迷迭香中迷迭香酸、鼠尾草酸和熊果酸的聯合提取

屈亮亮,段凱莉,吳延妮,胡雪萍,薛阿輝,鄧 敏,王文靜,黃學勇

(南昌大學生命科學學院,江西南昌 330031)

迷迭香(RosmarinusofficinalisL.)為唇形科迷迭香屬的常綠小灌木,原產歐洲、北非及地中海沿岸。近年來在我國云南、廣西、海南、湖南、四川、貴州、福建等省區均有種植[1]。迷迭香作為一種天然香料植物,含有多種有效成分,目前生產上提取使用的主要為迷迭香精油和迷迭香天然抗氧化劑[2-4]。迷迭香抗氧化劑的安全性及其在動植物油脂抗氧化方面的突出效果已獲得國際食品界公認,迷迭香提取物已被列入歐盟有機食品添加劑名單[5-7]。迷迭香富含多酚化合物:酚酸類化合物,如迷迭香酸和咖啡酸;二萜酚類化合物,如鼠尾草酸和鼠尾草酚;三萜類化合物，如熊果酸[8]。迷迭香酸和鼠尾草酸作為天然抗氧化劑已經在食品工業投入使用,熊果酸具有良好的抗腫瘤活性,呈具有較低水溶性的五環結構,故在生物利用度方面有所欠缺[9]。

目前針對迷迭香中有效成分的研究報道較多,但未見將迷迭香酸、鼠尾草酸和熊果酸的總得率作為指標進行優化提取的報道。張磊等[10]采用超聲波輔助法提取迷迭香中的鼠尾草酚、鼠尾草酸和熊果酸,得到最佳的提取工藝為:提取溫度80 ℃、乙醇體積分數90%、提取時間45 min、料液比1∶10 (g/mL),總得率為7.09%。許秋雁等[11]采用常壓回流法提取迷迭香中的迷迭香酸和鼠尾草酸,得出最佳提取工藝條件為:乙醇體積分數80%,料液比1∶10 (g/mL),提取時間1 h,迷迭香中兩種有效成分的總得率為4. 73%。梁振益等[12]采用溶劑法對迷迭香中熊果酸進行提取,得到的最佳提取工藝為:料液比1∶20 (g/mL),乙醇體積分數90%,提取時間3 h,熊果酸得率為1.74%。

本文以迷迭香酸、鼠尾草酸和熊果酸的總得率為考察目標,研究同時提取3種物質所用溶劑濃度、料液比和提取時間,得到了使用乙醇溶液提取3種物質的最佳工藝條件,以期為后續迷迭香中有效成分的研究提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干燥的迷迭香葉片 產自河南禹州;迷迭香酸標準品(純度≥97%) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;鼠尾草酸標準品(純度99%) 北京百靈威科技有限公司;熊果酸標準品(純度98%) 北京百靈威科技有限公司;乙腈、甲醇、甲酸 色譜純;乙醇 國產分析純。

Waters e2695型高效液相色譜儀 美國Waters公司;色譜柱:Symmetry C18(4.6×250 mm,5 μm) 美國Waters公司;KQ3200DE型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;TDL-5-A型臺式低速大容量離心機 上海安亭科學儀器廠;FA2204B型電子天平 上海精科天美科學儀器有限公司;Hitech-Master綜合型超純水機 上海和泰儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 醇提物的制備 將迷迭香干葉粉碎,過40目篩,稱取0.2 g粉末樣品溶于一定濃度的乙醇[13-15],浸泡15 min,超聲功率150 W,40 ℃下超聲提取,5000 r/min離心10 min后取上清液,殘渣重復提取1次,合并上清液,旋轉蒸發后甲醇復溶,并用甲醇定容至25 mL。用1 mL注射器吸取提取液,通過0.45 μm有機系濾頭過濾后注入進樣瓶,HPLC自動進樣進行檢測。

1.2.2 HPLC測定提取液中的迷迭香酸、鼠尾草酸和熊果酸含量 色譜柱:Symmetry C18(4.6×250 mm,5 μm);進樣量:10 μL,流速:1 mL/min,柱溫35 ℃。

迷迭香酸檢測條件:波長328 nm,流動相:含0.5%甲酸的水-乙腈(68∶32,V/V);

鼠尾草酸和熊果酸檢測條件:波長210 nm,流動相:含0.5%甲酸的水-甲醇(10∶90,V/V)[16-17]。

標準曲線的繪制:分別精確稱取迷迭香酸、鼠尾草酸和熊果酸標準品5.0 mg,用甲醇配制成1 mg/mL的母液,并梯度稀釋為25、50、100、200、400、800 μg/mL,HPLC測出峰面積,并以質量濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標分別繪制標準曲線[18]。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 乙醇體積分數對得率的影響 在原料顆粒度40目、超聲溫度40 ℃、超聲功率150 W、料液比1∶20 (g/mL)、超聲時間40 min的條件下,考察乙醇體積分數分別為60%、70%、80%、90%、100%時3種物質的得率。

1.2.3.2 料液比對得率的影響 在原料顆粒度40目、超聲溫度40 ℃、超聲功率150 W、乙醇體積分數為90%、超聲時間40 min的條件下,考察料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 (g/mL)時3種物質的得率。

1.2.3.3 超聲時間對得率的影響 在原料顆粒度40目、超聲溫度40 ℃、超聲功率150 W、乙醇體積分數為90%、料液比1∶20 (g/mL)的條件下,考察超聲時間分別為10、20、30、40、50 min時3種物質的得率。

1.2.4 正交試驗設計 以單因素實驗結果為依據,乙醇體積分數、料液比、超聲時間為考察因素[19-22],按L9(33)進行正交試驗,試驗因素水平及試驗設計見表1和表2。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

表2 正交試驗設計及結果Table 2 Orthogonal experimental design and results

1.2.5 迷迭香酸、鼠尾草酸和熊果酸得率的測定 采用高效液相色譜法,根據所測得峰面積由曲線方程算出質量濃度,得到3種物質的得率,進而計算出總得率,公式如下:

總得率(%)=Y1+Y2+Y3

式中:c為物質質量濃度(mg/mL);V為定容后的溶液體積(mL),m為迷迭香干葉質量(mg);Y1、Y2、Y3(%)分別為迷迭香酸、鼠尾草酸和熊果酸的得率。

1.3 數據分析

實驗數據用Excel 2016進行處理,用SPSS 19.0軟件進行正交試驗設計與顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的建立

迷迭香酸、鼠尾草酸和熊果酸的標準曲線如圖1所示，迷迭香酸曲線方程為:Y=28874X-131123,R2=0.9979;鼠尾草酸曲線方程為:Y=28387X+1×106,R2=0.9967;熊果酸曲線方程為:Y=3992.6X+92240,R2=0.9986;式中:X為物質質量濃度(μg/mL),Y為峰面積。

圖1 迷迭香酸、鼠尾草酸和熊果酸的標準曲線Fig.1 Standard curves of rosmarinic acid, carnosic acid and ursolic acid

2.2 3種成分的HPLC分析

分析迷迭香酸的波長為328 nm,保留時間為4.40 min;由于熊果酸的紫外吸收非常弱,為了減少基線漂移,并且使吸光度盡可能高,減小分析誤差,波長選擇210 nm,保留時間為10.86 min;鼠尾草酸在210 nm下的紫外吸收較強,并且可以與其他物質較好分離,與熊果酸在同一色譜條件下進行檢測,保留時間為5.84 min。標準品及醇提物的色譜圖見圖2、圖3。

圖2 3種標準品在兩種波長下的HPLC譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of rosmarinic acid,carnosic acid and ursolic acid under two wavelength conditions注:(a):328 nm;(b):210 nm。

圖3 迷迭香醇提物在兩種波長下的HPLC譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of rosemary ethanol extract under two wavelength conditions注:(a):328 nm;(b):210 nm。

2.3 單因素實驗結果

2.3.1 乙醇體積分數對總得率的影響 如圖4所示,隨著乙醇體積分數的增加,三種物質的總得率逐漸提高;當乙醇體積分數為90%時總得率達到最大,之后隨著乙醇體積分數的增加,總得率有所下降。當乙醇體積分數達到60%后迷迭香酸得率開始有所下降,這是因為乙醇對細胞的穿透能力較強,在短時間內即可達到溶解平衡,但是當乙醇體積分數高于60%時,一些醇溶性雜質、色素等成分溶出量增加,這些成分與迷迭香酸競爭結合,從而導致迷迭香酸得率下降[23]。鼠尾草酸和熊果酸為脂溶性物質,在乙醇中有較好的溶解度,隨著乙醇體積分數的增加得率逐漸增加。綜合考慮各個物質的得率之后,本文選擇體積分數為90%的乙醇溶液作為最適宜條件。

圖4 乙醇體積分數對3種物質得率的影響Fig.4 Effects of ethanol concentration on the extraction yield

2.3.2 料液比對得率的影響 如圖5所示,隨著乙醇溶液體積的增加,總得率在料液比為1∶20 (g/mL)時達到最大,之后趨于平緩。這可能是因為提取液用量小時,溶液的黏度較大,分子擴散速度低,物質得率小。隨著溶劑的增加,原料與溶劑接觸的機會也增加,因而3種成分的得率隨溶劑的增加呈總體上升趨勢。之后鼠尾草酸和熊果酸得率變化幅度不大,說明物質已提取充分,細胞內和溶液中的物質濃度達到動態平衡,物質不再溶出;迷迭香酸含量稍有降低,可能是隨著溶劑的增加其他物質也大量溶出,反而降低了得率,而且溶劑用量太多會對后面的純化工作帶來不利影響,從節約原料的角度考慮,本文選擇料液比1∶20 (g/mL)作為最適宜條件。

圖5 料液比對3種物質得率的影響Fig.5 Effects of solid-liquid ratio on the extraction yield

2.3.3 超聲時間對得率的影響 如圖6所示,隨著超聲提取時間的增加,3種物質的得率呈現先增大后減小的趨勢,至40 min時得率最大。

圖6 超聲時間對3種物質得率的影響Fig.6 Effects of ultrasonic time on the extraction yield

當目標成分的濃度在原料細胞內外未達平衡之前,隨著提取時間延長,總得率逐漸提高。超聲提取時間超過40 min之后各物質得率有所下降,這是由于隨著超聲時間的延長,導致目標成分結構改變,溫度和光照也會導致迷迭香中抗氧化物質降解為其他成分,例如鼠尾草酸和鼠尾草酚之間的轉化[8]。綜合考慮各個物質的得率之后,本文選擇40 min作為最適宜條件。

2.4 正交優化試驗結果

2.4.1 正交優化提取工藝及方差分析 由表2可知,對總得率影響因素大小分別為乙醇體積分數>超聲時間>料液比。得到同時提取迷迭香中迷迭香酸、鼠尾草酸和熊果酸的最佳工藝條件為A3B2C1,即:乙醇體積分數100%、料液比1∶20 (g/mL)、提取時間30 min。

由表3可知,校正模型具有顯著性,乙醇體積分數對得率的影響p值小于0.01,表明乙醇體積分數對得率影響極顯著,超聲時間和料液比對得率的影響p值均小于0.05,表明這兩個因素對得率影響較顯著[24-25]。因此,上述3個影響因素可作為影響得率的首要考慮因素,且該提取方法可用于迷迭香中3種物質的聯合提取。

表3 正交試驗的方差分析Table 3 Analysis of variance of the experimental results of orthogonal array design

2.4.2 驗證試驗結果 通過試驗模型分析,得出迷迭香中迷迭香酸、鼠尾草酸和熊果酸的最佳提取工藝為乙醇體積分數100%、料液比1∶20 (g/mL)、超聲時間30 min。按照上述最優條件,重復3次實驗,3種物質總得率分別為6.09%、6.13%、6.22%,RSD為1.08%,平均總得率為6.15%。

3 結論

本實驗采用超聲輔助溶劑法對迷迭香中迷迭香酸、鼠尾草酸和熊果酸的提取條件進行優化,設置兩個等度色譜條件檢測迷迭香醇提液中3種有效物質,流動相組成簡單,出峰時間短,可獲得峰形和分離度較好的色譜圖,有效提高了分析效率。考察了影響三種物質提取得率的因素的主次順序為乙醇體積分數>超聲時間>料液比,得到最佳提取工藝:乙醇體積分數100%、料液比1∶20 (g/mL)、超聲時間30 min,在該條件下3種物質總得率為6.15%。該工藝避免了以單一種成分作為檢測指標時所產生的單一成分提取率高,而其它成分損失嚴重的現象,有利于提高迷迭香藥材的利用效率。