中可能會有形態類似小球藻,但個體較大的細胞。本研究統計了挑選的融合子經擴大培養后遺傳表型的分化情況,在所挑選的72個融合子克隆中,有23個融合子出現了向小球藻分化的情況,其它融合子經兩次以上傳代后遺傳表型仍能夠保持。

圖5 野生型雨生紅球藻(A)、小球藻(B)及融合子細胞(C,D)顯微照片Fig.5 Micrographs of wild-type H. pluvialis(A),Chlorella(B)and fusants(C,D)。

2.7 融合子的糖異養生長

三個融合子(Fusant8、Fusant9、Fusant10)被置于含糖條件下進行培養,它們同雨生紅球藻以及小球藻間的生長差異如圖6所示,三個融合子的生長速率相比于野生型雨生紅球藻有明顯的增強,10 d培養后細胞密度分別達到6.7×104、8.7×104和6.5×104個/mL,明顯高于野生型的2.45×104個/mL,但是相比于小球藻10 d后1.4×106個/mL的細胞密度而言,異養生長能力仍然有限,尚不能滿足高密度培養的需求。目前,細胞雜交育種技術在微藻育種中的應用研究較少,沈繼紅等[30]曾將富含EPA和DHA的自養綠色巴夫藻和生長迅速的異養四鞭藻用細胞融合的方法構建EPA和DHA高產異養藻株,融合藻株雖較親本異養藻株各方面指標大有提高,但相比親本自養藻株仍不夠理想,而且后期遺傳穩定性也不高。江勝滔等[31]在酒酵母與雨生紅球藻的細胞融合子的鑒定過程中認為,融合子在世代延續中可能發生過雙親DNA的互相排斥或單親DNA的丟失。這可能是造成融合子后代無法獲得穩定雜交遺傳表型的主要原因,而如果能夠通過在融合后對融合細胞進行進一步的高強度誘變處理,破除細胞間的核障礙,有可能使原生質體雜交技術在遠緣雜交中獲得更廣泛的應用。

圖6 三個雨生紅球藻融合子及親本藻株在含葡萄糖培養基中的生長Fig.6 Growth curve of H.pluvialis fusants and parental strains cultured in medium with glucose

3 結論

本研究通過PEG介導的原生質體融合技術,實現了雨生紅球藻同小球藻間的細胞雜交,而且基于限制性糖異養條件篩選出具有雨生紅球藻形態融合子克隆,這些融合子細胞獲得了增強的糖代謝能力,但是經過傳代后會出現遺傳表型蛻化以及糖異養生長能力低等問題,尚不能滿足細胞高密度培養的需要。究其原因,應該是由于細胞融合后兩基因組間無法有效實現同源重組所導致的,而如果能將原生質體融合技術同高強度的基因組誘變技術相結合,提高融合后異源基因組間的重組效率,有可能建立更高效的藻種間基因組雜交與選育技術,為雨生紅球藻藻種改良建立更高效的平臺技術與體系。