霉變玉米氣體傳感器陣列快速檢測(cè)

2019-06-24 08:05:04趙天霞劉興泉

食品工業(yè)科技 2019年9期

黃怡,沈飛,*,趙天霞,方勇,劉琴,劉興泉

(1.南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇南京 210023; 2.江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇南京 210023; 3.浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院,浙江杭州 311300)

玉米是我國(guó)三大主糧之一,但玉米籽粒胚乳大,且吸濕性強(qiáng),易受微生物侵染,從而導(dǎo)致玉米發(fā)生霉變[1-2]。玉米霉變不僅降低其食用品質(zhì),還會(huì)產(chǎn)生黃曲霉毒素、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮等真菌毒素,嚴(yán)重威脅人畜健康[3]。快速判斷玉米的霉變程度是控制其危害的前提。目前,玉米霉變的檢測(cè)方法主要有菌落計(jì)數(shù)法、高效液相色譜法[4]、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)[5]、薄層色譜法[6]等。雖然這些檢測(cè)方法準(zhǔn)確度和可靠性較高,但存在檢測(cè)耗時(shí),儀器費(fèi)用高,需要專(zhuān)門(mén)技術(shù)人員等缺點(diǎn)。因此,發(fā)展快速、準(zhǔn)確的霉變檢測(cè)手段十分必要。

近年來(lái),電子鼻作為一種基于特征氣味信息的快速分析方法在農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)無(wú)損檢測(cè)中發(fā)展迅速[7]。電子鼻通常由非特定的氣體傳感器構(gòu)成,它們與不同的揮發(fā)性分子相互作用并輸出電子信號(hào),并通過(guò)模式識(shí)別系統(tǒng)識(shí)別和量化氣味,已廣泛用于水果[8-9]、肉類(lèi)[10-11]、食用油[12-13]、酒[14-15]等食品的品質(zhì)檢測(cè)中。谷物霉變過(guò)程由于微生物代謝會(huì)產(chǎn)生醇類(lèi)、酮類(lèi)、醛類(lèi)、酯類(lèi)等多種揮發(fā)性化合物,因此可以利用其特征氣味信息對(duì)其霉變狀態(tài)進(jìn)行判別[16]。Yin等利用電子鼻對(duì)不同霉變程度玉米樣品進(jìn)行檢測(cè),分別采用單特征表示模式(SFRM)和多特征表示模式(MFRM)來(lái)優(yōu)化傳感器信號(hào),并建立了Fisher判別分析(FDA)模型,對(duì)霉變樣品的識(shí)別率達(dá)97%[17]。Cheli等同樣利用電子鼻檢測(cè)玉米黃曲霉毒素污染情況,以酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)測(cè)定的黃曲霉毒素含量作為參考值,成功實(shí)現(xiàn)了污染樣品和未污染樣品的快速識(shí)別[18]。

因此,本研究擬在目前的研究基礎(chǔ)上,以受不同種類(lèi)有害霉菌侵染的玉米樣品為研究對(duì)象,獲取不同儲(chǔ)藏天數(shù)(0、6、9、12和15 d)玉米樣品的電子鼻響應(yīng)信號(hào),結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)手段建立玉米霉變程度的快速識(shí)別方法,并定量預(yù)測(cè)玉米菌落總數(shù)水平,以探索電子鼻技術(shù)用于霉變玉米快速檢測(cè)的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

2017年新收獲玉米樣品(蘇玉20) 經(jīng)南京航空航天大學(xué)輻照中心Co-60輻照(劑量:12 kGy)滅菌后裝入無(wú)菌塑料密封袋,4 ℃冷藏備用;5種玉米中常見(jiàn)有害霉菌:白曲霉(A.candidus)182448、層出鐮刀菌(F.proliferatum)195647、黑曲霉(A.niger)186380、寄生曲霉(A.parasiticus)3.3950和赭曲霉(A.ochraceus)3.3486 中國(guó)北京北納創(chuàng)聯(lián)研究院；馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基、孟加拉紅瓊脂(rose bengal agar)培養(yǎng)基青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

Fox 3000型電子鼻法國(guó)Alpha MOS公司;RXD-268D人工氣候箱寧波東南儀器有限公司;GNP-9160型隔水式恒溫培養(yǎng)箱上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司;TP-214分析天平丹佛儀器(北京)有限公司;無(wú)菌均質(zhì)器無(wú)錫沃信儀器制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 霉菌孢子懸浮液制備在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基分別接種以上5種霉菌,置于培養(yǎng)箱(28 ℃和85%相對(duì)濕度(relative humidity,RH))內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng),待培養(yǎng)基表面產(chǎn)生大量霉菌孢子,用無(wú)菌水多次沖洗培養(yǎng)基表面霉菌孢子,收集到的孢子懸浮液置于100 mL錐形瓶中保存,依據(jù)GB/T 4789.2-2016平板計(jì)數(shù)法[19]測(cè)定5種霉菌孢子懸浮液濃度,并將懸浮液孢子濃度用無(wú)菌水調(diào)節(jié)至約1×105CFU/mL,4 ℃冷藏備用。

1.2.2 玉米樣品霉菌接種每份稱取約100 g的滅菌玉米樣品共270份,將其隨機(jī)分成6組,每組45份。玉米霉菌接種步驟為:將平衡至室溫的玉米樣品放置于滅菌塑料盒(規(guī)格:115 mm×115 mm×65 mm,且上方有開(kāi)孔)中,每份樣品表面接種1 mL孢子懸浮液并充分?jǐn)嚢杈鶆?每種霉菌各接種45個(gè)樣品(5×45=225份)。剩余空白對(duì)照組45份樣品中加入1 mL無(wú)菌水?dāng)嚢杈鶆颉Ｒ陨喜襟E均在無(wú)菌環(huán)境下操作,將接種完的樣品放置在6個(gè)不同的人工氣候箱(28 ℃和85% RH)中儲(chǔ)藏15 d以加速霉變。樣品從接種霉菌起,選取儲(chǔ)藏第0、6、9、12和15 d,從對(duì)照組和五種霉菌侵染玉米樣品中各隨機(jī)選取9份,每次取樣共計(jì)45份,分析前樣品均放于4 ℃冷藏。

1.2.3 電子鼻檢測(cè) 采用電子鼻檢測(cè)玉米樣品揮發(fā)性氣味信息。將冷藏的樣品置于室溫下平衡2 h直至室溫。每份樣品稱取5.0 g,置于20 mL頂空瓶中,進(jìn)行電子鼻檢測(cè)。參數(shù)條件如下:采用頂空自動(dòng)進(jìn)樣方式,平衡時(shí)間和溫度分別設(shè)定為120 s和60 ℃;檢測(cè)時(shí)間為60 s;采樣體積、速度和頻次分別設(shè)定為1 mL、1 mL/s和1次/s;載氣流速為150 mL/min。樣品重復(fù)測(cè)定3次,取傳感器響應(yīng)信號(hào)最大特征值的平均值進(jìn)行分析。電子鼻信息采集完畢后,對(duì)所用樣品參照GB/T 4789.2-2016平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行玉米菌落總數(shù)的測(cè)定,將所得結(jié)果取對(duì)數(shù),以便于后續(xù)建模分析。其中:傳感器LY2/LG:對(duì)氯,氧氮化物和氧化分子敏感;LY2/G:對(duì)胺、氨、醇和酮敏感;LY2/AA:對(duì)氨和酮敏感;LY2/GH:對(duì)胺和氨敏感;LY2/gCTL:對(duì)硫化氫敏感;LY2/gCT:對(duì)丙烷、丁烷和乙醇敏感;T30/1:對(duì)有機(jī)溶劑和輕質(zhì)極性分子敏感;P10/1:對(duì)碳?xì)浠衔锩舾?P10/2:對(duì)甲烷、丙烷和脂肪族非極性分子敏感;P40/1:對(duì)氟利昂和氧化分子敏感;T70/2:對(duì)醇蒸汽敏感;PA/2,對(duì)氮化合物敏感[20]。

1.3 數(shù)據(jù)處理與模型構(gòu)建

采用MATLAB 2015a軟件(美國(guó)Mathworks公司)對(duì)玉米樣品的電子鼻響應(yīng)信號(hào)進(jìn)行分析和建模。首先,使用Autoscale 方法對(duì)信號(hào)進(jìn)行預(yù)處理;再通過(guò)主成分分析(principal component analysis,PCA)和線性判別分析(liner discriminant analysis,LDA)[21]來(lái)判別玉米樣品的霉變程度。最后,運(yùn)用偏最小二乘回歸(partial least squares regression,PLSR)[22]定量預(yù)測(cè)玉米樣品中的菌落總數(shù)水平。評(píng)估PLSR 模型性能的指標(biāo)有:模型決定系數(shù)(correlation coefficient of determination,R2)、建模和預(yù)測(cè)均方根誤差(root mean squared error of calibration and prediction,RMSEC/RMSEP)交互驗(yàn)證均方根誤差(root mean squared error of cross validation,RMSECV)、和相對(duì)分析偏差(residual predictive deviation,RPD)等[23]。模型建立時(shí),隨機(jī)選取2/3的樣品用于構(gòu)建模型,剩余1/3樣品用于模型性能驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米菌落總數(shù)與霉變程度分析

未接種和接種5種不同霉菌的玉米樣品在儲(chǔ)藏期間菌落總數(shù)的變化趨勢(shì)如圖1所示。參考前人研究,根據(jù)菌落總數(shù)高低將玉米樣品分為未霉變(<3.0 lg CFU/g)、霉變(3.0～7.0 lg CFU/g)和嚴(yán)重霉變(>7.0 lg CFU/g)3類(lèi)[24]。觀察可知,接種霉菌樣品的菌落總數(shù)隨著儲(chǔ)藏天數(shù)的增加而增加,表明樣品霉變程度逐漸加深。不同霉菌的增長(zhǎng)速度總體差異不大,寄生曲霉3.3950繁殖速度相對(duì)較慢。白曲霉182448、層出鐮刀菌195647等四種霉菌接種樣品在第12 d時(shí)菌落總數(shù)均已大于7.0 lg CFU/g,而寄生曲霉3.3950樣品第15 d才達(dá)到7.0 lg CFU/g。未接種霉菌樣品經(jīng)過(guò)輻照滅菌后無(wú)法與周?chē)h(huán)境的完全隔離,其霉菌總數(shù)因外界環(huán)境影響也出現(xiàn)緩慢增長(zhǎng),第9 d時(shí)樣品菌落總數(shù)仍小于3.0 lg CFU/g;到第12 d時(shí)才處于霉變狀態(tài)(3.43 lg CFU/g),但仍低于同一儲(chǔ)藏時(shí)間其他接種霉菌的樣品。綜上,不同霉菌侵染樣品的菌落總數(shù)整體呈上升趨勢(shì),表明霉菌代謝活動(dòng)日趨旺盛,樣品霉變程度不斷加深。

圖1 儲(chǔ)藏期間未接種和接種5種不同霉菌玉米樣品的菌落總數(shù)變化趨勢(shì)圖Fig.1 Colony count of control maize samples and samples infected by 5 different fungal species during storage

2.2 玉米電子鼻信號(hào)分析

圖2a和2b分別為第9 d時(shí)受不同霉菌侵染的玉米樣品及受層出鐮刀菌195647侵染樣品在不同儲(chǔ)藏時(shí)間的信號(hào)雷達(dá)圖。觀察圖2a可知,傳感器 PA/2、T70/2、P40/1、T30/1對(duì)于受不同霉菌侵染的玉米產(chǎn)生的揮發(fā)性成分較為敏感,而LY2/LG、LY2/gCT等較不敏感。從雷達(dá)圖的變化趨勢(shì)來(lái)看,感染不同霉菌的玉米樣品的變化趨勢(shì)大體相似,但也存在一定差異。由圖2b可知,隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的增加,不同傳感器也呈現(xiàn)一定的變化趨勢(shì)。觀察可知,隨著霉變程度加深,T30/1、T70/2、PA/2、P10/1等代表碳水化合物、芳香族化合物、氮化合物類(lèi)的物質(zhì)響應(yīng)信號(hào)逐步減弱,而代表醇、酮類(lèi)物質(zhì)的LY2/G、LY2/AA、LY2/GH的響應(yīng)信號(hào)逐漸增強(qiáng)。結(jié)果表明霉菌在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中會(huì)消耗玉米中的碳水化合物和蛋白質(zhì)等有機(jī)物質(zhì),生成醇、酮等次級(jí)產(chǎn)物。這些物質(zhì)在霉菌的代謝過(guò)程中產(chǎn)生,從而導(dǎo)致不同電子鼻傳感器的信號(hào)發(fā)生不一致變化[20]。

圖2 第9 d感染不同霉菌玉米樣品(a)和感染層出鐮刀菌195647玉米樣品在不同儲(chǔ)藏天數(shù)(b)的電子鼻信號(hào)雷達(dá)圖Fig.2 Radar plot of E-nose response signals of various fungal contaminated maize samples after stored for 9 days(a) and maize samples contaminated with F. proliferatum 195647 strain at different storage days(b)

2.3 主成分分析

依據(jù)樣品菌落總數(shù)水平,將其劃分為未霉變、霉變和嚴(yán)重霉變?nèi)齻€(gè)類(lèi)別。其主成分分析結(jié)果如圖3所示。其中,五種不同霉菌侵染玉米樣品的主成分PC1和PC3的累積方差貢獻(xiàn)率為97.94%～99.62%,全部樣品的主成分PC1和PC3的累積方差貢獻(xiàn)率為93.62%。一般而言,PC1和PC2組合所占方差比例最大,也應(yīng)用的最多。但對(duì)本研究所得到的樣品進(jìn)行聚類(lèi)趨勢(shì)分析時(shí)發(fā)現(xiàn),PC1和PC3的組合結(jié)果要略優(yōu)于PC1和PC2,依據(jù)主成分組合的選取以獲得較佳的樣品分類(lèi)效果為準(zhǔn)則,因此在文中呈現(xiàn)了PC1和PC3主成分組合的分析結(jié)果。在一些文獻(xiàn)中,作者同樣呈現(xiàn)了PC1和PC3組合的分析結(jié)果[25]。觀察可得,五種不同霉菌侵染玉米樣品的得分圖區(qū)分程度良好,未出現(xiàn)大面積重疊。全部玉米樣品在得分圖上的不同霉變程度分布區(qū)域出現(xiàn)部分重疊,嚴(yán)重霉變樣品與未霉變和霉變樣品區(qū)分度較好。未霉變和霉變樣品重疊區(qū)域較多,這可能是因?yàn)榈?2、15 d時(shí)未接種霉菌樣品的霉變程度較低,與未霉變樣品出現(xiàn)重疊。結(jié)果表明,隨著霉菌進(jìn)行繁殖和代謝,導(dǎo)致玉米樣品的揮發(fā)性化合物發(fā)生變化,為電子鼻技術(shù)判別玉米霉變程度提供了基礎(chǔ)。

2.4 不同霉變程度(儲(chǔ)藏階段)玉米樣品LDA判別結(jié)果

如上所述,將玉米樣品依據(jù)霉變程度劃分為3類(lèi),表1為基于電子鼻氣體傳感器陣列信號(hào)值的不同霉變程度玉米樣品LDA判別分析模型。觀察可知,LDA模型可以較好區(qū)分不同霉變程度的受單一霉菌侵染的玉米樣品,其建模集準(zhǔn)確率除了寄生曲霉3.3950(96.7%)外均為100%,預(yù)測(cè)集準(zhǔn)確率均在93.3%以上。考慮到單一霉菌侵染樣品建模時(shí)樣本量較小(45個(gè)),因此將未接種和接種不同霉菌的全部270個(gè)樣品進(jìn)行綜合LDA建模,結(jié)果顯示其建模集準(zhǔn)確率為81.1%,預(yù)測(cè)集正確率為76.7%。由于樣品接種不同霉菌可能會(huì)產(chǎn)生不同的揮發(fā)性化合物,導(dǎo)致整體模型正確率降低,但正確率仍接近80%,模型具有一定定性分析的應(yīng)用潛力。表明隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的增加,玉米中的碳水化合物、脂肪等被霉菌消耗,產(chǎn)生大量揮發(fā)性成分,導(dǎo)致電子鼻響應(yīng)信號(hào)值產(chǎn)生較大差異,為電子鼻判別玉米霉變提供了基礎(chǔ)。